章立群，劉學(xué)，任英華，楊芬，鄧碧霞

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院 口腔科，廣東 深圳 518052）

骨缺損的修復(fù)是臨床研究面臨的難題之一。目前骨組織工程技術(shù)在修復(fù)上下頜骨和牙槽骨缺損的研究中廣泛應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）和骨髓基質(zhì)干細胞有相似的多項分化潛能[1]，由于其來源豐富，取材簡單、獲得率高，體外增殖能力強且對供體損傷小等特點成為近年來研究的熱點[2-3]。但體外長期培養(yǎng)的ADSCs會產(chǎn)生衰老從而造成表型不穩(wěn)定，污染或培養(yǎng)箱故障等不利因素會對研究產(chǎn)生影響。此外傳代過程產(chǎn)生過剩細胞，較浪費耗材和時間，因而低溫冷凍適時復(fù)蘇的細胞為比較合理的使用方法。由于干細胞低溫保存效果的優(yōu)劣直接影響干細胞的數(shù)量和質(zhì)量，因此經(jīng)過低溫保存后的干細胞是否能存活并保持其生物學(xué)活性決定著相關(guān)研究和治療的重要因素之一。本研究旨在了解冷凍保存復(fù)蘇后ADSCs的生物學(xué)特性和誘導(dǎo)成骨分化潛能，為干細胞存儲后的性能和組織工程的進一步研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞（美國Cyagen公司）；胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶（美國Hyclone公司）?；A(chǔ)培養(yǎng)基配方：DMEM，10% FBS，100 u/ml青霉素，100 u/ml鏈霉素；誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：DMEM，10% FBS，0.1 μmol/L地塞米松，50 μm/L維生素C，10 mm/L β-甘油磷酸鈉，105 u/L青霉素，105 u/L鏈霉素；200 μmol/L消炎痛；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒（上海碧海云天生物技術(shù)研究所）；CD105、CD44流式抗體（美國Biolegend公司）；CCK8試劑盒（日本同仁化工研究所）；茜素紅染色試劑盒（南京建成生物公司）；二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Memmer公司）；倒置顯微鏡（德國Zeiss公司），流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干細胞的復(fù)蘇培養(yǎng)和傳代 將SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞擴增至第3代冷凍保存，每支含細胞1×106個細胞。將冷凍6個月的ADSCs迅速取出立即置入-80℃冰箱冷凍2～3 min，再迅速放入37℃溫水復(fù)蘇，快速晃動使管中內(nèi)含物盡快融化，然后在無菌下取出細胞。取一滴細胞懸液臺盼藍染色，計算細胞存活率（%）=活細胞/（活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）×100%。其余細胞液1 000 r/min離心5 min，去上清液，漂洗，接種至T25培養(yǎng)瓶。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換細胞培養(yǎng)基。當(dāng)細胞融合達80%～90%時，加入0.25% Trypsin-0.04% EDTA進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 HE染色 選擇生長良好的第1、3代ADSCs細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，以1×105個細胞接種于事先放有蓋玻片的6孔板中，待細胞達到80%～90%融合取出蓋玻片，HE染色，顯微鏡下觀察。同時對誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)的ADSCs細胞同法進行HE染色，觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 生長曲線測定 取生長良好的第3代ADSCs細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1×104個/ml，接種于96空培養(yǎng)板。分別于第1、2、3、4、5、6、7及8天時，取樣品進行CCK8檢測，酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀讀取450 nm處的OD值，分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 表面抗原鑒定 取第3代ADSCs細胞，用0.25%胰酶消化后調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，1 000 r/min離心5 min，洗滌后棄上清液待標(biāo)記。將待測管中分別加入FITC標(biāo)記的CD105和PECY7標(biāo)記的CD44，每種抗體加5 μl。（以不加抗體的作為空白對照組）用震蕩器將所有樣本中的抗體與細胞充分混勻后，室溫避光孵育30 min，PBS清洗后，加入500 μl含1%多聚甲醛固定液，重懸后，流式細胞儀上機檢測。

