趙慧 張學順 戴衍朋 張偉 王雪 孫立立

摘要：為考察炮制對地榆中鞣質(zhì)類成分以及凝血作用的影響，采用紫外可見分光光度法測定地榆中鞣質(zhì)含量，采用UPLC法測定地榆中沒食子酸、鞣花酸含量。結(jié)果表明，隨著炮制程度的加重，總鞣質(zhì)含量呈下降趨勢，沒食子酸先升高后降低，而鞣花酸呈上升趨勢;體外抗凝血試驗表明，凝血作用以炮制適中的地榆炭為最佳。

關(guān)鍵詞：地榆;炮制;鞣質(zhì);沒食子酸;鞣花酸;凝血作用

中圖分類號：S567.23+9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）12-0127-05

中藥地榆始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，是薔薇科地榆屬植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）或長葉地榆[Sanguisorba officinalis L. var. longifolia （Bert.） Yü et Li]的干燥根[1]。地榆生品以涼血解毒為主，用于血痢經(jīng)久不愈、燙傷、皮膚潰爛、濕疹、癰腫瘡毒等;炒炭炮制后，以收斂止血力勝，用于便血、痔瘡出血、崩漏下血等，各種出血證均可選用[2]。

地榆主要化學成分為鞣質(zhì)和三萜類化合物，此外還有黃酮類、蒽醌類化合物[3，4]。一般認為鞣質(zhì)是地榆止血作用的主要活性成分[5-7]，但炮制后鞣質(zhì)成分含量變化以及止血作用報道不一[8-12]，本研究對生地榆以及不同炮制程度地榆炭的總鞣質(zhì)、沒食子酸、鞣花酸含量進行測定，結(jié)合凝血作用的藥效試驗分析了炮制程度對地榆鞣質(zhì)含量和止血作用的影響，為地榆炒炭止血的炮制原理解析提供數(shù)據(jù)支撐。

1?材料與方法

1.1?供試材料

1.1.1?試驗儀器?Waters H-Class UPLC全自動高效液相色譜儀（含PDA檢測器）;XS205D（1/100 000）電子天平（梅特勒托利多）;UV-2550紫外-可見分光光度儀（島津）;HZS-H水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）;LC-350A型超聲波中藥處理機（濟寧市魯超超聲設備有限公司）;數(shù)字恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）;Multiskan FC酶標儀（賽默飛世爾）。

1.1.2?試藥與試劑

沒食子酸對照品（批號：110831-201302）購自中國藥品生物制品檢定所;鞣花酸對照品（批號：10149850），購于美國阿法埃莎（Alfa Aesar）。

乙腈（色譜純），購于美國默克;磷酸（色譜純），購于天津科密歐化學試劑有限公司;色譜用水為蒸餾水（屈臣氏）;甲醇、95%乙醇、鉬酸鈉、硫酸鋰、溴、鹽酸、無水碳酸鈉、干酪素、氯化鈣均為分析純。

地榆飲片產(chǎn)地甘肅，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學藥學院中藥資源研究室林慧彬研究員鑒定，為薔薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）的干燥根。

1.2?試驗方法

1.2.1?不同炮制程度地榆樣品的制備

取凈地榆片300 g置預熱的炒鍋內(nèi)，炒制不同時間，制備不同炮制程度地榆炭（表1）。

1.2.2?地榆及地榆炭中總鞣質(zhì)測定?（1）對照品溶液的制備：精密稱取沒食子酸對照品50.0 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含沒食子酸0.05 mg）。

（2）標準曲線的制備：精密量取對照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水12.0、11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應的試劑為空白，采用紫外可見分光光度法，在760 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=118.54x+0.0298，r=0.998。說明沒食子酸在0～0.0101 mg/mL線性關(guān)系良好。

（3）供試品溶液的制備：稱取樣品粉末（過四號篩）0.4 g，置250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置使固體物沉淀，過濾，棄去初濾液50 mL，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得。

（4）鞣質(zhì)含量測定：先精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照“標準曲線的制備”項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起，加水10 mL，依法測定吸光度，從標準曲線中讀取供試品溶液中沒食子酸的量（mg），計算，即得總酚量。

再精密量取供試品溶液25 mL，加至盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起，加水10 mL，依法測定吸光度，從標準曲線中讀取供試品溶液中沒食子酸的量（mg），計算，即得未被吸附的多酚量。

