馬國(guó)和，高冬生，王 增，楊盼盼，楊 霞，王新衛(wèi)*，邊傳周*，趙 軍*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州450002；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，河南 鄭州450046)

雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科，病毒核酸為雙股DNA。ILTV能夠引起雞的傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis，ILT)，ILT具有高度接觸傳染和急性感染的特征，臨床表現(xiàn)主要為呼吸困難、咳嗽、咳出帶血樣的滲出物，可以引起雞的死亡、結(jié)膜炎、產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)下降，是威脅養(yǎng)雞業(yè)的重要呼吸道傳染病之一。該病傳播迅速，自1925年在美國(guó)被首次報(bào)道以來(lái)，現(xiàn)已遍及世界各個(gè)養(yǎng)雞區(qū)域[1-3]，近年來(lái)該病在我國(guó)多地也呈流行趨勢(shì)，給養(yǎng)雞業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失不可忽視。

建立準(zhǔn)確、快速的現(xiàn)地檢測(cè)方法，是有效防控雞ILT的前提。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立多種ILTV檢測(cè)方法，包括病毒分離鑒定[4]、血清學(xué)檢測(cè)[5]以及基于PCR的核酸檢測(cè)[6-7]方法等，但這些方法均有一定的局限性：病毒分離鑒定耗時(shí)較長(zhǎng)；血清學(xué)檢測(cè)不適于急性感染期的檢測(cè)；PCR方法需要特定的設(shè)備和嚴(yán)格的操作；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)雖然不需要特殊的儀器，但需要設(shè)計(jì)6對(duì)引物，并且對(duì)引物設(shè)計(jì)要求高，反應(yīng)的非特異性也很強(qiáng)。因此，有必要研究和建立快速、簡(jiǎn)便和適用于現(xiàn)地ILTV檢測(cè)的新方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有方法的不足。

重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase ploymerase amplification，RPA)技術(shù)是由英國(guó)的TwistDx Inc公司于2006年研發(fā)的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[8]。該技術(shù)主要依賴重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶，可以在37℃～42℃條件下，實(shí)現(xiàn)對(duì)模板DNA的快速擴(kuò)增；相較于其他的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，RPA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果讀取多元化、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。目前，該技術(shù)在包括細(xì)菌[9]、真菌[10]、病毒[11-12]、寄生蟲[13-14]在內(nèi)的動(dòng)物病原檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法包括瓊脂糖凝膠電泳、基于標(biāo)記探針的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)和依賴于特異性寡核苷酸引物或探針的側(cè)向流試紙條(Lateral flow dipstick，LFD)技術(shù)。LFD檢測(cè)系統(tǒng)需要設(shè)計(jì)末端標(biāo)記的一對(duì)引物，擴(kuò)增反應(yīng)得到的雙標(biāo)記分子即可以?shī)A心的方式在包被有特定抗體的試紙條上進(jìn)行檢測(cè)。迄今尚未見(jiàn)RPA用于檢測(cè)雞ILTV的報(bào)道。

本研究的目的是以RPA技術(shù)為基礎(chǔ)，聯(lián)合膠體金LFD技術(shù)，建立一種在臨床上能夠快速、準(zhǔn)確、特異地檢測(cè)雞ILTV的方法，為雞ILT的有效防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料ILTV HNXY株、雞新城疫病毒(NDV)Lasota株、禽流感病毒(AIV)H9N2亞型HP株、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)Jin13株、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)HQ株、雞白血病病毒(ALV)、雞馬立克病毒(MDV)均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所分離保存；滑液囊支原體(MG)DNA已鑒定陽(yáng)性并由實(shí)驗(yàn)室保存。57份疑似病料樣品為采自臨床疑似傳染性喉氣管炎病雞的咽喉棉拭子。

TwistAmp basic kit購(gòu)自TwistDx Inc公司；TaqDNA Polymerase、SYBR Green Premix ExTaqTM、pMD18-T載體均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA Blood Mini Kit、Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit Plasmid Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司；膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條購(gòu)自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司，該試紙條設(shè)有抗FITC抗體檢測(cè)線和生物素化抗體質(zhì)控線。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與篩選 對(duì)GenBank中登錄的部分ILTV全 基 因 序 列(JX646899.1、KX165320.1、JN804826.1)進(jìn)行比對(duì)，參照TwistDx公司RPA引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)了6對(duì)引物(表1)。利用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取ILTV的基因組DNA作為模板，以TwistAmp basic kit對(duì)RPA引物進(jìn)行篩選。擴(kuò)增反應(yīng)參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，模板100 ng，反應(yīng)條件采用37℃孵育20 min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RPA產(chǎn)物。選擇擴(kuò)增條帶單一的一對(duì)引物，對(duì)上、下游引物5'端分別用異硫氰酸熒光素(FITC)和生物素(Biotin)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記的引物用于后續(xù)的RPA-LFD方法的建立。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成與標(biāo)記。

