徐曉燕 閻昭 王雨萌 孟昭婷 陳金良 王青山 林麗 蘇雨棟 丁少峰 朱琳 陳鵬

肺癌是我國及世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤［1］，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%～85%。以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR－TKIs）為代表的靶向藥物是晚期NSCLC的重要治療方式，EGFR突變是EGFR-TKIs治療的重要靶點(diǎn)和關(guān)鍵性預(yù)測標(biāo)志物。肺癌晚期患者居多，手術(shù)機(jī)會少，突變的組織受檢率低。血液中循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）可以反映腫瘤原發(fā)部位的基因改變［2-4］，利用cfDNA進(jìn)行EGFR突變檢測具有簡便、快捷、微創(chuàng)等獨(dú)特優(yōu)勢，加之cfDNA半衰期短［5］，實(shí)時(shí)反映腫瘤的突變狀態(tài)，使動態(tài)監(jiān)測成為可能。目前對于cfDNA的研究以及指導(dǎo)臨床的數(shù)據(jù)并不多，cfDNA的檢測方法尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。焦磷酸化激活聚合反應(yīng)（pyrophosphorolysis-activated polymerization，PAP）是一種原創(chuàng)性核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過封閉性引物定向串聯(lián)焦磷酸化反應(yīng)和聚合反應(yīng)而具有超高靈敏度和特異度［6］。本研究主要探討PAP動態(tài)監(jiān)測血漿cfDNA在進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌患者治療中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2016年3月至2017年6月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院就診的進(jìn)展期NSCLC患者85例，其中男性47例（55.3%），女性38例（44.7%），年齡32～80歲，中位年齡62歲。ⅢA期4例（4.7%），ⅢB期4例（4.7%），Ⅳ期77例（90.6%）。腺癌78例（91.8%），腺鱗癌3例（3.4%），大細(xì)胞癌2例（2.4%），肉瘤樣癌2例（2.4%）。NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生部《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》。對85例患者，進(jìn)行血漿cfDNA EGFR突變檢測，對突變陽性的38例患者進(jìn)行連續(xù)血漿檢測（每2個(gè)月1次）。本研究通過天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批，所有受試者入組前均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本 常規(guī)方法靜脈采集10 mL全血樣本，于2 h內(nèi)使用人血漿游離核酸提取試劑盒（天津精耐特基因生物技術(shù)有限公司）分離提取cfDNA，使用基于PAP核酸擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光PCR法的EGFR基因突變檢測試劑盒（天津精耐特基因生物技術(shù)有限公司）對EGFR的特定變異類型19Del、L858R和T790M進(jìn)行檢測。首次檢測同時(shí)使用首個(gè)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)用于血液EGFR特定突變檢測的基于擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplication refractory mutation system，ARMS）實(shí)時(shí)熒光PCR法的EGFR基因突變檢測試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司）對比驗(yàn)證。血漿樣本采集、運(yùn)送、保存、檢測標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)CFDA制定的《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》及試劑盒說明書要求。

1.2.2 收集與隨訪 患者臨床病理特征及組織基因突變信息均來自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病歷與檢測報(bào)告，組織EGFR突變檢測方法為傳統(tǒng)Sanger測序法。采用面訪、電話及病歷查閱方式對患者進(jìn)行隨訪，患者療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)RECIST 1.1版。隨訪截至2017年7月30日，隨訪時(shí)間4～12個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為8個(gè)月，隨訪率100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。血漿與組織樣本基因突變檢測結(jié)果及兩種檢測方法對血漿基因突變檢測結(jié)果的差異性分析采用McNemar檢驗(yàn)，組間率的比較及臨床病理特征的分析采用χ2檢驗(yàn)，在樣本數(shù)量過少時(shí)使用Fisher test檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血漿與組織EGFR突變檢測結(jié)果比較

對其中已有組織檢測結(jié)果的42例進(jìn)行血漿與組織EGFR突變狀況比較，一致性69.0%（29/42），靈敏度47.4%（9/19），特異度87.0%（20/23），陽性預(yù)測值75.0%（9/12），陰性預(yù)測值66.7%（20/30）；McNemar檢驗(yàn)認(rèn)為兩樣本檢測結(jié)果一致（P=0.092）。血漿與組織EGFR突變狀況比較見表1。

