吳鵬，田孝祥，劉丹，齊艷萍，閆承慧，韓雅玲

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 錦州 121000；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016）

巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的吞噬和抗原提呈細(xì)胞，是炎癥和先天性免疫的關(guān)鍵效應(yīng)物，并在多種炎癥相關(guān)疾病，包括心血管?。▌用}粥樣硬化、心肌梗死、心肌炎）、代謝性疾?。ǚ逝?、糖尿病，代謝綜合征）及癌癥等中發(fā)揮重要作用[1-3]。在不同病理生理條件下，巨噬細(xì)胞可發(fā)生極化，成為功能不同的經(jīng)典活化型M1[脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）共同作用]或替代活化型M2[白細(xì)胞介素4（interleukine-4，IL-4）作用]。M1型巨噬細(xì)胞可以分泌多種促炎因子[如：腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、單核細(xì)胞趨化因子 1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）]，在動脈粥樣硬化及代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中增多，發(fā)揮促炎癥作用；M2型巨噬細(xì)胞分泌抑炎因子[如：白細(xì)胞介素10（interleukine-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子 β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）]，增強(qiáng)細(xì)胞清除能力，在動脈粥樣硬化及代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中增多，抑制炎癥的作用[4-5]。目前認(rèn)為，巨噬細(xì)胞極化是巨噬細(xì)胞發(fā)揮病理生理作用的主要機(jī)制之一。因此，巨噬細(xì)胞極化調(diào)控研究已成為多種疾病研究的熱點。

目前，有研究報道C-Jun N-terminal kinase（JNK）及Notch等信號通路參與巨噬細(xì)胞極化調(diào)控，但其機(jī)制尚未闡明[6]。溶酶體在巨噬細(xì)胞中大量表達(dá)，是其對抗外源和內(nèi)源性病原分子不可或缺的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[7]。但是對溶酶體是否參與調(diào)控巨噬細(xì)胞極化仍少見報道。因此，本研究擬采用單核巨噬細(xì)胞系，在體外建立巨噬細(xì)胞極化模型，探討溶酶體在巨噬細(xì)胞極化中的作用。本研究將為巨噬細(xì)胞新的極化調(diào)控機(jī)制提供實驗依據(jù)和理論線索，并為多種巨噬細(xì)胞極化相關(guān)疾病的防治提供新的干預(yù)靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7（購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫），抗GAPDH抗體、Lipopolysaccharide-LPS（Sigma公司），DMEM（Gibcobrl公司），胎牛血清（Biochrom公司），蛋白測定BCA試劑盒（Pierce公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物公司），Mouse IL-10/Mouse MCP-1/Mouse TNF-α/Mouse TGF-β1ELISA檢測試劑盒（R&D公司），PE標(biāo)記大鼠抗小鼠F4/80抗體、FITC標(biāo)記抗小鼠CD206抗體（BD Pharmingen公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記抗小鼠CD16/32抗體（Biolegend公司），抗TNF-α、INOS抗體（Cell signaling公司），抗CD206抗體、抗LAMP-1/LAMP-2/LIMP-2抗體（Abcam公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green染料（TaKaRa公司），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司），重組小鼠IFN-γ、白細(xì)胞介素4 （IL-4）（Peprotech公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理及分組 實驗分為對照組（未接受誘導(dǎo)劑刺激）、經(jīng) LPS（100 ng/ml）+IFN-γ（20 ng/ml）刺激24 h誘導(dǎo)M1組及IL-4（20 ng/ml）刺激24 h誘導(dǎo)M2 組[8]。

1.2.2 光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 細(xì)胞進(jìn)行上述處理后，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測M1、M2型巨噬細(xì)胞比例

經(jīng)上述處理的細(xì)胞，每組經(jīng)胰0.25%蛋白酶消化后并計數(shù)。取5×105個細(xì)胞/管，PBS液洗3次，50 μl PBS重懸，加入5 μl PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠F4/80抗體、2 μl FITC標(biāo)記的抗小鼠CD16/32抗體、2 μl FITC標(biāo)記的抗小鼠CD206抗體，冰上孵育20～30 min，用PBS洗去未結(jié)合的抗體。PBS重懸后，用流式細(xì)胞儀FACS Calibur檢測M1型及M2型巨噬細(xì)胞比例。

