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        miRNA-138調(diào)控卵巢上皮癌細(xì)胞對順鉑敏感性的機(jī)制研究

        2018-03-05 09:05:07周宏博桂藝方
        關(guān)鍵詞:熒光素酶卵巢癌上皮

        周宏博,桂藝方

        (牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院 1.腫瘤科,2.檢驗科,黑龍江 牡丹江 157011)

        卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer,EOC)鉑耐藥的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[1]。EOC鉑耐藥的產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜,目前仍不甚清楚。microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用,參與多種生理及病理過程[2-3]。文獻(xiàn)報道,miRNA-138在宮頸癌和膀胱癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲中發(fā)揮重要作用[4-5],其在卵巢上皮癌中的表達(dá)及作用仍不清楚。研究顯示SIRT1可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性[6],而生物信息學(xué)預(yù)測顯示SIRT1是miRNA-138的靶基因,因此本研究假設(shè)miRNA-138可通過SIRT1調(diào)節(jié)卵巢上皮癌細(xì)胞對順鉑化療的敏感性,為卵巢上皮癌鉑耐藥的產(chǎn)生機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

        1 資料與方法

        1.1 研究對象

        選取2014年1月-2017年1月在牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院婦科就診的EOC患者80例為研究對象。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn),患者知情同意并簽署知情同意書。

        1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①既往無其他惡性腫瘤病史或自身免疫性疾病;②在本院首次接受治療或確診的EOC患者;③經(jīng)分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)手術(shù)治療;④經(jīng)病理檢查確診為EOC;⑤術(shù)后需行鉑為基礎(chǔ)的規(guī)范化療;⑥有完整的臨床資料,可進(jìn)行隨訪(包括腫瘤復(fù)發(fā)時間和總生存期)。

        1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并嚴(yán)重肝腎功能障礙者;②合并不能控制的高血壓、高血糖或嚴(yán)重心臟疾病者。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(national comprehensive cancer network,NCCN)指南中對EOC鉑敏感和鉑耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)[7]將所有EOC患者分為鉑敏感組和鉑耐藥組(鉑敏感:初次接受鉑類藥物化療,停藥后復(fù)發(fā)時間>6個月或不復(fù)發(fā);鉑耐藥:初次接受鉑類藥物化療,停藥后6個月內(nèi)復(fù)發(fā))。其中鉑耐藥組患者30例。年齡32~68歲,平均(52.7±6.2)歲;漿液性卵巢癌15例、黏液性卵巢癌9例、子宮內(nèi)膜樣癌6例;早期(Ⅰ/Ⅱ)15例、晚期(Ⅲ/Ⅳ)15例。鉑敏感組患者40例。年齡28~72歲,平均(54.5±8.1)歲;漿液性卵巢癌18例、黏液性卵巢癌12例、子宮內(nèi)膜樣癌10例;早期(Ⅰ/Ⅱ)25例、晚期(Ⅲ/Ⅳ)15例。兩組患者年齡、腫瘤類型及分期比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

        1.2 儀器和試劑

        高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf)、Nano Drop 2000(美國Thermo Scientific)普通PCR儀(美國Bio-Rad)、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)儀(上海風(fēng)嶺);電泳儀、電轉(zhuǎn)儀及凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad);Trizol RNA提取試劑、Fast Quant RT Kit (With gDNase)、Fast Fire qPCR Pre Mix(SYBR Green)(天根公司)、miRNA-138及U6引物[上海生工(生物)工程股份有限公司]、蛋白提取試劑盒(凱基公司)、SIRT1抗體及HRP標(biāo)記二抗(美國Abcam公司),ECL發(fā)光液(美國Thermo Fisher公司)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒E1910(美國Promega公司)。