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以ILTV基因組DNA為模板，利用引物ILTV-3-F/ILTV-3-R擴(kuò)增目的基因，50μL體系：10×Buffer(含Mg2+)5μL、dNTPs(10 mmol/L)1μL、上下游引物(25μM)各1μL、TaqTM聚 合 酶(5 U/μL)0.5μL、模 板DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃30 s、58℃30 s、72℃20 s，30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。將純化后的目的片段克隆到pMD18-T載體構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，測(cè)定核酸含量后按照公式(6.02×1023拷貝數(shù)/摩爾)×(ng/μL×10-9)/(DNA長(zhǎng)度×660)=拷貝/μL換算為其拷貝數(shù)。

表1 用于ILTV檢測(cè)的引物信息Table 1 Primers for ILTV detection

1.4 RPA-LFD方法的建立 為了利用LFD檢測(cè)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物，本研究首先利用5'端分別標(biāo)記FITC和Biotin優(yōu)選RPA引物進(jìn)行一系列RPA條件的優(yōu)化。所有優(yōu)化試驗(yàn)均采用100 ng的ILTV基因組DNA為模板。

對(duì)標(biāo)記引物濃度(1 000 nmol/L、500 nmol/L、250 nmol/L、125 nmol/L、62.5 nmol/L、31.25 nmol/L、15.625 nmol/L、7.8125 nmol/L)，反 應(yīng) 溫度(25℃、27.5℃、30℃、32.5℃、35℃、37.5℃、40℃、42.5℃)，反應(yīng)時(shí)間(2 min 30 s、5 min、7 min 30 s、10 min、12 min 30 s、15 min、17 min 30 s、20 min)進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)體系參照試劑盒進(jìn)行。

所有優(yōu)化試驗(yàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物均通過(guò)膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條檢測(cè)。取5μL RPA擴(kuò)增產(chǎn)物，與95μL Tris緩沖液(25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl和0.05 % Tween-20)在1.5 mL EP管中混勻，將試紙條的偶聯(lián)墊末端垂直插入EP管中，使其接觸混合液，10 min后取出試紙條觀察并拍照記錄結(jié)果，選擇陽(yáng)性樣品出現(xiàn)最強(qiáng)檢測(cè)線和質(zhì)控線而陰性樣品不出現(xiàn)檢測(cè)線僅出現(xiàn)質(zhì)控線時(shí)的條件作為RPA-LFD的優(yōu)化條件。

1.5 特異性試驗(yàn) 利用Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit分別提取NDV、AIV H9N2、IBV、IBDV、ALV的RNA，并采用隨機(jī)引物將其反轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)cDNA。采 用DNA Blood Mini Kit提 取MDV、ILTV、MG基因組DNA。分別取100 ng上述病毒的cDNA或DNA為模板，利用已優(yōu)化的條件進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)，在膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條上檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。驗(yàn)證該方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn) 將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行100拷貝/μL～108拷貝/μL的梯度稀釋，分別以其為模板進(jìn)行RPA、常規(guī)PCR和熒光定量PCR檢測(cè)，并比較三者的敏感性。RPA擴(kuò)增反應(yīng)按照優(yōu)化的條件進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條檢測(cè)。確定該方法的敏感性。

普通PCR和SYBR Green I熒光定量PCR所用引物為依據(jù)非標(biāo)記的優(yōu)化引物，但引物長(zhǎng)度按照普通PCR和SYBR Green I熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)原則與RPA-LFD方法中所用引物進(jìn)行了縮短，序列為F：5'-CTGCCTAAGCGAGGCTCCGCAC-3'/R：5'-C AATTCAGCCGAGGATTTGG-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為151 bp。普 通PCR為50μL體 系：10×Buffer(含Mg2+)5μL、dNTP(10 mmol/L)1μL、上下游引物(20μmol/L)各1μL、TaqTM聚合酶(5 U/μL)0.5μL、模板DNA 1μL，ddH2O補(bǔ)足。程序：95℃5 min；95℃30 s、58℃30 s、72℃20 s，30個(gè)循環(huán)；72℃1 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

SYBR Green I熒光定量PCR為20μL體系：SYBR Green Premix ExTaqTM(2×)10μL、引物各0.5μL(20μmol/L)、模板1μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃1 min；95℃5 s、56℃4 s、72℃7 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.7 臨床樣品檢測(cè) 利用所建立的RPA-LFD方法和普通PCR方法分別檢測(cè)臨床送檢的疑似病料57份，比較兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 引物的篩選 根據(jù)RPA的引物設(shè)計(jì)原則共設(shè)計(jì)了6對(duì)ILTV特異性引物，利用TwistAmp basic kit對(duì)引物進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，6對(duì)引物均能夠擴(kuò)增出目的條帶，但引物ILTV-3-F/ILTV-3-R擴(kuò)增的產(chǎn)物比較單一(圖1)，因此選擇其作為建立RPA-LDFD方法用的引物，并在上、下游引物的5'端分標(biāo)記FITC和Biotin，以便用膠體金側(cè)向流試紙條檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 本研究對(duì)反應(yīng)體系中的引物濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度分別進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，引物濃度在62.5 nmol/L～250 nmol/L時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立(圖2A)，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選250 nmol/L的濃度作為后續(xù)試驗(yàn)的使用濃度。

