張憲臣, 李 蓉, 張朋杰, 吳 霞,華洪波, 楊璐齊, 盧俊文, 容裕棠

(1. 中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 廣東 中山 528403; 2. 安捷倫科技(中國)有限公司, 廣東 廣州 510000; 3. 中山市卓雅外語學(xué)校, 廣東 中山 528401)

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)?；?，水產(chǎn)品養(yǎng)殖戶為了追求更大的商業(yè)利益和減少高密度飼養(yǎng)帶來的風(fēng)險,常常濫用抗生素藥物。這種濫用抗生素的行為會引起水產(chǎn)品中藥物的殘留,而這些受污染的水產(chǎn)品經(jīng)食物鏈進入人體后,容易導(dǎo)致蓄積毒性、細菌耐藥性等一系列連鎖危害,嚴重威脅著人們的身體健康[1]。水產(chǎn)品中藥物的使用與殘留受到越來越廣泛的關(guān)注,許多國家和國際組織均制定了水產(chǎn)品中藥物殘留的限量標準。日本2006年5月29日實施的《食品中殘留農(nóng)藥的肯定列表制度》對水產(chǎn)品中的134種化學(xué)藥物殘留量進行了限定。美國食品及藥物管理局(FDA)規(guī)定對進口的水產(chǎn)品必須檢查可能存在的221種化學(xué)藥物殘留和10種嚴禁使用的藥品[2]。歐盟、加拿大、韓國等近幾年也相應(yīng)地提高了水產(chǎn)品中物殘留的限量[2]。

水產(chǎn)品中藥物殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[3]、高效液相色譜法(HPLC)[4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[6-8]和液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)[9]。其中，ELISA易出現(xiàn)假陽性結(jié)果和交叉反應(yīng);HPLC的抗干擾能力差,靈敏度低且不能滿足標準限值的要求;GC-MS/MS需對樣品進行繁瑣的衍生化處理;LC-MS/MS無需衍生化處理,且在滿足多組分同時檢測的情況下仍有較好的選擇性、靈敏度和特異性,彌補了前幾種方法的缺陷,但其難以完全闡明化合物的結(jié)構(gòu)裂解信息,定性準確度方面尚有欠缺。水產(chǎn)品中藥物殘留的前處理方法包括固相萃取、基質(zhì)固相分散萃取、快速溶劑萃取、微波輔助萃取、分子印跡技術(shù)和QuEChERS等[10-15]。QuEChERS由于具有快速、簡單、便宜、有效、耐用和安全可靠等優(yōu)勢，在檢測水產(chǎn)品中藥物殘留的應(yīng)用日趨增多,但是其易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng),會對方法的檢出限、選擇性以及測試結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響。

四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Q Orbitrap HRMS)具有分辨率高及定量能力好的優(yōu)點,不同于三重四極桿低分辨質(zhì)譜使用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式對目標物的離子對進行定量分析,Q Orbitrap HRMS可以利用目標物母離子精確的相對分子質(zhì)量直接定量,無需對目標物逐個優(yōu)化子離子及相關(guān)參數(shù),對于多目標物的分析,可以極大地縮短檢測時間,同時又能很好地避免低分辨質(zhì)譜易受基質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽性的現(xiàn)象[16-19]。

本研究利用改進的QuEChERS方法對水產(chǎn)品進行前處理,選擇一種新型的高效基質(zhì)脂肪吸附劑(EMR-Lipid)對樣品中的雜質(zhì)進行吸附,同時結(jié)合UPLC-Q Orbitrap HRMS對水產(chǎn)品中25種藥物殘留進行測定。該法靈敏、快速、簡單、準確、省時、穩(wěn)定,實用性強,能滿足目前的檢測需求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(配加熱電噴霧離子(HESI)源)、Dione UltiMate 3000高壓液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司); Coulter Avanti J-26XP超高速冷凍離心機(德國Bechman公司); Syncore平行定量濃縮儀、B-740再循環(huán)冷卻系統(tǒng)、V-700/701真空泵(瑞士Buchi公司); Vortex 3渦旋振蕩器(德國IKA公司); DTY-B1200電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)。