1.2.4 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子及趨化因子 分別收集3組經(jīng)24 h刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、MCP-1、IL-10及TGF-β1含量。在30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，450 nm為測定波長，570 nm為校正波長。

1.2.5 Western blot 細(xì)胞刮刀刮取并收集各組細(xì)胞，每1×105個細(xì)胞比例加入細(xì)胞裂解液100～200 μl。吹打混勻，冰上裂解細(xì)胞30 min，每5分鐘振蕩1次。用4℃離心機(jī)12 000 r/min離心15 min，取上清液。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，各組取40 μg總蛋白SDS-PAGE凝膠電泳。半干法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。5%脫脂奶粉TBS-T溶液室溫封閉1 h。一抗4℃搖晃過夜（1∶1 000稀釋），TBS-T洗3遍。次日相應(yīng)二抗（1∶10 000稀釋）室溫?fù)u晃孵育1 h。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒顯色，暗室發(fā)光顯影。掃描膠片，采用Quantity-One（Biorad公司）軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 實時PCR（real-time PCR） 各組細(xì)胞棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入1 ml Trizol。按Trizol法提取總RNA，測定濃度及純度，A260/280比值在1.7～1.8之間滿足實驗要求。按照TaRaRa Prime ScriptTM試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA。使用Takara SYBR熒光染料，配制20 μl反應(yīng)體系：10 μl 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus），PCR正向、反向引物（10 μmol/L）0.8 μl，0.4 μl ROX Reference Dye，2.0 μl CDNA，6.0 μl dH2O。反應(yīng)條件：95℃ 3 min熱變性；95℃ 5 s變性、60℃ 31 s退火40個循環(huán)；95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s熔解。每個樣本設(shè)2～3個復(fù)孔，其中GAPDH為內(nèi)參。采用誘導(dǎo)型一氧化碳合酶（inducible nitronic oxide synthase，iNOS）、IL-6 及MCP-1標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞；精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）和甘露醇受體（mannitol receptor，CD206）標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞；溶酶體標(biāo)志物[如溶酶體膜相 關(guān) 蛋 白 1（lysosomal membrane associated protein 1，LAMP-1）、溶酶體膜相關(guān)蛋白2（lysosomal membrane associated protein 2，LAMP-2）及溶酶體整合膜蛋白2（lysosome integral membrane protein 2，LIMP-2）]目的基因mRNA的相對表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct的公式及方法進(jìn)行換算。本研究所用引物序列見附表。

1.2.7 免疫熒光觀察溶酶體發(fā)生情況 將上述處理的3組細(xì)胞以合適密度接種于置有玻片的6孔板中，行細(xì)胞免疫熒光染色。棄上清液，PBS洗4次，4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗4次；0.2% Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗3次；10%山羊血清封閉1 h，棄掉血清，加入PBS稀釋的抗LAMP-1、LAMP-2、LIMP-2抗體（1∶100），4℃過夜；PBS洗3次，加入Alexa Fluor 488/555標(biāo)記的熒光二抗（1∶100）室溫避光孵育1 h，PBS洗3次；PBS稀釋DAPI（1∶200）染細(xì)胞核1 min，PBS洗3次，去離子水漂洗，抗淬滅封片劑封片。在共聚焦顯微鏡下觀察、照像。

1.2.8 溶酶體抑制劑可影響巨噬細(xì)胞極化 在分別經(jīng)LPS+IFN-γ和IL-4刺激誘導(dǎo)M1型和M2型巨噬細(xì)胞中同時各加入25 μmol/l氯喹刺激24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測M1型、M2型巨噬細(xì)胞比例（方法同1.2.3）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析（One-way，ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

