丁學(xué)智，韓戰(zhàn)營，楊巧麗

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，高發(fā)于老年人，具有高致死率和致殘率等特點(diǎn)。近年來多項(xiàng)研究[1,2]指出，micro-RNA不僅在心肌梗死發(fā)病時(shí)發(fā)生顯著變化，而且參與調(diào)控心肌細(xì)胞的壞死和凋亡，是AMI重要生物標(biāo)志物。

miR-181a位于人類染色體1q32.1位置上，以往關(guān)于其的研究主要集中在癌癥上，miR-181a不僅與癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性有關(guān)[3]，且可以通過其對(duì)靶基因的直接作用對(duì)癌細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖以及凋亡進(jìn)行調(diào)控[4,5]。伊琳等[6]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a不僅在自發(fā)性大鼠心肌組織中出現(xiàn)差異性表達(dá)，而且其表達(dá)與血管內(nèi)皮因子信號(hào)通路的調(diào)控密切相關(guān)。此外，Das等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-181家族成員可以通過調(diào)控下游細(xì)胞因子和線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)而對(duì)心肌功能產(chǎn)生影響。但是目前關(guān)于miR-181a在老年AMI患者血清中的表達(dá)的研究還鮮有報(bào)道，本文通過對(duì)比不同人群血清miR-181a的表達(dá)分析老年AMI血清miR-181a表達(dá)與心肌酶學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性，以揭示miR-181a在老年AMI患者的血清表達(dá)及其表達(dá)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組 選取2016年1月～2017年3月于鶴壁市人民醫(yī)院心內(nèi)科收治的老年AMI患者56例為AMI組，其中男性31例，女性25例，年齡60～79歲，平均年齡（69.7+6.5）歲；所有AMI患者均經(jīng)心電圖、心肌酶學(xué)等檢查，符合世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)選取我院健康體檢中心體檢的52例老年健康受試者（HE）作為HE組，其中男性27例，女性25例，年齡60～81歲，平均年齡（69.4±6.8）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜60周歲、肝腎等器官功能障礙、慢性疾病、神經(jīng)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重心律失常、心源性休克，未經(jīng)治療死亡以及發(fā)病時(shí)間不詳或發(fā)病12 h內(nèi)未采集血樣的患者。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)批準(zhǔn)通過，所有研究對(duì)象或其家屬均對(duì)本次研究內(nèi)容知情同意。

1.2 血液收集和血清學(xué)指標(biāo) 所有研究對(duì)象抽取靜脈血5～10 ml，加入EDTA后離心（1000×g）10 min（5810R，Eppendorf AG，Germany）收集血漿。應(yīng)用免疫層析法試劑盒（鄂械注準(zhǔn)20122401709，武漢明德生物，中國）檢測(cè)人血清心肌肌鈣蛋白（cTnI）。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S-180，Mindary，中國）檢測(cè)人血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量。

1.3 血清miR-181a的提取 以血漿/QIAzol溶解試劑（QIGEN，Germany）為1:5比例向血漿中加入QIAzol溶解試劑，室溫靜置15 min，然后根據(jù)miRNeasy血清/血漿試劑盒（QIGEN，Germany）中的方案提取RNA。最后，使用15ul DEPC水溶解總RNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 通過One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Japan）將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR參數(shù)設(shè)置：37℃60 min，85℃ 5 s。

RT-qPCR：熒光定量PCR使用SYBR Premix Ex TaqTM II（TakaRa，Japan）試劑盒，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行擴(kuò)增。 PCR參數(shù)設(shè)置：95℃ 30 s，40℃循環(huán)90℃ 5 s，65℃ 30 s。選擇U6作為內(nèi)參照，通過2-△t法（△t = CTmiRNA-CTU6）計(jì)算miR-181a的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。使用Pearson法分析miR-181a相對(duì)表達(dá)量與AST和cTnI的相關(guān)性，miR-181a對(duì)老年AMI的診斷價(jià)值用受試者工作曲線（ROC）分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料對(duì)比 兩組患者在年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、吸煙比例、高血壓病史、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.2 血清miR-181a表達(dá)對(duì)比 RT-qPCR檢測(cè)兩組的血液miR-181a的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：miR-181a在AMI組的血清相對(duì)表達(dá)量為（1.18+0.30），顯著高于其在HE組的血清表達(dá)（1.60+0.27）（P＜0.05，圖1）。

2.3 miR-181a表達(dá)與AST和cTnI的相關(guān)性 在AMI組，miR-181a相對(duì)表達(dá)量與血清AST含量（r=0.647，P＜0.01）、血清cTnI含量（r=0.738，P＜0.01）呈正相關(guān)（圖2～3）。

