布日額，王金良，吳金花，錫林高娃，陳金龍，孫立杰，王 華

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)乳源性致病菌防控工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼028043；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼028043；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 乳源性致病菌研究所，內(nèi)蒙古 通遼028043；5.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州256600)

奶牛隱性乳腺炎(Bovine mastitis，BM)是危害奶牛乳腺健康的主要疾病之一，該病不僅造成奶牛產(chǎn)奶量的下降，更引起牛奶質(zhì)量的大幅度降低。針對(duì)臨床型BM通常的治療方法是利用抗生素，但已造成許多具有廣譜抗藥性的乳腺炎無(wú)乳鏈球菌不斷被報(bào)道[1-2]，而且牛奶中抗生素殘留對(duì)人類健康也造成不良影響。

無(wú)乳鏈球菌屬B群鏈球菌(Group BStreptococcus agalactea，GBS)，是引起B(yǎng)M的重要致病菌，該菌也對(duì)嬰幼兒危害嚴(yán)重，給人畜公共衛(wèi)生安全帶來(lái)極大的隱患[3-4]。傳統(tǒng)的乳腺炎疫苗多為全菌滅活苗或者減毒活疫苗，全菌滅活苗中抗原成分復(fù)雜，具有較大的毒性，而且免疫效果欠佳；而乳腺炎減毒活疫苗臨床很容易出現(xiàn)毒力返強(qiáng)而引起發(fā)病?；蚬こ虂唵挝灰呙缗c傳統(tǒng)疫苗相比克服了以上缺點(diǎn)，具有安全性好和純度高的優(yōu)點(diǎn)，因此研究乳腺炎主要致病菌的重組基因工程亞單位疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。無(wú)乳鏈球菌具有類似大腸桿菌的菌毛樣結(jié)構(gòu)，菌毛骨架蛋白(Bone protein,BP)、輔助蛋白1(Anciliary protein 1，AP1)和AP2，是編碼菌毛島嶼的3個(gè)有效保守性抗原組分，具有良好的抗原性及一定的免疫保護(hù)性，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上將不同組合的菌毛島嶼融合蛋白AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2及AP1-BP-AP2對(duì)小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，以篩選和明確最佳抗原組合方式，為研發(fā)有效的基因工程乳腺炎疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 臨床分離Ia型致病性無(wú)乳鏈球菌(ID50為104cfu/mL)，AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合純化抗原為內(nèi)蒙古自治區(qū)乳源性致病菌防控工程技術(shù)研究中心構(gòu)建備存[5-7]；100只BALB/c小鼠由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，SCXK(魯)20110003；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、羊抗鼠IgG-HRP為北京中生瑞泰科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 不同融合抗原免疫制劑的制備 采用BCA法檢測(cè)AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合純化抗原濃度并準(zhǔn)確稀釋至2.0 mg/mL，參照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》，將不同融合抗原與同體積的弗氏佐劑進(jìn)行乳化(包括完全佐劑與不完全佐劑)，制備AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合抗原免疫制劑，經(jīng)檢測(cè)無(wú)菌后經(jīng)皮下注射BALB/c小鼠(0.5 mL/只)觀察2周無(wú)異常狀況后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小鼠分組及免疫程序 取30只小鼠，每只小鼠于實(shí)驗(yàn)第0、7 d、14 d、28 d皮下注射AP1-AP2融合抗原免疫制劑50μL(抗原含量為50μg)，每次免疫前及首免后第35 d、42 d、49 d隨機(jī)采血制備血清。AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合抗原制劑的免疫操作同AP1-AP2融合抗原免疫制劑。對(duì)照組以生理鹽水代替融合抗原免疫制劑進(jìn)行試驗(yàn)，每只小鼠注射50μL生理鹽水，具體操作同實(shí)驗(yàn)組。

