楊曉宇，徐 雷，殷鑫歡，張繼宗，魯令華，馮 宇，朱 玲,2*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都611130)

非典型性瘟病毒(Atypical pestivirus，APPV)是近兩年全球范圍內(nèi)流行的一種能夠引起仔豬感染的新型RNA病毒，2015年APPV首次被證實(shí)在美國(guó)豬群的廣泛存在[1]，2016年Arruda等人證明了先天性震顫(Congenital tremor，CT)A-II型是由APPV引起的[2]。迄今為止，德國(guó)、荷蘭、澳大利亞、美國(guó)等多個(gè)國(guó)家先后發(fā)現(xiàn)豬群存在APPV流行[3-4]，并對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立靈敏、特異的檢測(cè)方法，對(duì)于研究APPV的流行和發(fā)展具有非常重要的意義。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)APPV檢測(cè)常用的方法有病毒的分離培養(yǎng)與鑒定、常規(guī)PCR、熒光定量PCR(qPCR)等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)。Schwarz等人通過多種細(xì)胞對(duì)APPV進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過qPCR對(duì)傳代5次的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示APPV分離株在細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒傳播非常低效[5]。因此該病毒的分離鑒定不僅耗時(shí)長(zhǎng)，且細(xì)胞中是否有該病毒的受體、人為操作等因素均將導(dǎo)致其檢出率較低；常規(guī)PCR不能對(duì)核酸進(jìn)行定量分析，且靈敏度不高，由于APPV在機(jī)體組織中的含量較低，常規(guī)PCR方法對(duì)其檢出率極低，目前國(guó)內(nèi)外未有該方法建立的報(bào)道。qPCR因具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，目前國(guó)內(nèi)通過APPV E2基因建立了熒光定量檢測(cè)方法[6]，但由于E2基因變異較大，而NS2基因是控制APPV在機(jī)體內(nèi)復(fù)制且高度保守的重要基因，因此本研究根據(jù)NS2基因設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了APPV NS2基因的RT-PCR檢測(cè)方法，旨在為獸醫(yī)臨床提供一種特異、快速、靈敏、高效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒和病料 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、APPV、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬輪狀病毒(RV)、大腸桿菌(Escherichia coli)的基因組均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心保存；56份病料(小腦、大腦、血清)采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等各市規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑DL2000 DNA Marker、SYBR Green Premix E×TaqⅡ、2×TaqPCR Master Mix均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、pMD19-T載體、質(zhì)粒抽提試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄的APPV(KY624591.1、KU041639.1、LT594521.1、KY475592.1、KY475593.1)相關(guān)序列分析比對(duì)后選取其NS2部分保守序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(5'-TG AAAACGACCTGGTGGAGG-3'/5'-CCTGGGCAGTTC CGTAGTTT-3')，該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 采用特異性的熒光定量引物對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃4 min；95℃30 s、54℃30 s、72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃7 min。利用膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-APPV。陽性克隆由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序分析，測(cè)定并計(jì)算其拷貝數(shù)，以該陽性重組質(zhì)粒作為APPV qRT-PCR的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，和后續(xù)試驗(yàn)的陽性模板。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)方法的建立

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將重組質(zhì)粒pMD19-APPV倍比稀釋為1×103拷貝/μL～1×108拷貝/μL，分別作為模板，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。用優(yōu)化后的qRT-PCR體系及程序進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 特異性試驗(yàn)分別提取PRRSV、CSFV、APPV、PEDV、RV的RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA后利用本實(shí)驗(yàn)建立的qRT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，來評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.5.3 敏感性試驗(yàn)將重組質(zhì)粒pMD19-APPV進(jìn)行連續(xù)10倍的倍比稀釋后分別作為模板，利用所建立的qRT-PCR和本實(shí)驗(yàn)前期建立的普通RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)下限，并將兩種方法進(jìn)行對(duì)比，對(duì)其敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)將重組質(zhì)粒pMD19-APPV進(jìn)行連續(xù)10倍的倍比稀釋，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，利用本試驗(yàn)建立的APPV qRT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，作為組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。將稀釋好的質(zhì)粒在相同條件下反復(fù)進(jìn)行3次獨(dú)立的檢測(cè)，作為組間重復(fù)性試驗(yàn)。采用Ct值分別計(jì)算平均數(shù)、方差和變異系數(shù)，來驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

1.6 臨床樣品的檢測(cè) 將采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等各市規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的56份病料用本實(shí)驗(yàn)建立的qRT-PCR與臨床檢測(cè)常用的常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 以APPV的RNA，用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示得到與目的基因片段大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物。將該目的基因片段克隆至pMD19-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示其與目的基因一致，表明已正確構(gòu)建pMD19-APPV重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒濃度經(jīng)檢測(cè)計(jì)算后為2.8×108拷貝/μL。