表1 血漿與組織EGFR突變狀況比較 （n=42）

2.2 PAP與ARMS-PCR檢測血漿EGFR突變狀況比較

對85例PAP與ARMS-PCR檢測血漿EGFR突變結(jié)果比較，一致性81.2%（69/85），靈敏度56%（14/25），特異度91.7%（55/60），陽性預(yù)測值73.7%（14/19），陰性預(yù)測值83.3%（55/66）；McNemar檢驗(yàn)認(rèn)為兩種方法檢測結(jié)果一致（P=0.210）。PAP與ARMS PCR檢測血漿EGFR突變狀況的一致性見表2。

表2 PAP與ARMS-PCR檢測血漿EGFR突變狀況的一致性（n=85）

2.3 血漿EGFR突變狀況與臨床病理特征的關(guān)系

85例患者中EGFR突變狀況，與年齡、吸煙情況、腫瘤家族史、體力狀態(tài)評分、病理類型及疾病分期無顯著相關(guān)性，僅與性別相關(guān)。血漿EGFR突變發(fā)生率女性較男性高［65.0%（13/20）vs.75.0%（7/20），P＜0.05］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿EGFR突變狀況與臨床病理特征的關(guān)系見表3。

2.4 血漿EGFR突變動態(tài)監(jiān)測與臨床診治的關(guān)系

對組織或血漿EGFR突變陽性的38例患者進(jìn)行每2個(gè)月1次外周血基因突變動態(tài)檢測，共得到113份不同時(shí)期血漿樣本，同前次血漿EGFR突變狀況比較，動態(tài)監(jiān)測結(jié)果為突變型（突變型→突變型，野生型→突變型）或野生型（突變型→野生型，野生型→野生型）；收集相應(yīng)時(shí)間范圍臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，突變變化情況與患者TNM分期（P=0.179）、治療方法（P=0.885）無關(guān)；與疾病進(jìn)展情況（P＜0.001）有關(guān)。疾病進(jìn)展時(shí)血漿檢測結(jié)果突變型62.5%（15/24），疾病穩(wěn)定或緩解時(shí)血漿檢測結(jié)果突變型21.3%（19/89），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿EGFR突變動態(tài)監(jiān)測與臨床診治的關(guān)系見表4。

表3 血漿EGFR突變狀況與臨床病理特征的關(guān)系 （n=85）

表4 血漿EGFR突變動態(tài)監(jiān)測與診治的關(guān)系

3 討論

cfDNA是血液中被降解的DNA片段，其中來源于腫瘤細(xì)胞的被稱作循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。cfDNA反映原發(fā)或轉(zhuǎn)移部位腫瘤的基因變化情況，被認(rèn)為可代替組織標(biāo)本進(jìn)行突變檢測。在EGFR基因突變檢測中，如果組織標(biāo)本不足或難以獲得，血液是合適的替代生物材料［7］。簡便、快捷、微創(chuàng)的非侵入性獲得方式，以及在術(shù)后患者、晚期患者、EGFR-TKIs治療患者的基因檢測方面克服的術(shù)后再活檢組織不足、腫瘤異質(zhì)性、重復(fù)多次等問題，使血液檢測表現(xiàn)出組織檢測不可比擬的優(yōu)勢。

目前尚缺乏cfDNA標(biāo)本采集處理和分析檢測的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。普遍認(rèn)為需使用EDTA抗凝管采血，保證采血到實(shí)驗(yàn)室處理間隔時(shí)間在4 h以內(nèi)，血漿檢測優(yōu)于血清［8］。Wang等［9］認(rèn)為ctDNA的釋放可能存在時(shí)間特異性，但同一天不同時(shí)間點(diǎn)采血對基因檢測結(jié)果沒有影響。本研究采用EDTA抗凝管，受試者清晨采血，血液采集到實(shí)驗(yàn)室處理間隔時(shí)間在2 h以內(nèi)。分離血漿標(biāo)本提取cfDNA，采用PAP檢測突變。焦磷酸化反應(yīng)是脫氧核糖核酸聚合反應(yīng)的逆反應(yīng)，3'末端阻斷性引物（封閉性引物）因帶有3'末端非延伸性核苷酸（3'末端阻斷劑）不能被直接延伸，在焦磷酸化反應(yīng)去除阻斷劑后被聚合酶延伸，PAP定向串連焦磷酸化反應(yīng)和聚合反應(yīng)，具有很高的靈敏度和特異度，能從摻雜的十億個(gè)幾乎完全相同的核酸分子中特異地?cái)U(kuò)增出一個(gè)拷貝的核酸分子，這種水平的選擇性比現(xiàn)有的PCR技術(shù)高出一百萬倍以上［6］。