1.4 小鼠免疫血清抗體水平檢測(cè) 以純化的AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融 合 抗原作為包被抗原，通過(guò)方陣滴定法優(yōu)化了每種抗原ELISA最佳工作條件，建立檢測(cè)免疫抗體水平的間接ELISA方法，免疫前制備的24份小鼠陰性血清用于臨界值確定，以第0、7 d、14 d、28 d、35 d、42 d、49 d采集的血清為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP抗體為二抗，利用該ELISA方法檢測(cè)免疫抗體水平與最終效價(jià)，分析抗體消長(zhǎng)規(guī)律，并評(píng)估哪種融合抗原免疫后的抗體效價(jià)為最佳。

1.5 免疫保護(hù)試驗(yàn) 于免疫后第50 d，從4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別各取20只小鼠，從對(duì)照組取20只小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。以0.5 mL/只小鼠腹腔注射Ia型致病性無(wú)乳鏈球菌(2×104cfu/mL)，連續(xù)觀察7 d小鼠狀況，統(tǒng)計(jì)每組小鼠的發(fā)病率P(P=每組發(fā)病小鼠數(shù)量/每組小鼠總數(shù)×100 %)，計(jì)算免疫保護(hù)指數(shù)PI，PI=(攻毒對(duì)照組發(fā)病率-融合抗原免疫組發(fā)病率)/攻毒對(duì)照組發(fā)病率×100 %。

2 結(jié)果

2.1 小鼠免疫血清抗體水平及效價(jià)檢測(cè)

2.1.1 小鼠抗體水平的ELISA檢測(cè)方法的建立經(jīng)優(yōu)化后每種抗原的最佳工作濃度均為5.0μg/mL，最佳工作條件為4℃12 h；以10 %小牛血清為封閉液，于37℃最佳封閉時(shí)間為2 h；樣本血清最佳稀釋度為1∶100倍，37℃最佳作用時(shí)間為1 h；酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)1∶4 000倍，37℃最佳作用時(shí)間為1 h；TMB為底物顯色液，室溫顯色時(shí)間為15 min。

用以上檢測(cè)條件使用AP1-AP2包被板對(duì)24份小鼠的陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，收集數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算陰性血清OD450nm平 均 值X=0.2320，標(biāo) 準(zhǔn) 方 差SD為0.03426，臨界值為X+3SD，即當(dāng)OD450nm值≥0.3348判為陽(yáng)性。以該方法對(duì)AP1-AP2抗原免疫組免疫后第0、7 d、14 d、28 d、35 d、42 d、49 d采集的血清進(jìn)行抗體水平檢測(cè)。以同樣的方法計(jì)算AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2融合抗原ELISA檢測(cè)方法的臨界值分別為0.3445、0.3389和0.3317。

2.1.2 小鼠抗體水平檢測(cè)AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2 4種融合抗原分別經(jīng)4次免疫小鼠后，利用上述ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示，各組小鼠均產(chǎn)生了較高水平的抗體，其中AP1-BP-AP2融合抗原產(chǎn)生的抗體水平為最高(圖1)。表明AP1-BP-AP2融合抗原更容易刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。

圖1 4種融合抗原誘導(dǎo)小鼠抗體水平檢測(cè)Fig.1 Detection of antibody levels in the mice immunized by four kinds of fusion antigens

2.1.3 融合蛋白免疫組小鼠抗體效價(jià)檢測(cè)經(jīng)過(guò)4次免疫小鼠后35 d及49 d AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2融合抗原產(chǎn)生的抗體效價(jià)經(jīng)檢測(cè)，結(jié)果顯示均為1∶12 800，AP1-BP-AP2融合抗原產(chǎn)生的血清抗體效價(jià)為1∶25 600(圖2)，相同免疫條件下AP1-BPAP2融合抗原刺激小鼠產(chǎn)生抗體效價(jià)高于AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2融合抗原，表明該組合融合抗原的抗原性為最佳。

圖2 間接ELISA檢測(cè)AP1-AP2(A)、AP1-BP(B)、BP-AP2(C)及AP1-BP-AP2(D)血清抗體效價(jià)Fig.2 Detection of AP1-AP2(A),AP1-BP(B),BP-AP2(C)and AP1-BP-AP2(D)serum antibody titer by indirect ELISA