        1.2.1 qRT-PCR檢測所有患者卵巢上皮癌組織中miRNA-138和沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1)miRNA的表達(dá)水平 Trizol提取卵巢上皮癌組織中的總RNA,按Fast Quant RT Kit說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min;95℃變性5 s,60℃退火10 s,72℃延伸15 s(采集熒光),重復(fù)40個循環(huán);熔解曲線分析。結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增反應(yīng)線性梯度良好,熔解曲線峰形單一,無雜峰,說明引物特異性良好。SIRT1相對表達(dá)水平以GAPDH的表達(dá)水平為參照,根據(jù)目的基因的相對表達(dá)量=2-△△Ct計算SIRT1 miRNA的表達(dá)變化。MiRNA-138相對表達(dá)水平以U6的表達(dá)水平為參照,與上述計算方法相同,計算miRNA-138的表達(dá)變化。

        1.2.2 Western blot檢測所有患者卵巢上皮癌組織中SIRT1蛋白的表達(dá)水平 將卵巢上皮癌組織勻漿后,按蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白并定量。加入Loading Buffer混勻,100℃ 5 min使蛋白變性。取10 μl蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳,切取約43和81 kD位置的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作,觀察蛋白Maker的轉(zhuǎn)移效率并采用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h,分別與anti-SIRT1和anti-β-actin 4℃孵育過夜。PBST洗膜3次后與HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵育2 h,PBST洗膜3次后于凝膠成像分析儀上成像并分析條帶灰度值。以β-actin表達(dá)量為參照,計算SIR1與β-actin的比值并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

        1.2.3 miRNA-138 mimic、inhibitor及SIRT1 3'-UTR野生型及突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取約1×106個細(xì)胞均勻鋪于6孔板中,設(shè)置對照組(Negative Control,NC)、miRNA-138 mimic組、miRNA-138 inhibitor組,共轉(zhuǎn)miRNA-138 mimic與SIRT1 3'-UTR野生型質(zhì)粒組及共轉(zhuǎn)miRNA-138 mimic與SIRT1 3'-UTR突變型質(zhì)粒組,采用LipoTM2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗分析,熒光素酶活性分析采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書,按步驟操作即可。

        1.2.4 MTT檢測SKOV3細(xì)胞對順鉑的敏感性 將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液,在96孔板中加入細(xì)胞懸液100 ml/孔(約 1×104),37℃、5% 二氧化碳 CO2環(huán)境培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)液,分別加入普通培養(yǎng)液及含順鉑的培養(yǎng)液,每組8孔,孵育48 h后,除去培養(yǎng)液,每孔加50 ml 1×MTT,37℃孵育4 h,除去上清液,每孔加150 ml DMSO,搖勻后用酶標(biāo)儀測定550 nm波長處各孔的吸光度。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用Students’t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 卵巢上皮癌組織中miRNA-138和SIRT1的表達(dá)變化

        圖1 卵巢上皮癌組織中miRNA-138和SIRT1的表達(dá)變化

        與順鉑敏感組比較,鉑耐藥組miRNA-138的表達(dá)水平降低(t=2.752,P=0.0332),而SIRT1的表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(miRNA:t=7.126,P =0.000;蛋白:t=5.468,P=0.000),見圖1。

        2.2 miRNA-138和SIRT1的差異表達(dá)對卵巢上皮癌順鉑化療敏感性的影響

        過表達(dá)miRNA-138后,SIRT1 miRNA的 表達(dá)水平降低,細(xì)胞活力亦降低即對順鉑敏感性升高,而抑制miRNA-138后,SIRT1 miRNA的表達(dá)水平則升高,細(xì)胞活力亦升高即對順鉑敏感性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(miRNA-138:F=61.99,P =0.000;SIRT1 miRNA :F=126,P =0.000;吸光度:F=56.93,P =0.000),見圖 2A~C。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,miRNA-138與SIRT1 3'-UTR區(qū)有可能結(jié)合位點,見圖2D。構(gòu)建攜載SIRT1 mRNA 3'-UTR野生型(wild)和突變型(mut)的pGL3重組螢光素酶報告基因質(zhì)粒與miRNA-138 mimic共轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞,雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析熒光素酶活性。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染SIRT1 miRNA 3'-UTR野生型載體后熒光素酶活性降 低(t=4.894,P=0.000),而轉(zhuǎn)染 SIRT1 miRNA 3'-UTR突變型載體后,熒光素酶活性無變化(t=0.3221,P=0.7511),見圖 2E。