1.2.5 誘導(dǎo)成骨培養(yǎng) 取生長良好的第3代細胞以1×105個/ml的密度接種到6孔培養(yǎng)板中，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天換液。以加入不含誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基的3代細胞作為對照組。

1.2.6 ALP染色 分別取第7和14天誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)的ADSCs樣品，4%的多聚甲醛固定30 min；PBS清洗3～5次，加入適量BCIP/NBT染色工作液，室溫避光孵育5～30 min，去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸餾水洗滌1～2次即可終止顯色反應(yīng)，拍照。

1.2.7 茜素紅染色 取第21天誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)的ADSCs細胞，4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，加500 μl 0.1% Triton X-100室溫通透10 min。PBS洗滌；加入茜素紅-S染色液染色30 min，PBS清洗殘留染液，拍照成像。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)

復(fù)蘇后的細胞初始呈圓形，12 h后貼壁細胞明顯增多，24 h后可見大多數(shù)細胞貼壁，72 h后細胞開始伸展呈短梭形或多角形。傳代后細胞增長迅速，呈分散集落方式生長，約7～10 d后細胞達80%左右融合，呈典型的纖維樣細胞，長梭形漩渦樣生長（見圖1、2）。細胞從11到12代開始逐漸出現(xiàn)衰老，14～15代開始衰老細胞明顯增多。成骨誘導(dǎo)后細胞變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則狀，體積有所增大。見圖3。

2.2 ADSCs細胞接種后的生長曲線

細胞在種植后前2天為緩慢的生長期，從第3天開始快速增殖，到第6天時達到峰值，第7天后細胞發(fā)生接觸性抑制或者細胞量較多，培養(yǎng)基消耗快，細胞生長進入平臺期，第8天開始細胞數(shù)量減少。見圖4。

圖1 復(fù)蘇后傳至第3代ADSCs細胞

圖2 復(fù)蘇后第1代和第3代ADSCs細胞 （HE×100）

圖3 誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)14 d后ADSCs細胞 （×100）

2.3 表面抗原鑒定結(jié)果

經(jīng)流式細胞儀檢測CD105和CD44在ADSCs中表達，發(fā)現(xiàn)CD105和CD44的表達在90%以上，符合ADSCs的免疫學(xué)表型。見圖5。

2.4 ALP和茜素紅染色結(jié)果

成骨誘導(dǎo)7 d后實驗組ALP染色陽性細胞呈深紫藍色，繼續(xù)誘導(dǎo)14 d，染色持續(xù)增強，第21天達頂峰，呈強陽性，而對照組則為陰性。茜素紅染色：7 d開始出現(xiàn)紅色鈣化結(jié)節(jié)，并隨著時間推移持續(xù)增強，21 d細胞聚集區(qū)鈣結(jié)節(jié)互相融合，形成片狀，不加誘導(dǎo)組為陰性。見圖6、7。

圖4 生長曲線

圖5 流式細胞儀檢測CD105和CD44

圖6 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) （ALP染色×100）

圖7 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)情況 （茜素紅染色×100）

3 討論

骨組織工程很大程度上依賴于種子細胞的選擇，目前研究較多的骨髓間充質(zhì)干細胞，但骨髓采集有潛在的局限性，骨髓中干細胞含量很少，不易獲取，擴增能力有限，屬于有創(chuàng)操作，對患者傷害大。胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）雖具有多向分化能力，但是ESC很難獲得純化的特定細胞系，而且其研究和應(yīng)用受到倫理和法律的限制。2001年ZUK等[3]首次分離ADSCs，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)ADSCs在不同的誘導(dǎo)條件下可以向脂肪、骨、軟骨、神經(jīng)、骨骼肌、心肌或胰島細胞等多個方向分化[4]。不僅如此，ADSCs還能夠分泌多種生長因子，促進血管新生[5]。此外，ADSCs還具有獲得率高、分離純化簡便、擴增能力強、手術(shù)供區(qū)并發(fā)癥少、不受倫理法律限制等優(yōu)勢，使其成為顱頜面修復(fù)重建較為理想的種子細胞來源。