標準品:苯咪唑青霉素(純度≥95.0%)、氯唑西林鈉(純度≥99.0%)、雙鈉青霉素鈉鹽水合物(純度≥99.0%)、頭孢噻呋(純度≥99.0%)、苯唑西林鈉(純度≥99.0%)、哌拉西林(純度≥98.0%)、2-氨基-5-苯并咪唑(純度≥99.9%)、酮洛芬(純度≥99.0%)、美洛昔康(純度≥99.5%)、吡羅昔康(純度≥97.0%)、水楊酸(純度≥99.5%)、舒林酸(純度≥98.0%)、托滅酸(純度≥99.0%)、托美丁鈉(純度≥99.9%)、4-氨基安替比林(純度≥99.3%)、4-甲酰氨基安替比林(純度≥99.3%)、4-甲氨基安替比林(純度≥98.0%)、保泰松(純度≥99.5%)、17α-甲基睪酮(純度≥97.6%)、醋酸美倫孕酮(純度≥99.5%)、乙酸甲地孕酮(純度≥99.0%)、甲羥孕酮(純度≥99.0%)、群地龍(純度≥98.0%)、勃地酮(純度≥93.6%)和諾龍(純度≥98.1%)均購自德國Dr. Ehrenstofer公司;甲醇、乙腈和無水硫酸鎂(色譜純,美國Thermo Fisher公司);高效基質(zhì)脂肪吸附劑(美國Agilent公司);無水硫酸鈉(Na2SO4)、氯化鈉(NaCl)(分析純,廣州化學(xué)試劑廠)。實驗用超純水為Milli-Q水處理系統(tǒng)制得。

羅非魚、羅氏蝦、北極貝和白貝等樣品由中山檢驗檢疫局動植物監(jiān)管科提供;大閘蟹購自中山華潤萬家超市。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取苯咪唑青霉素、氯唑西林、雙鈉青霉素、頭孢噻呋、苯唑西林、哌拉西林標準品約5.0 mg,置于5 mL容量瓶中,用乙腈-水(30∶70, v/v)溶液溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標準儲備液,于4 ℃冰箱中保存;分別準確稱取其余標準品約5.0 mg,置于5 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標準儲備液,于4 ℃冰箱中保存。

準確吸取適量的上述標準儲備液,置于100 mL容量瓶中,并用乙腈定容至刻度,配制成各質(zhì)量濃度均為10 mg/L的混合標準工作液。

1.3 樣品前處理

準確稱取勻漿后的試樣2.0 g(精確至0.01 g),置于25 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋振蕩2 min,超聲提取10 min,以4 000 r/min離心5 min,移取上清液,置于用5 mL水活化過的裝有EMR-Lipid 1.00 g的離心管中,渦旋振蕩2 min,于5 ℃以15 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液至已提前放入3 g Na2SO4、3 g NaCl的25 mL離心管中,渦旋振蕩2 min,于5 ℃以15 000 r/min離心10 min,將上層清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,于40 ℃平行定量濃縮儀中濃縮至干,加入1.0 mL乙腈-水(10∶90, v/v)溶液,渦旋溶解殘留物,提取液過0.2 μm水相濾膜,供UPLC-Q Orbitrap HRMS測定。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL;流動相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～7.0 min, 5%B～95%B; 7.0～10.0 min, 95%B; 10.0～13.0 min, 5%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為加熱電噴霧離子源;離子源溫度為350 ℃;離子傳輸溫度為320 ℃;鞘氣(N2)壓力為40 arb;輔助氣(N2)壓力為40 arb;毛細管電壓為3.2 kV;離子傳輸管溫度為325 ℃;掃描模式為全掃描/實時二級質(zhì)譜(Full MS/dd-MS2)掃描;采集范圍為80～1 000 Da,正負切換采集;一級質(zhì)譜分辨率為70 000,二級質(zhì)譜分辨率為17 500;碰撞池能量(NCE)為20、40和60 eV。25種藥物的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 25種藥物的分子式、母離子、碎片離子和保留時間Table 1 Molecular formulas, precursor ions, fragment ions and retention times (RTs) of the 25 drugs

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究選擇對多種農(nóng)藥殘留分離較好的兩款色譜柱Thermo Accucore RP-MS C18 (100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)對25種藥物進行分離。結(jié)果顯示,這兩款色譜柱均能分離25種藥物,且峰形較好,但目標化合物乙酸甲地孕酮在ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱上的保留時間更加穩(wěn)定,質(zhì)譜響應(yīng)值更高,形成的色譜峰峰形尖銳,對稱性好。原因可能是色譜柱粒徑對乙酸甲地孕酮的分離有較大影響,粒徑越小分離效果越好、越穩(wěn)定。因此實驗最終選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。