        圖2 miRNA-138通過SIRT1調(diào)控卵巢上皮癌細(xì)胞對鉑的敏感性

        3 討論

        卵巢上皮癌發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速,是目前致死率最高的婦科惡性腫瘤,每年可導(dǎo)致全球125 000人死亡[8]。至少約20%的卵巢上皮癌患者對一線化療藥物天然耐藥,而化療耐藥是導(dǎo)致卵巢上皮癌治療失敗,腫瘤復(fù)發(fā)及死亡率居高不下的重要原因之一[9]。因此,尋找卵巢上皮癌癌細(xì)胞耐藥的靶點,闡明其耐藥產(chǎn)生機(jī)制是目前亟待解決的問題。

        miRNAs種類繁多,在各種組織中廣泛表達(dá),具有重要的生理學(xué)調(diào)控作用,其表達(dá)異??蓪?dǎo)致多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。CHEN等[10]發(fā)現(xiàn),miRNA-130a與卵巢上皮癌鉑耐藥密切相關(guān);CUI等[11]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-146a可通過減少SOD2的產(chǎn)生抑制卵巢癌上皮癌細(xì)胞增殖并增強其對化療的敏感性;WEI等[12]報道m(xù)iRNA-551b可通過下調(diào)Foxo3和TRIM31的表達(dá)介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲及耐藥的發(fā)生。以上文獻(xiàn)提示miRNAs在卵巢上皮癌順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。

        SIRT1是sirtunis家族一員,是一種組蛋白去乙?;福渌閷?dǎo)的生理過程包括轉(zhuǎn)錄沉默、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和氧化應(yīng)激等[13]。組蛋白乙?;且环N表觀遺傳學(xué)修飾方式,該修飾可通過改變組蛋白二級結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄因子更易于與基因啟動子區(qū)結(jié)合,而組蛋白去乙?;瘎t使轉(zhuǎn)錄因子難以與基因啟動子區(qū)結(jié)合,從而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用。研究報道,SIRT1通過改變腫瘤細(xì)胞的線粒體代謝參與順鉑耐藥的產(chǎn)生[14]。同時SIRT1也是一種DNA修復(fù)基因。而順鉑是一種細(xì)胞周期非特異性抗癌化療藥物,可結(jié)合腫瘤細(xì)胞DNA上的堿基,使DNA分子形成鏈內(nèi)和鏈間的交叉鍵聯(lián),從而抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成與修復(fù)。因此SIRT1可能通過修復(fù)腫瘤細(xì)胞的DNA對抗順鉑。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示SIRT1是miRNA-138的靶基因,因此本研究假設(shè)miRNA-138可能通過調(diào)控SIRT1的表達(dá)參與卵巢上皮癌順鉑耐藥。研究結(jié)果顯示,過表達(dá)miRNA-138后,SIRT1 miRNA的表達(dá)水平降低,細(xì)胞活力亦降低,即對順鉑敏感性升高;而抑制miRNA-138后,SIRT1 miRNA的表達(dá)水平則升高,細(xì)胞活力亦升高,即對順鉑敏感性降低,有差異。因本研究對細(xì)胞的處理只有過表達(dá)或敲減miRNA-138的表達(dá)和加入藥物順鉑,而過表達(dá)或敲減miRNA-138并不影響細(xì)胞活力。因此,若細(xì)胞活力發(fā)生變化則為對順鉑的敏感性發(fā)生改變。miRNA主要通過與靶基因miRNA 3'-UTR區(qū)相互作用調(diào)控基因的表達(dá)。因此,筆者構(gòu)建攜載SIRT1 miRNA 3'-UTR野生型和突變型螢光素酶報告基因質(zhì)粒與miRNA-138 mimic共轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞,采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析熒光素酶活性。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染SIRT1 miRNA 3'-UTR野生型載體后熒光素酶活性降低,而轉(zhuǎn)染SIRT1 miRNA 3'-UTR突變型載體后,熒光素酶活性無變化,說明miRNA-138可結(jié)合到SIRT1 miRNA 3'-UTR區(qū)并調(diào)控其表達(dá)。