與對照組RAW264.7細(xì)胞比較，經(jīng)LPS+IFN-γ誘導(dǎo)M1型極化組中，細(xì)胞形態(tài)呈小圓型，偽足少；經(jīng)IL-4刺激誘導(dǎo)M2型極化中，細(xì)胞形態(tài)呈長梭型，偽足多。見圖1。

2.2 M1、M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)比例

M1型及M2型巨噬細(xì)胞均表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80。此外，M1型巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)CD16/32，而M2型巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)CD206。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)LPS+IFN-γ誘導(dǎo)M1型極化組中，PE-F4/80、FITC-CD16/32雙陽性的M1型巨噬細(xì)胞比例較對照組增加[與對照組比較，（83.18±3.07）%vs（24.33±2.95）%；t=13.81，P=0.000]。經(jīng)IL-4誘導(dǎo)M2型極化組中，PE-F4/80、FITC-CD206雙陽性的M2型巨噬細(xì)胞比例較對照組增加[與對照組比較，（42.79±2.70）% vs （5.90±1.08）%；t=12.63，P=0.000]。見圖2。

附表 引物序列

圖1 巨噬細(xì)胞形態(tài) （相差顯微鏡×20）

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子水平

ELISA結(jié)果顯示，經(jīng)LPS 100 ng/ml+IFN-γ 20 ng/ml刺激誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和MCP-1含量高于對照組（與對照組比較，tTNF-α=10.96，PTNF-α=0.000 和tmcp-1=66.07，Pmcp-1=0.000），而 經(jīng) IL-4 20 ng/ml刺激誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10和TGF-β1較對照組增多（與對照組比較，tIL-10=10.18，PIL-10=0.001 和tTGF-β1=8.821，PTGF-β1=0.001）。見圖 3。

2.4 M1、M2型巨噬細(xì)胞表面分子及溶酶體相關(guān)分子表達(dá)

各組iNOS、TNF-α和CD206蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FiNOS=2700，PiNOS=0.000；FTNF-α=97.197，PTNF-α=0.000 ；FCD206=535.79，PCD206=0.000）。與對照組比較，在經(jīng)LPS+IFN-γ向M1型誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中高表達(dá)iNOS和TNF-α蛋白（PiNOS=0.001；PTNF-α=0.018）；經(jīng) IL-4向 M2型 誘 導(dǎo)的巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD206蛋白（PCD206=0.003）。各組LAMP-1、LAMP-2及LIMP-2蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FLIMP-2=120.537，PLIMP-2=0.000；FLAMP-2=121.437，PLAMP-2=0.000；FLAMP-1=99.771，PLAMP-1=0.000）。與對照組比較，LAMP-1、LAMP-2及LIMP-2蛋白在M1型巨噬細(xì)胞中的低表達(dá)（PLIMP-2=0.001，PLAMP-2=0.001，PLAMP-1=0.001），而在M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)（PLIMP-2=0.000，PLAMP-2=0.000，PLAMP-1=0.000）。見圖 4。

圖2 M1、M2型巨噬細(xì)胞比例 （流式細(xì)胞術(shù)）

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子水平

2.5 M1、M2型巨噬細(xì)胞表面分子及溶酶體相關(guān)分子表達(dá)

各組iNOS、IL-6、MCP-1、Arg-1和CD206 mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FiNOS=4850.693，PiNOS=0.000；FIL-6=377.775，PIL-6=0.000；FMCP-1=10682.159，PMCP-1=0.000；FArg-1=757.883，PArg-1=0.000；FCD206=326.235，PCD206=0.000）。與對照組比較，在經(jīng)LPS+IFN-γ向M1型誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中iNOS、IL-6和MCP-1 mRNA表達(dá)水平升高（均P=0.000），而在經(jīng)IL-4向M2型誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中Arg-1和CD206 mRNA水平高于對照組和LPS+IFN-γ組（均P=0.000）。同時，各組細(xì)胞中LAMP-1、LAMP-2及LIMP-2 mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FLIMP-2=436.174，PLIMP-2=0.000；FLAMP-2=1403.731，PLAMP-2=0.000；FLAMP-1=308.116，PLAMP-1=0.000）。與對照組比較，在LPS+IFN-γ向M1型誘導(dǎo)細(xì)胞中LAMP-1、LAMP-2及LIMP-2 mRNA降低（均P=0.000），而且在M2組細(xì)胞中升高（均P=0.000）。見圖5。