本研究的25種目標物中僅有水楊酸在負離子模式下檢測,其他目標物均在正離子模式下檢測,為了提高正離子模式下目標物的響應(yīng)值,本研究在流動相A和流動相B中均添加了甲酸,以提高目標化合物的靈敏度。比較了有機相為乙腈(含0.1%(v/v)甲酸)、水相分別為5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(含0.1%(v/v)甲酸)和0.1%(v/v)甲酸水溶液對25種藥物色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用乙腈(含0.1%(v/v)甲酸)-0.1%(v/v)甲酸水溶液為流動相時,24種藥物在正離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)更高,色譜峰峰形尖銳,對稱性良好;在負離子掃描模式下水楊酸的靈敏度雖有所降低,但也能夠達到檢測要求。因此本研究選擇乙腈(含0.1%(v/v)甲酸)-0.1%(v/v)甲酸水溶液為流動相。在優(yōu)化后的色譜條件下,一次進樣即可完成25種目標化合物的同時分離和測定。25種藥物混合標準溶液(1.0 μg/L)的選擇離子色譜圖見圖1。

圖 1 25種藥物混合標準溶液(1.0 μg/L)的選擇離子色譜圖Fig. 1 Selected ion chromatograms of the 25 drugs in a mixed standard solution (1.0 μg/L)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本方法以流動注射方式對25種目標物在正負切換離子模式下進行一級全掃描,采用Full MS/dd-MS2掃描模式,設(shè)定相對分子質(zhì)量范圍(m/z150～1 000),并以每個化合物的理論相對分子質(zhì)量(見表1)建立二級掃描的目標列表。在實際掃描過程中,當一級全掃描發(fā)現(xiàn)目標列表里的母離子,且信號強度超過預(yù)設(shè)值,就會觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴子離子掃描模式,進而獲得對應(yīng)母離子精確相對分子質(zhì)量的二級離子全掃描質(zhì)譜信息,以實現(xiàn)定性確證。根據(jù)歐盟2002/657/EC對禁用藥物殘留檢測確證方法的要求,確證檢測需要4個鑒別點。本實驗通過上述質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化和篩選,每種待測物最終確定1個監(jiān)測離子對(見表1),以滿足歐盟獸藥殘留檢測確證的要求。

2.3 QuEChERS條件的優(yōu)化

2.3.1 萃取溶劑的優(yōu)化

研究選擇陰性羅非魚肉樣品為實驗材料,添加含量為5.0 μg/kg的混合標準溶液,每個樣品平行測定3次,外標法定量,對萃取溶劑(乙腈、含1%(v/v)甲酸的乙腈溶液和甲醇)進行優(yōu)化(見圖2)。結(jié)果顯示,采用乙腈時,25種藥物的回收率均高于70%;采用含1%(v/v)甲酸的乙腈溶液時,目標物美洛昔康等非甾體類抗炎藥的回收率低于40%;采用甲醇時目標化合物的回收率普遍較低,尤其是苯咪唑青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物殘留的回收率低于30%。因此本研究最終選擇乙腈作為萃取溶劑。

圖 2 不同萃取溶劑對25種藥物回收率的影響Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the 25 drug

圖 3 EMR-Lipid的用量對25種藥物回收率的影響Fig. 3 Effect of different dosages of enhanced matrix removal of lipids (EMR-Lipid) on the recoveries of the 25 drugs

2.3.2 高效基質(zhì)脂肪吸附劑用量的優(yōu)化

高效基質(zhì)脂肪吸附劑是一種能夠選擇性去除復(fù)雜基質(zhì)中脂肪的獨特吸附劑,具有快速、易操作的特點,對于質(zhì)譜分析還具有高效的凈化能力。本研究選擇陰性羅非魚樣品為實驗材料,添加含量為5.0 μg/kg的混合標準溶液,每個樣品平行測定3次,外標法定量,對EMR-Lipid的使用量進行優(yōu)化(見圖3)。在優(yōu)化范圍(0.2～1.5 g)內(nèi),當添加量為1.0 g時25種藥物殘留的回收率均能達到78%以上;繼續(xù)增加EMR-Lipid的使用量,雖然有的藥物加標回收率有所提高,但并不顯著,有的藥物加標回收率反而下降,主要原因是EMR-Lipid使用量增加到一定量時會對部分藥物產(chǎn)生吸附作用。研究最終確定EMR-Lipid的使用量為1.0 g。

2.3.3 離心條件和濃縮條件的優(yōu)化

雖然采用EMR-Lipid已經(jīng)去除了樣品中大部分的油脂,但是樣品提取液中還殘留少量油脂、蛋白質(zhì)等干擾組分。本研究采用高速冷凍離心對樣品提取液進行處理,能夠有效地促進油脂凝結(jié)和蛋白質(zhì)的沉降,減少其對目標化合物的干擾。

本研究對樣品提取液進行了濃縮,選擇平行定量濃縮儀減壓濃縮樣品提取液,并對濃縮的條件進行摸索,確定濃縮溫度為40 ℃,冷凝溫度為-2 ℃,真空度采用梯度下降的方式(250 kPa 10 min, 80 kPa 10 min, 30 kPa濃縮至干)。該方法可以同時濃縮處理24份樣品提取液,完全濃縮至干僅需1.5 h。該處理方法能夠有效降低檢測成本,提高檢測質(zhì)量和效率。