2.2 免疫保護(hù)試驗(yàn) 免疫后第50 d攻毒，發(fā)病小鼠出現(xiàn)精神沉郁、扎堆、不喜歡運(yùn)動(dòng)、飲食減少甚至絕食現(xiàn)象。攻毒48 h后各組小鼠發(fā)病數(shù)量達(dá)到最高，抗原免疫組小鼠發(fā)病數(shù)量明顯低于攻毒對(duì)照組，計(jì)算每組小鼠的免疫保護(hù)指數(shù)PI結(jié)果顯示，4種重組抗原對(duì)小鼠均有一定的免疫保護(hù)性，其中以AP1-BP-AP2重組抗原對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果最佳，其免疫保護(hù)指數(shù)PI達(dá)到80 %(表1)。表明AP1-BPAP2重組抗原可以作為牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌亞單位疫苗的候選抗原。

表1 小鼠的免疫攻毒試驗(yàn)Table 1 The protection of the immunized mice against challenging with S.agalactiae

3 討論

細(xì)菌菌毛(pili)是大腸桿菌等許多革蘭氏陰性菌及牛棒狀桿菌等少數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌菌體表面的附屬結(jié)構(gòu)，是與細(xì)菌的黏附、侵襲力密切相關(guān)的重要致病因子，具有良好的抗原性[8]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)無(wú)乳鏈球菌也具有類大腸桿菌的菌毛樣結(jié)構(gòu)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)無(wú)乳鏈球菌菌毛開展了一些相關(guān)研究[9]。Rosini等對(duì)裝配菌毛蛋白的菌毛島嶼基因組結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了深入的描述，并指出菌毛狀結(jié)構(gòu)是無(wú)乳鏈球菌重要的毒力因子和潛在的候選疫苗抗原靶位[10]。Konto-Ghiorghi等的研究也證實(shí)，無(wú)乳鏈球菌菌毛在黏附組織上皮細(xì)胞及無(wú)乳鏈球菌生物被膜的形成中發(fā)揮重要作用[11]。Khare等對(duì)菌毛基因的表達(dá)與信號(hào)調(diào)節(jié)進(jìn)行研究，結(jié)果證實(shí)無(wú)乳鏈球菌菌毛在裝配過(guò)程中需要一種叫Sortase的轉(zhuǎn)肽酶，這種酶存在兩種形式Srt A和Srt C，Srt A參與催化菌毛的裝配聚合，Srt C參與細(xì)胞壁聚合物錨固菌毛[12]。Sharma等研究報(bào)道顯示，菌毛蛋白的特異性血清可以抑制88%以上的肺上皮巨噬細(xì)胞感染VII型無(wú)乳鏈球菌[13]。這些成果為無(wú)乳鏈球菌的菌毛亞單位疫苗研究提供了理論支持。另有國(guó)外研究報(bào)道顯示，無(wú)乳鏈球菌分離菌株中至少存在一種菌毛結(jié)構(gòu)基因，并證實(shí)有兩種菌毛島嶼，分別是PI-1和PI-2，在PI-2中有PI-2a和PI-2b兩種，而PI-2a菌毛島嶼檢出比例高達(dá)79%，其次為PI-1菌毛島嶼，所占比例為70%[14]。

本研究利用前期構(gòu)建的PI-2a菌毛島嶼骨架蛋白BP、輔助蛋白AP1、AP2的抗原優(yōu)勢(shì)區(qū)融合蛋白AP1-AP2、AP1-BP、BP-AP2、AP1-BP-AP2免疫小鼠后均產(chǎn)生了不同程度的抗體水平，其中免疫AP1-BP-AP2融合抗原小鼠產(chǎn)生的抗體效價(jià)最高，在免疫后49 d達(dá)到1∶25 600，其免疫保護(hù)指數(shù)PI達(dá)到80%，顯示出良好的免疫保護(hù)效果。本研究首次明確了基于菌毛島嶼亞基基因構(gòu)建的AP1-BP-AP2融合抗原可以作為無(wú)乳鏈球菌的菌毛亞單位抗原，為進(jìn)一步開發(fā)防控?zé)o乳鏈球菌性牛乳腺炎的亞單位疫苗及其流行病學(xué)檢測(cè)試劑盒奠定了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。