        綜上所述,miRNA-138可能通過SIRT1調(diào)控卵巢上皮癌細(xì)胞對鉑類藥物的敏感性,因此miRNA-138可作為卵巢上皮癌鉑耐藥防治的靶點。

        [1]謝聰, 尹如鐵, 李玉玲, 等. 鉑耐藥和鉑敏感上皮性卵巢癌中ERCC1、survivin蛋白的表達(dá)及臨床應(yīng)用價值[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2011, 42(1): 86-89.

        [2]CHEN J Q, PAPP G, SZODORAY P, et al. The role of microRNAs in the pathogenesis of autoimmune diseases[J]. Autoimmun Rev,2016, 15(12): 1171-1180.

        [3]ALIPOOR S D, ADCOCK I M, GARSSEN J, et al. The roles of miRNAs as potential biomarkers in lung diseases[J]. Eur J Pharmacol, 2016(791): 395-404.

        [4]ZHOU N, FEI D, ZONG S, et al. MicroRNA-138 inhibits proliferation, migration and invasion through targeting hTERT in cervical cancer[J]. Oncol Lett, 2016, 12(5): 3633-3639.

        [5]YANG R, LIU M, LIANG H, et al. miRNA-138-5p contributes to cell proliferation and invasion by targeting Survivin in bladder cancer cells[J]. Mol Cancer, 2016, 15(1): 82.

        [6]CAO B, SHI Q, WANG W. Higher expression of SIRT1 induced resistance of esophageal squamous cell carcinoma cells to cisplatin[J]. J Thorac Dis, 2015, 7(4): 711-719.

        [7]AJANI, JAFFER & AD’AMICO, THOMAS & A HAYMAN, et al. NCCN clinical practice guidelines in oncology: rectal cancer(Version 2)[J]. Journal of the National Comprehensive Cancer Network, 2009(1): 28-39.

        [8]Sankaranarayanan, R & Ferlay. Worldwide burden of gynecological cancer: The size of the problem[J]. Best practice & research.Clinical obstetrics & gynaecology, 2016(20): 207-25.

        [9]劉玲. miRNA-mRNA差異表達(dá)與卵巢上皮癌多藥耐藥關(guān)系的研究[D]. 南寧: 廣西醫(yī)科大學(xué), 2014.

        [10]CHEN C, WANG H J, YANG L Y, et al. Expression of MiR-130a in serum samples of patients with epithelial ovarian cancer and its association with platinum resistance[J]. Journal of Sichuan University (Medical Science Edition), 2016, 47(1): 60-63.

        [11]CUI Y, SHE K, TIAN D, et al. miR-146a Inhibits proliferation and enhances chemosensitivity in epithelial ovarian cancer via reduction of SOD2[J]. Oncol Res, 2016, 23(6): 275-282.

        [12]WEI Z, LIU Y, WANG Y, et al. Downregulation of Foxo3 and TRIM31 by miR-551b in side population promotes cell proliferation, invasion, and drug resistance of ovarian cancer[J].Med Oncol, 2016, 33(11): 126.

        [13]林琴琴, 馬雪, 林蓉, 等. 組蛋白去乙酰化酶Sirt1與心血管系統(tǒng)疾病[J]. 中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志, 2011, 39(6): 601-606.

        [14]LIANG XJ1, FINKEL T, SHEN D W, et al. SIRT1 contributes in part to cisplatin resistance in cancer cells by altering mitochondrial metabolism[J]. Mol Cancer Res, 2008, 6(9): 1499-506.

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