2.3.4 凈化萃取劑和使用量的選擇

本研究考察了無水硫酸鈉與氯化鈉、無水硫酸鎂與氯化鈉作為凈化萃取劑。結(jié)果顯示,當選擇無水硫酸鎂與氯化鈉作為凈化萃取劑時,由于無水硫酸鎂對目標化合物有較強的吸附作用,25種藥物的回收率均小于20%;當選擇無水硫酸鈉與氯化鈉作為凈化萃取劑時,25種藥物的回收率均高于70%。研究選擇陰性羅非魚樣品為實驗材料,添加含量為5.0 μg/kg的混合標準溶液,每個樣品平行測定3次,外標法定量,對無水硫酸鈉和氯化鈉的使用量進行優(yōu)化(見圖4)。無水硫酸鈉和氯化鈉的組合分別為1 g Na2SO4+5 g NaCl、2 g Na2SO4+4 g NaCl、3 g Na2SO4+3 g NaCl、4 g Na2SO4+2 g NaCl和5 g Na2SO4+1 g NaCl,研究結(jié)果顯示,當Na2SO4和NaCl均為3 g時,目標物的回收率最高。因此本研究選擇3 g Na2SO4和3 g NaCl作為凈化萃取劑。

圖 4 不同凈化萃取劑對25種藥物回收率的影響Fig. 4 Effect of different cleaning extraction agents on the recoveries of the 25 drugs

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標準曲線、線性范圍和檢出限

在高分辨質(zhì)譜的分析中,其提取的精確相對分子質(zhì)量色譜圖無基線噪音,因此采用傳統(tǒng)信噪比(S/N)的方法無法計算檢出限。本方法采用基質(zhì)加標的方式建立標準曲線,以定量離子的峰面積(Y)為縱坐標、相應(yīng)質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標繪制標準曲線。用標準曲線各濃度點偏離值(實際值與理論值之差)的標準偏差的3.3倍以上的質(zhì)量濃度確定檢出限[9]。準確量取適量混合標準工作液,用乙腈-水(10∶90, v/v)溶液稀釋成系列梯度的標準工作液,在1.4節(jié)條件下依次測定。結(jié)果顯示,目標化合物在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.997,檢出限為0.1～1.0 μg/kg(見表2)。

表 2 25種藥物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r) and LODs of the 25 drugs

表 2 (續(xù))Table (Continued)

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2 準確度和精密度

在陰性水產(chǎn)品樣品(包括羅非魚、羅氏蝦、北極貝和大閘蟹)中進行加標回收試驗。分別對上述樣品進行3個水平的加標回收率測定,每個水平進行6次平行試驗,結(jié)果表明,25種藥物的平均加標回收率為70.1%～108.9%,RSD為2.1%～13.8%(見表3)。

表 3 實際空白樣品中25種藥物的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 25 drugs in real blank samples (n=6)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

2.4.3 實際樣品檢測

利用本研究建立的分析方法檢測37批實際樣品(其中包括24批羅非魚樣品、7批羅氏蝦樣品和6批白貝樣品),其中在2批羅非魚樣品中分別檢出苯咪唑青霉素和美洛昔康,檢出含量分別為6.92 μg/kg和2.64 μg/kg,其他樣品中均無藥物殘留檢出。實際樣品中苯咪唑青霉素和美洛昔康的二級質(zhì)譜圖分別見圖5和圖6。

圖 5 苯咪唑青霉素(a)陽性樣品(6.92 μg/kg)和(b)標準溶液(5.0 μg/L)的二級質(zhì)譜圖Fig. 5 MS2 spectra of azlocillin in (a) a positive sample (6.92 μg/kg) and (b) a standard solution (5.0 μg/L)

圖 6 美洛昔康(a)陽性樣品(2.64 μg/kg)和(b)標準溶液(1.0 μg/L)的二級質(zhì)譜圖Fig. 6 MS2 spectra of meloxicam in (a) a positive sample (2.64 μg/kg) and (b) a standard solution (1.0 μg/L)

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS檢測水產(chǎn)品中25種藥物殘留的分析方法,以乙腈為提取劑,水產(chǎn)品樣品經(jīng)改進的QuEChERS方法進行凈化處理,以EMR-Lipid去除提取液中的干擾物質(zhì),無水硫酸鈉與氯化鈉為鹽析劑反相萃取目標化合物。該法滿足GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的技術(shù)要求。

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