2.4 miR-181a對(duì)老年AMI的預(yù)測(cè)價(jià)值 miR-181a的ROC曲線下面積（AUC）為0.842，其95%CI為0.770～0.914。當(dāng)miR-181a在血清中的相對(duì)表達(dá)量為1.34時(shí)，Youden指數(shù)最大，因此miR-181a的診斷閾值為1.34，此時(shí)miR-181a診斷老年AMI的敏感性為83.9%，特異性為69.2%（圖4）。

3 討論

表1 兩組研究對(duì)象一般情況對(duì)比

圖1 miR-181a在老年AMI患者血清中高表達(dá)

圖2 AMI組患者血清miR-181a表達(dá)與AST的相關(guān)性

microRNA是一類在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的、由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過其對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控參與到真核細(xì)胞的分化、增殖、生長和凋亡的調(diào)解。在心血管疾病的中，miRNA不僅通過其對(duì)靶基因的調(diào)控而在心肌肥大、心肌壞死和凋亡中發(fā)揮著重要的作用，并且參與到AMI發(fā)病的每個(gè)過程[8-10]。同時(shí)由于miRNA在血液中異常的穩(wěn)定，并且對(duì)各種病理生理?xiàng)l件下表達(dá)差異明顯，是一種理想的疾病血液檢測(cè)生物標(biāo)志物：Liu等[11]研究指出，血漿miR-1，miR-208和miR-499是漢人群AMI的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。

本文研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a在在老年AMI血清中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其在健康人血清中的表達(dá)P＜0.05）。Raut等[12]的研究指出，miR-181a和miR-30c在糖尿病性心肌病中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并且表達(dá)失調(diào)的miR-181a和miR-30c協(xié)同靶向作用其共同的靶基因p53，進(jìn)而通過p53-p21信號(hào)通路調(diào)控心肌細(xì)胞的肥大與凋亡。而關(guān)于AMI發(fā)病機(jī)制和致死機(jī)理的相關(guān)研究已經(jīng)指出[8,13]，冠狀動(dòng)脈內(nèi)不穩(wěn)定的斑塊破裂后，引起的血小板活化而啟動(dòng)的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)使得血液處于高凝狀態(tài)，這種處于高凝狀態(tài)血液極易形成栓塞而導(dǎo)致心肌缺血，最終導(dǎo)致心肌壞死或者凋亡。由此可以看出，miR-181a可能通過對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)而參與到疾病的發(fā)生發(fā)展中。

圖3 AMI組患者血清miR-181a表達(dá)與cTnI的相關(guān)性

圖4 miR-181a對(duì)老年AMI的預(yù)測(cè)曲線

為進(jìn)一步研究miR-181a在老年AMI患者血清中的表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，本文通過Peasrson法分析老年AMI患者血清中miR-181a的相對(duì)表達(dá)量與血清AST、cTnI的相關(guān)性，結(jié)果顯示：在老年AMI患者血清中，miR-181a相對(duì)表達(dá)量與血清AST含量（r=0.647，P＜0.01）、血清cTnI含量（r=0.738，P＜0.01）呈正相關(guān)。AST是一個(gè)與心肌細(xì)胞損傷、凋亡或者壞死密切相關(guān)的心肌酶，當(dāng)發(fā)生心肌損傷或者壞死時(shí)，其在血清中的表達(dá)量將顯著升高。CTnI是心肌肌鈣蛋白的一個(gè)亞型，在正常生理情況下，外周血cTnI的表達(dá)量極低（0～0.3 ug/L），但當(dāng)發(fā)生心肌梗死時(shí)在血液中的含量會(huì)在2～3 h內(nèi)可檢測(cè)到升高，并在24～28 h內(nèi)達(dá)到峰值，也正因?yàn)槠鋵?duì)心肌損傷有高度敏感性和特異性，所以其是歐洲和美國的指南中所強(qiáng)調(diào)使用的診斷AMI的首選生物標(biāo)志物[14]。由此可以看出，miR-181a與心肌損傷、壞死或者凋亡有關(guān)。同時(shí)，Das等[7]的發(fā)現(xiàn)也從另一個(gè)側(cè)面指出，miR-181a是通過對(duì)其下游靶基因的作用而參與到對(duì)心肌細(xì)胞的損傷、壞死或凋亡調(diào)解中。

miR-181a對(duì)老年AMI的預(yù)測(cè)分析顯示最佳界值為1.34，敏感性為83.9%，特異性為69.2%，AUC為0.842，其95%CI為0.770～0.914，提示miR-181a對(duì)老年AMI患者診斷具有一定價(jià)值[15]。

綜上所述，miR-181a在老年AMI患者血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且其可能是診斷老年AMI潛在的生物標(biāo)志物。

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