鞣質(zhì)含量=總酚量-未被吸附的多酚量

1.2.3?地榆及地榆炭中游離沒食子酸和鞣花酸的測定?（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）;流動相：A乙腈，B為0.1%磷酸溶液（0～0.7 min，A 1.5%→4.0%;0.7～1.7 min，A 4.0%→30.0%;1.7～3.5 min，A 30.0%→40.0%;3.5～5.0 min，A 40%→50%）。流速0.6 mL/min;柱溫35℃。波長270/252 nm。進樣量0.5 μL。在上述色譜條件下，沒食子酸、鞣花酸對照品和供試品的色譜圖。

（2）溶液制備：分別精密稱取沒食子酸、鞣花酸對照品適量，加甲醇溶解，制成每毫升含沒食子酸0.10 mg、鞣花酸0.45 mg的溶液，即得對照品溶液。

精密稱取地榆粉末（過四號篩）0.2 g，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理40 min，放涼，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

（3）線性關(guān)系考察：分別吸取不同體積的沒食子酸對照品溶液，注入高效液相色譜中，測定，以對照品進樣質(zhì)量（μg）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制出校正曲線，Y=5078154X-2979.6，R2=0.9999，表明沒食子酸進樣量在0.0198～0.2376 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

分別吸取不同體積鞣花酸對照品溶液，注入高效液相色譜中，測定，以對照品進樣質(zhì)量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制出校正曲線，Y=9175392X+9142.6，R2 = 0.9997，表明鞣花酸進樣量在0.0123～0.1848 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

（4）精密度試驗：按本試驗色譜條件，將沒食子酸和鞣花酸對照品溶液重復進樣6次，每次0.5 μL，測定沒食子酸的峰面積RSD為0.77%，鞣花酸的峰面積RSD為0.39%，表明精密度良好。

（5）穩(wěn)定性試驗：按本試驗色譜條件，取供試品溶液，室溫條件下，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣并進行分析，測定峰面積。結(jié)果沒食子酸在24 h內(nèi)峰面積RSD為0.92%，鞣花酸為0.84%，表明該供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（6）重復性試驗：精密稱取同一批次的地榆樣品粉末6份，制備供試品溶液，精密吸取一定量的供試品溶液注入液相色譜儀，

按本試驗色譜條件測定，計算沒食子酸和鞣花酸含量。結(jié)果沒食子酸和鞣花酸的含量分別為0.66%和0.89%，RSD分別為2.22%和2.17%，表明方法重復性良好。

（7）加樣回收率：精密稱取已知含量的地榆樣品6份，分別加入沒食子酸和鞣花酸對照品溶液適量，制備供試品溶液，按本試驗色譜條件測定峰面積，計算沒食子酸和鞣花酸的平均加樣回收率，結(jié)果見表2。

（8）樣品測定：稱取地榆樣品粉末，制備供試品溶液，按本試驗色譜條件，測定峰面積并計算各樣品中游離沒食子酸和鞣花酸的含量，見表3。

1.2.4?地榆及地榆炭凝血作用測定

采集正常人抗凝血漿，加入不同炮制程度地榆提取液和鈣離子，在鈣離子的作用下血液開始凝固，按照預定時間用去離子水流注，收集流注液，用紫外分光光度計測流注液中游離血紅蛋白的吸光度值（OD），描繪凝血時間值曲線圖，觀察值隨時間的變化情況，以判定被測樣品對凝血因子的激活程度。

通過預試驗發(fā)現(xiàn)，地榆提取液與抗凝血接觸后10 min開始出現(xiàn)凝血現(xiàn)象直至15 min，因此本試驗取10 min和15 min兩個時間點進行測定。

（1）抗凝血的采集：靜息狀態(tài)下抽取健康志愿者肘靜脈血液，棄去針管前部0.5 mL血液，防止針頭被組織污染，其余血液與38 g/L枸櫞酸鈉按1∶9體積比混勻。