PAP對血漿cfDNA的檢測結(jié)果，與組織檢測結(jié)果及ARMS-PCR血漿檢測結(jié)果比較均無顯著性差異，提示PAP可以用于檢測血漿cfDNA突變。血漿與組織EGFR突變檢測結(jié)果存在一致性［10-11］，Reck等［12］的血漿和組織EGFR突變檢測，一致性為89%，敏感度46%，特異度97%，陽性預(yù)測值78%，陰性預(yù)測值90%。本研究數(shù)據(jù)較之偏低，42例中存在13例血漿和組織檢測結(jié)果不符，可能與采樣間隔時(shí)間較長而受到腫瘤異質(zhì)性影響有關(guān)，13例患者組織檢測標(biāo)本均為確診時(shí)手術(shù)標(biāo)本或活檢組織，血漿樣本采集時(shí)間則在化療1個(gè)周期后或服用EGFR-TKIs后。腫瘤存在轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶之間的空間特異性，不同階段不同疾病狀態(tài)的時(shí)間特異性，cfDNA的動態(tài)檢測被認(rèn)為可以克服異質(zhì)性難題，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測、早期發(fā)現(xiàn)獲得性耐藥等［13］。PAP與ARMS-PCR均可被應(yīng)用于cfDNA的動態(tài)檢測，但PAP采用特殊封閉性引物產(chǎn)生的靈敏度和特異性較ARMS-PCR更高，且價(jià)格更為低廉，對于需要進(jìn)行多次血漿檢測的患者可能更為適用。

目前普遍認(rèn)為EGFR突變的優(yōu)勢人群是亞裔、年輕、女性、不吸煙、腺癌患者［14］。本研究檢測血漿EGFR突變狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)突變發(fā)生率僅與性別相關(guān)。差異可能源于檢測標(biāo)本的不同，即組織與血漿突變的優(yōu)勢人群可能有所差異。Wang等［15］研究發(fā)現(xiàn)對于二線或多線使用靶向治療者，實(shí)時(shí)血漿檢測突變陽性，不考慮組織檢測結(jié)果（B+/T-和B+/T+）者，較血漿檢測陰性者（B-/T+）PFS長（P=0.044）。提示二線或多線接受靶向治療者，血檢具有重要價(jià)值，尤其是對于組織EGFR突變的非優(yōu)勢人群。

對于38例患者cfDNA動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，突變變化情況與患者TNM分期及治療方法無關(guān)，與疾病進(jìn)展情況有關(guān)。cfDNA主要來自腫瘤細(xì)胞的壞死和凋亡，分期越晚、腫瘤內(nèi)EGFR突變負(fù)荷越大，cfDNA含量越多，血漿基因檢測越容易得到陽性結(jié)果；但研究也證實(shí)腫瘤內(nèi)EGFR突變負(fù)荷越大，患者對EGFR-TKIs治療效果越好［16］。本研究發(fā)現(xiàn)治療效果較好即疾病穩(wěn)定時(shí)，血漿突變檢出率較低，認(rèn)為治療前血檢突變情況可能會與疾病分期相關(guān)，但治療過程中實(shí)時(shí)血漿檢測突變情況與分期無關(guān)。

研究結(jié)果顯示血漿基因突變變化情況與治療手段本身無顯著相關(guān)性，而與療效相關(guān)。觀察到9例血漿突變陽性的患者在接受化療后突變消失，這基于疾病緩解或穩(wěn)定，因?yàn)榧膊∵M(jìn)展時(shí)突變又再次出現(xiàn)。Zhang等［17］也曾對治療前后患者血漿基因突變狀態(tài)比較，發(fā)現(xiàn)突變情況不受化療影響（P＞0.05），但受靶向治療影響（P＜0.05）。Guo等［18］對早期患者手術(shù)前后cfDNA檢測對比發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后cfDNA水平較之前增高，但突變頻率降低，認(rèn)為手術(shù)傷口導(dǎo)致了正常細(xì)胞過多釋放cfDNA，但突變頻率不受cfDNA總量的影響。本研究中治療方式為手術(shù)者為術(shù)后復(fù)發(fā)行血漿基因檢測，考慮存在疾病復(fù)發(fā)腫瘤負(fù)荷增加因素，未得到手術(shù)后突變檢出率低的結(jié)果。若突變狀況與治療方法無關(guān)，僅與疾病進(jìn)展情況有關(guān)，則cfDNA實(shí)時(shí)監(jiān)測可廣泛用于突變患者的療效評價(jià)而不局限于接受靶向治療者。