目前，絕大部分研究者采用的都是取新鮮脂肪組織進行分離培養(yǎng)，但是這存在幾個問題：①原代細胞的培養(yǎng)往往需要經(jīng)過動物飼養(yǎng)、脂肪取材到細胞培養(yǎng)過程，比較耗費時間和金錢；②部分脂肪組織富含血管和淋巴結(jié)，分離過程中不易去除；如果取材不當(dāng)或方法不正確容易混有較多雜質(zhì)細胞需要經(jīng)過多次篩選；③取材不當(dāng)易造成細胞污染同時反復(fù)多次取材的結(jié)果也造成脂肪組織的浪費，降低脂肪組織的利用率。而低溫冷凍適時復(fù)蘇的細胞為比較合理的使用方法，可避免反復(fù)進行原代培養(yǎng)的中間環(huán)節(jié)，極大縮短時間，提高效率。盡管凍存復(fù)蘇技術(shù)在大多數(shù)細胞的研究中較為常用，但ADSCs經(jīng)過一段時間的低溫凍存再復(fù)蘇后其生物學(xué)特性如何？是否能夠進行成骨化誘導(dǎo)？該問題還需要進一步的實驗數(shù)據(jù)支持。因而本研究的主要目的則為研究凍存復(fù)蘇后的干細胞生物學(xué)特性，為骨組織工程技術(shù)提供更多細胞來源和數(shù)據(jù)支持。

本實驗發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇后的ADSCs細胞存活率約80%，其貼壁良好，同樣可進行擴增傳代。基本形態(tài)特征，多數(shù)呈梭形，集落樣生長，傳代后長梭形細胞大量增加。其細胞生長曲線基本呈S形，表面能夠表達脂肪干細胞表面標(biāo)記物，其基本生物學(xué)特性和以往研究報道原代培養(yǎng)的ADSCs特性相似[6-8]。OWE等[9]將骨形成分為3期：成骨細胞增殖、細胞外基質(zhì)分泌期 、細胞外基質(zhì)成熟期、細胞外基質(zhì)礦化期。在成骨誘導(dǎo)分化過程中，ALP是成骨細胞分化的早期標(biāo)志，礦化結(jié)節(jié)是成骨細胞分泌的功能指標(biāo)。因此，ALP及礦化結(jié)節(jié)的檢測對成骨細胞的鑒定有重要意義。本實驗中，復(fù)蘇后的細胞經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)逐漸向紡錘形、多角形轉(zhuǎn)變，7 d時ALP表達陽性，14和21 d表達逐漸增強，表明不斷向成骨細胞分化演變；7 d茜素紅染色陽性，檢測到鈣鹽沉積的礦化結(jié)節(jié)，表明此時已經(jīng)有部分細胞進入成骨過程的細胞外基質(zhì)礦化期。同樣14和21 d表達逐漸增強，說明隨著時間的推移，細胞外鈣化基質(zhì)也不斷增加。由此證明冷凍保存復(fù)蘇的ADSCs同樣具有良好誘導(dǎo)成骨能力。

通過本實驗發(fā)現(xiàn)，冷凍復(fù)蘇的ADSCs其生物學(xué)特性保持穩(wěn)定，成骨誘導(dǎo)性能良好，為骨組織工程ADSCs的大量快速構(gòu)建提供的實驗基礎(chǔ)。此外，ADSCs更長期冷凍復(fù)蘇后否仍能夠保持其良好的形態(tài)及生長特性，復(fù)蘇后ADSCs經(jīng)更多次傳代是否仍具有成骨分化潛能，尚需今后進一步研究。

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