（2）體外凝血試驗：用1 000 μL移液器吸取各炮制程度地榆提取液

250 μL于燒杯中，空白組加入250 μL蒸餾水;吸取80 μL抗凝血漿、

25 μL氯化鈣溶液于各組燒杯中，混勻，啟動計時器，10 min和15 min時分別用 10 mL蒸餾水沿燒杯壁緩緩流注液體表面，輕輕搖晃后靜置

10 min。

吸取流注液于比色皿中，用酶標儀在540 nm處測定每份流注液中血紅蛋白的吸光度。

2?結(jié)果與分析

2.1?鞣質(zhì)類成分測定結(jié)果

由表3可知，總鞣質(zhì)、沒食子酸、鞣花酸成分變化趨勢不同：生地榆中鞣質(zhì)含量達14.7%，炮制后鞣質(zhì)含量呈顯著下降趨勢;生地榆中沒食子酸含量為2.38%，炮制后含量隨制炭程度加重先增加后降低，炮制適中時較高;而生地榆中鞣花酸含量最低，為3.71%，其含量隨炮制程度的加重而增加，在過重的地榆炭中，其含量增加至7%左右。

2.2?體外凝血試驗結(jié)果

表4表明不同的炮制程度對地榆凝血活性具有較大影響。各組在5 min內(nèi)血紅蛋白的吸光度都明顯降低，表明出現(xiàn)了加速凝血的作用。地榆炭3和4樣品（炮制程度適中）在5 min內(nèi)血紅蛋白的吸光度變化率最高，表現(xiàn)出較強的促凝血作用;而地榆炭5和6樣品（炮制程度重）在5 min內(nèi)血紅蛋白的吸光度變化率較低，表明其凝血作用較弱。生品和炮制程度較輕的樣品，也具有一定促凝血作用，但弱于炮制程度適中的地榆炭。

3?討論與結(jié)論

明朝陳家謨于《本草蒙荃》中說“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過則氣味反失”。凝血試驗結(jié)果表明炮制適中的地榆具有較強的凝血活性，因此適當?shù)呐谥瞥潭却_是中藥發(fā)揮作用的重要因素。

一般認為地榆鞣質(zhì)是其止血作用的主要活性成分[5]，通過對不同炮制程度地榆炭中鞣質(zhì)含量測定以及凝血活性的研究發(fā)現(xiàn)，總鞣質(zhì)與凝血作用無正相關(guān)關(guān)系;前期試驗結(jié)果以及文獻報道也顯示大分子的單寧酸止血作用較差，而沒食子酸和鞣花酸具有較好的止血活性[6，7]，因此曾推測小分子的鞣質(zhì)類成分可能與地榆止血功效有較大相關(guān)性。本試驗結(jié)果顯示，沒食子酸與凝血活性變化的趨勢相似，沒食子酸可能是其促凝止血的主要活性成分之一;而鞣花酸與之差別較大，其原因可能與鞣花酸的水溶性較差有關(guān)。

參?考?文?獻：

[1]?國家藥典委員會. 中國藥典（一部）[K]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 葉定江，張世臣，吳皓. 中藥炮制學[M].第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：303.

[3] 夏紅旻，孫立立，孫敬勇，等.地榆化學成分及藥理活性研究進展[J]. 食品與藥品，2009，11（7）：67-69.

[4] 戴衍朋，袁振海，石典花，等. 地榆炮制前后化學成分變化的研究[C]∥中華中醫(yī)藥學會中藥炮制分會2009年學術(shù)研討會論文集.2009.

[5] 姜云梅，楊五禧，吳立軍. 中藥地榆化學成分的研究[J]. 西北藥學雜志，1993， 8（1）：17-19.

[6] 李素琴，袁其朋，徐健梅. 鞣花酸的生理功能及工藝開發(fā)研究現(xiàn)狀[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13（5）：1-74，79.

[7] 包貝華，張麗，丁安偉. 中藥止血成分的研究進展[J]. 中草藥，2009，40（8）：1324-1327.

[8] 趙偉康，洪筱坤，倪黎平.對炒炭止血藥炮制前后所含鞣質(zhì)的分析[J].上海中醫(yī)藥雜志，1963（7）：39-40.

[9] 陳新玉，李健和，黎銀波，等. 地榆、地榆片、地榆炭的質(zhì)量標準研究[J].中國醫(yī)藥導報，2011，8（17）：64-67.

[10]龔躍新，何啟章，駱美玲，等. 20 種中藥炒炭前后的鞣質(zhì)含量測定[J]. 中國中藥雜志，1991，16（11）：664-665.

[11]陳旭. 地榆炭的炮制質(zhì)量控制研究[J]. 中國熱帶醫(yī)學，2009，9（5）：971-972.

[12]郭淑艷，賈玉良，徐美術(shù). 地榆炒炭前后止血作用的研究[J]. 中醫(yī)藥學報，2001，29（4）：28.