疾病進(jìn)展時(shí)較穩(wěn)定或緩解時(shí)血漿基因突變檢出率高，考慮與疾病進(jìn)展腫瘤負(fù)荷增加及時(shí)間特異性有關(guān)。提示在動態(tài)監(jiān)測過程中，血漿檢測結(jié)果由陰性變?yōu)殛栃曰虺掷m(xù)陽性，疾病進(jìn)展可能性大。血漿檢測結(jié)果陰性者考慮為治療有效，cfDNA水平低不易檢出。在疾病進(jìn)展患者中，本研究不僅觀察到血漿檢測突變呈陽性，更有6例突變出現(xiàn)早于影像學(xué)評估，這又提示cfDNA的動態(tài)檢測不僅能夠幫助判斷療效，更能早期發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展。

本研究觀察到9例患者在EGFR-TKIs治療過程中血漿檢測出現(xiàn)T790M突變，其中1例接受化療6個(gè)周期，療效評價(jià)穩(wěn)定，血檢突變消失，6個(gè)月后疾病進(jìn)展，血檢突變再次出現(xiàn)，接受奧希替尼治療后，疾病穩(wěn)定，血檢突變再次消失；另有6例出現(xiàn)T790M突變后隨即接受奧希替尼治療；疾病控制率71.4%（5/7）。1例接受化療，療效評價(jià)穩(wěn)定，動態(tài)血漿監(jiān)測仍在進(jìn)行當(dāng)中；1例暫繼續(xù)服用易瑞沙治療。Xu等［19］的研究中觀察到2例19Del突變患者在靶向治療2年后血漿檢測出現(xiàn)19Del和T790M雙突變，早于疾病惡化5個(gè)月。Jinfeng等［20］對120例服用EGFR-TKIs的患者進(jìn)行了連續(xù)5次（每2個(gè)月1次）血漿突變檢測，49%的患者出現(xiàn)T790M突變并預(yù)后不良。Soria等［21］的研究則發(fā)現(xiàn)患者獲得性耐藥后，靶向藥物聯(lián)合化療相比于單純化療并不能延長患者生存期，而實(shí)時(shí)血漿T790M檢測對下一步治療具有重要的指導(dǎo)意義。

de Las Casas等［22］報(bào)道了1例動態(tài)監(jiān)測cfDNA突變的病例。組織檢測L858R突變患者，靶向治療16個(gè)月后cfDNA突變檢測結(jié)果為L858R及T790M突變，化療后療效評價(jià)為部分緩解，血漿檢測顯示L858R及T790M突變消失。半年后再一次血漿檢測呈L858R及T790M突變，隨后影像學(xué)證實(shí)疾病進(jìn)展。提示cfDNA動態(tài)監(jiān)測能早期發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展、評價(jià)療效，基因突變水平升高提示疾病進(jìn)展，治療有效時(shí)突變水平下降或突變消失，與本研究結(jié)果相符。

本研究樣本量較少，持續(xù)時(shí)間較短，血漿EGFR基因突變動態(tài)變化與臨床療效關(guān)系分析僅局限于近期療效方面；使用的檢測技術(shù)僅對cfDNA基因突變進(jìn)行了定性分析，定量水平分析可能會對本研究結(jié)果補(bǔ)充支持，抑或有新的發(fā)現(xiàn)。

血漿cfDNA比例低、半衰期短，高度片段化，檢測cfDNA突變的方法必須具有高度靈敏性和特異性。封閉性引物的雙向選擇性在理論上決定了PAP擁有超高的靈敏度和特異度。這一方法檢測cfNDA與ARMS法檢測及組織檢測結(jié)果一致，表明PAP在cfNDA檢測中具有極大的臨床應(yīng)用前景。PAP動態(tài)監(jiān)測NSCLC血漿cfDNA突變狀況，能夠預(yù)測靶向治療的療效，對繼發(fā)的T790M突變具有診斷價(jià)值。而化療后敏感突變及耐藥T790M突變的消失則提示動態(tài)檢測對于化療亦有很好的預(yù)測療效價(jià)值。夏國豪等［23］研究發(fā)現(xiàn)EGFR-TKIs治療晚期NSCLC長期獲益后獲得性耐藥的患者，先化療、后再次應(yīng)用EGFR-TKIs，大部分患者仍能取得一定療效。對于這些需要化療以及靶向藥物交替治療的患者，cfDNA的動態(tài)監(jiān)測是一項(xiàng)有價(jià)值的療效評價(jià)手段，能夠幫助更精確的選擇治療方案。

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