圖4 M1、M2型巨噬細(xì)胞表面分子及溶酶體相關(guān)分子表達(dá) （Western blot）

圖5 M1、M2型巨噬細(xì)胞表面分子及溶酶體相關(guān)分子表達(dá) （real-time PCR）

圖6 M1、M2型巨噬細(xì)胞溶酶體 （免疫熒光×40）

2.6 M1、M2型巨噬細(xì)胞中溶酶體發(fā)生情況

M1型巨噬細(xì)胞中紅色熒光標(biāo)記的LAMP-1、LIMP-2以及綠色熒光標(biāo)記的LAMP-2少于未刺激組和M2組，而在M2型巨噬細(xì)胞中LAMP-1、LIMP-2及LAMP-2都多于未刺激組和M1組。見圖6。

2.7 溶酶體抑制劑對巨噬細(xì)胞極化的作用

為進(jìn)一步明確溶酶體與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系，在M1組和M2組中加入溶酶體抑制劑氯喹（chloroquine），流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在LPS+IFN-γ+chloroquine組PE-F4/80、FITC-CD16/32雙陽性的M1型巨噬細(xì)胞比例較LPS+IFN-γ組增加[與LPS+IFN-γ組比較，（85.33±1.333）%vs（73.52±2.348）% ；t=4.377，P=0.012]。同時，在 IL-4+chloroquine組 PE-F4/80、FITC-CD206雙陽性的M2型巨噬細(xì)胞比例較IL-4組降低[與IL-4組比較，（42.79±2.702）% vs （21.02±1.528）% ；（t=7.021，P=0.002）]。見圖 7。

圖7 M1型、M2型巨噬細(xì)胞比例 （流式細(xì)胞術(shù)）

3 討論

巨噬細(xì)胞是一種重要、多功能的細(xì)胞，在先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中扮演著極為重要的角色。同時，巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，在不同環(huán)境的刺激下巨噬細(xì)胞可極化為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞M1型和替代性活化巨噬細(xì)胞M2型，兩者極化功能幾乎相互拮抗，M1、M2型巨噬細(xì)胞之間的平衡，是維持機(jī)體穩(wěn)定的重要方面[9-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞極化表型與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）密切相關(guān)。在急性炎癥反應(yīng)初期和進(jìn)展期，巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)為M1型，參與病原體吞噬并促發(fā)炎癥反應(yīng)；在急性炎癥的消退期，巨噬細(xì)胞則由M1型轉(zhuǎn)分化為具有抗炎作用的M2型，抑制過度的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。在AS發(fā)生過程中，M1型巨噬細(xì)胞吞噬脂蛋白，分泌促炎因子，參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AS發(fā)生和演進(jìn)；而M2型巨噬細(xì)胞分泌抑炎因子，增強(qiáng)細(xì)胞清除能力，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)斑塊穩(wěn)定和消退。但AS演進(jìn)過程中，由于脂質(zhì)和炎癥刺激持續(xù)存在，使斑塊中M1型巨噬細(xì)胞長期占主要位置，不能順利轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞，因此呈現(xiàn)為一種長期慢性炎癥，導(dǎo)致AS難以消退和修復(fù)[4-5]。因此，若能明確調(diào)節(jié)M1型和M2型巨噬細(xì)胞極化的具體分子及其調(diào)控的分子機(jī)制，有望在AS的防治中進(jìn)行有效干預(yù)。目前多項研究表明，巨噬細(xì)胞極化是1個多因子、多環(huán)節(jié)相互作用的復(fù)雜過程，受多種信號分子及通路的調(diào)控。迄今研究較為成熟的信號通路有：PI3K/Akt、C-Jun N-terminal kinase（JNK）、Notch 以及B7-H3-STAT3等信號通路[12-14]。最新研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體在巨噬細(xì)胞極化表型調(diào)控中也起著重要作用。M1型巨噬細(xì)胞中溶酶體的穩(wěn)定性較M2型降低，表現(xiàn)為溶酶體組織蛋白酶嚴(yán)重滲漏，細(xì)胞吞噬能力下降，易演進(jìn)成泡沫細(xì)胞。2014年XU等研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體在脂肪巨噬細(xì)胞M2型極化中起重要作用，抑制溶酶體功能會引起巨噬細(xì)胞脂質(zhì)降解能力降低，發(fā)生脂代謝紊亂，形成泡沫細(xì)胞[15-16]。根據(jù)以上研究結(jié)果表明溶酶體參與并影響巨噬細(xì)胞極化過程，但是都未明確溶酶體在巨噬細(xì)胞極化中的作用。因此，本研究的目的是探討溶酶體在巨噬細(xì)胞極化中的作用。