2.2 qRT-PCR檢測(cè)條件的優(yōu)化 通過對(duì)反應(yīng)條件和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化后，結(jié)果顯示該方法最佳反應(yīng)體系為10μL：SYBR Green Premix E×TaqⅡ5μL，上、下游引物各0.5μL，模板1μL，水補(bǔ)足至10μL。最佳反應(yīng)條件為：95℃4 min；95℃30 s、54℃30 s、72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線：66℃以0.5℃/s升至95℃。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線分析 用建立的qRT-PCR檢測(cè)各濃度梯度的APPV陽性標(biāo)準(zhǔn)品，該方法在2.8×103拷貝/μL～2.8×108拷貝/μL，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)(R2)為1.00，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.41x+55.83，符合試驗(yàn)預(yù)期(圖1A)。本試驗(yàn)建立的qRT-PCR對(duì)APPV陽性重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線顯示，在熔解溫度Tm為84℃±0.1℃時(shí)出現(xiàn)了唯一的特異性峰，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1B)。表明，建立了檢測(cè)APPV的qRT-PCR方法。

圖1 qRT-PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線Fig.1 Standard curve and melting curve of the qPCR

2.4 特異性試驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)建立的qRT-PCR方法對(duì)PRRSV、CSFV、APPV、PEDV、RV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，除了APPV為陽性外，其余病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性(圖2)。表明該方法特異性較好。

2.5 敏感性試驗(yàn) 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒pMD19-APPV 10倍倍比稀釋后，利用本試驗(yàn)所建立的qRT-PCR與普通RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，普通RT-PCR檢測(cè)病毒的最低濃度為2.8×105拷貝/μL(圖3)，而qRT-PCR檢測(cè)病毒的最低濃度為2.8×103拷貝/μL(圖3)，qRT-PCR的敏感性是普通RT-PCR的100倍。表明該qRT-PCR敏感性較高。

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Amplification plot of the specificity assay

圖3 qPCR與常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity tests of the qPCR and PCR

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 利用本實(shí)驗(yàn)建立的APPV qRTPCR方法進(jìn)行組內(nèi)組間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，組內(nèi)變異系數(shù)小于1.0 %，組間變異系數(shù)小于1.0 %(表1)。表明本試驗(yàn)建立的qRT-PCR方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果 利用本實(shí)驗(yàn)建立的qRT-PCR方法對(duì)采集的56份疑似APPV發(fā)病豬的小腦、血清等病料進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用常規(guī)的RT-PCR對(duì)其檢測(cè)，并對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，在56份疑似病料中，qRT-PCR檢測(cè)5份為APPV陽性，常規(guī)的RT-PCR檢測(cè)3份為APPV陽性，符合率較高。表明本實(shí)驗(yàn)建立的qRT-PCR方法可用于臨床檢測(cè)。

表1 qRT-PCR的重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 The reproducibility test of the qRT-PCR

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立的APPV SYBR GreenⅡqRT-PCR檢測(cè)方法的特異性，靈敏性，重復(fù)性均良好。對(duì)PRRSV、CSFV、APPV、PEDV、RV等臨床常見豬病毒性病原利用該方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)僅APPV為陽性。2015年以來，APPV相繼在全球范圍流行，最近研究顯示我國(guó)APPV在規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)病率約為5 %～6 %[6]，大多數(shù)豬場(chǎng)APPV檢出率在1 %～20 %[6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等各市規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)采集的56從豬病料進(jìn)行檢測(cè)，qRT-PCR檢出5份為APPV陽性，陽性率為8.9 %；常規(guī)的RT-PCR檢出有3份為APPV陽性，陽性率為5.3 %。表明本研究建立的SYBR GreenⅡqRT-PCR檢測(cè)方法更適用于臨床檢測(cè)，同時(shí)也表明我國(guó)也存在APPV感染，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該病的監(jiān)測(cè)與防控。

Gatto等通過對(duì)美國(guó)2016年～2017年采集的597個(gè)精液樣品進(jìn)行檢測(cè)，顯示精液有較高的病毒載量，隨著養(yǎng)殖場(chǎng)人工授精及商業(yè)精液的普及，通過精液傳播感染性病原體是一個(gè)明顯的問題，含有APPV的精液成為APPV傳播的一種潛在途徑[7]。隨著對(duì)APPV的深入研究，發(fā)現(xiàn)該病原的傳播途徑更加多樣，因此建立靈敏、特異、高效的APPV熒光定量方法，對(duì)于豬場(chǎng)防控APPV，增加哺乳仔豬成活率尤為重要?；诒狙芯拷⒌腁PPV SYBR GreenⅡqRT-PCR檢測(cè)方法，也是首次在四川地區(qū)檢測(cè)到了APPV的存在，這為四川地區(qū)APPV流行病學(xué)調(diào)查提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，本研究也為后期APPV的深入研究發(fā)揮重要作用。