本流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，PE-F4/80、FITCCD16/32雙陽性標(biāo)記的M1型巨噬細(xì)胞比例達(dá)88.85%，PE-F4/80、FITC-CD206雙陽性標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞比例達(dá)41.93%。與文獻(xiàn)中報道的誘導(dǎo)比例相同[9]。為進(jìn)一步標(biāo)記M1和M2型巨噬細(xì)胞，本研究選擇目前研究公認(rèn)的標(biāo)志物，如iNOS、TNF-α標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞；CD206標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞。不僅從蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平分別驗證建立巨噬細(xì)胞極化模型，而且本研究分別從M1和M2型巨噬細(xì)胞功能上驗證建立極化模型。結(jié)果顯示，M1型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)iNOS、TNF-α蛋白并大量分泌促炎癥因子MCP-1、TNF-α；而M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)CD206蛋白并大量分泌抑炎因子IL-10、TGF-β1。根據(jù)以上結(jié)果表明成功建立巨噬細(xì)胞極化模型。

本研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體標(biāo)志物（LAMP-1、LAMP-2及LIMP-2）轉(zhuǎn)錄及蛋白水平表達(dá)在M1型極化組中降低，而在M2型極化組中增加，與免疫熒光結(jié)果一致。最后，給予溶酶體抑制劑氯喹（chloroquine）刺激巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測M1、M2型巨噬細(xì)胞比例。其結(jié)果示溶酶體抑制劑氯喹處理可降低M2型極化比例，增加M1型極化比例。目前研究認(rèn)為，氯喹作為自噬-溶酶體抑制劑，其主要作用是抑制內(nèi)體成熟，改變其酸性環(huán)境[17]。但具體地分子機(jī)制尚不明確，筆者推測氯喹可能改變?nèi)苊阁w的酸性環(huán)境來影響巨噬細(xì)胞極化。

綜上所述，不同的微環(huán)境下巨噬細(xì)胞有著不同功能形式的表型并參與多種疾病的病理過程。M1型巨噬細(xì)胞雖然可以分泌多種促炎癥因子誘發(fā)機(jī)體的炎癥，但是M1型分泌的腫瘤壞死因子TNF-α在抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮巨大作用；而M2型巨噬細(xì)胞作為機(jī)體中的抑制炎癥細(xì)胞，可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[18]。因此，平衡M1型和M2型巨噬細(xì)胞的極化，可以有效的干預(yù)不同疾病的病理過程。溶酶體作為巨噬細(xì)胞行使功能的重要細(xì)胞器，其結(jié)構(gòu)和數(shù)量的穩(wěn)定是維持巨噬細(xì)胞正常功能的重要方面。研究表明溶酶體在巨噬細(xì)胞極化過程中有著重要作用，為巨噬細(xì)胞新的極化調(diào)控機(jī)制提供實驗依據(jù)和理論線索，并為多種巨噬細(xì)胞極化相關(guān)疾病的防治提供新的干預(yù)靶點。

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