反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果顯示，RPA反應(yīng)為10 min～20 min時(shí)，試紙條均可以檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2B)，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選20 min作為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間。在確定最佳引物濃度和反應(yīng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了反應(yīng)溫度優(yōu)化。結(jié)果顯示，溫度在30℃～42.5℃時(shí)，試紙條均可以特異性檢出RPA擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2C)，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選37℃作為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)溫度。

圖1 ILTV的RPA引物篩選Fig.1 Primer screening of the RPA for ILTV by RPA

圖2 檢測(cè)ILTV的RPA-LFD反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the RPA-LFD reaction conditions for ILTV detection

2.3 特異性試驗(yàn) 分別以NDV、AIV H9N2亞型、IBV、IBDV、ALV的cDNA和MDV、ILTV的DNA為模板驗(yàn)證所建立的檢測(cè)ILTV的RPA-LFD方法的特異性。結(jié)果顯示，僅以ILTV的DNA為模板的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物在試紙條上同時(shí)出現(xiàn)檢測(cè)線和質(zhì)控線，而其它病原的擴(kuò)增產(chǎn)物僅出現(xiàn)質(zhì)控線(圖3)，表明該方法的特異性良好。

圖3 檢測(cè)ILTV的RPA-LFD方法的特異性Fig.3 Specificity of the RPA-LFD method for ILTV detection

2.4 敏感性試驗(yàn) 采用倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，比較所建立的RPA-LFD方法與常規(guī)PCR、SYBR Green I熒光定量PCR的敏感性。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的RPA-LFD檢測(cè)方法最低檢出限為102拷貝/μL(圖4A)，普通PCR的檢出限僅為104拷貝/μL(圖4B)，熒光定量PCR的檢出限為10拷貝/μL(圖4C)，表明本研究建立的RPA-LFD方法敏感性高于普通PCR，但低于熒光定量PCR。

圖4 檢測(cè)ILTV的RPA-LFD方法的敏感性Fig.4 Sensitivity test of the RPA-LFD assay for ILTV detection

2.5 臨床樣品檢測(cè) 利用所建立的RPA-LFD方法與PCR方法分別檢測(cè)臨床送檢的疑似病料57份，結(jié)果顯示RPA-LFD檢測(cè)出陽(yáng)性樣品46份，陰性樣品11份；普通PCR檢出陽(yáng)性樣品42份，陰性15。兩種方法的符合率為93 %。表明，本研究建立的PPA-LFD方法可用于ILTV的現(xiàn)地檢測(cè)。

3 討論

由ILTV引起的ILT是雞的一種急性、接觸性上呼吸道傳染病，該病的臨床癥狀和病理變化容易與其它禽呼吸道病如雞新城疫、禽流感和雞傳染性支氣管炎等相混淆，尤其是發(fā)生混合感染時(shí)，更容易發(fā)生誤診，給ILT的臨床診斷帶來(lái)一定的困難。現(xiàn)有的ILTV檢測(cè)方法通常需要特定的儀器和熟練的實(shí)驗(yàn)室操作人員，不適用于對(duì)疾病的現(xiàn)地檢測(cè)。

RPA是一種借助于重組酶、鏈置換聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白的新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。與其它DNA擴(kuò)增技術(shù)相比，RPA不需要特殊設(shè)備即可在更短時(shí)間內(nèi)和較低溫度下擴(kuò)增目的DNA至可檢測(cè)水平。LFD技術(shù)是一種不需要昂貴和復(fù)雜儀器以及訓(xùn)練有素的人員即可操作的可視化檢測(cè)工具。本研究將RPA和LFD技術(shù)結(jié)合建立了一種檢測(cè)ILTV的方法。利用分子標(biāo)記的ILTV特異性RPA引物，通過(guò)RPA反應(yīng)產(chǎn)生雙標(biāo)記的DNA擴(kuò)增子，標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物可以很方便地用LFD進(jìn)行可視化檢測(cè)。建立的RPA-LFD方法可以特異性檢測(cè)ILTV，而不與其它禽病病原發(fā)生交叉反應(yīng)，且RPA-LFD的敏感性比普通PCR高100倍。值得指出的是，目前絕大多數(shù)的RPA方法均使用英國(guó)TwistDX Inc公司的RPA試劑盒，該公司設(shè)計(jì)的TwistAmpTMnfo試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物可以用LFD檢測(cè)，該試劑盒的工作原理是借助于特別設(shè)計(jì)的兼容性標(biāo)記探針和標(biāo)記的下游引物生成的雙標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)LFD檢測(cè)。兼容性探針由與靶序列同源的寡核苷酸組成，其5'端帶有抗原性標(biāo)記，內(nèi)部帶有一個(gè)核苷酸類似物(通常為四氫呋喃殘基或THF)以替代靶序列特殊位置中的一個(gè)核苷酸(A或T)，以及3'端一個(gè)聚合酶延伸阻遏基團(tuán)。探針的長(zhǎng)度通常需要46～52個(gè)堿基，其中THF位點(diǎn)的5'端至少要有30個(gè)堿基，3'端至少要有15個(gè)堿基[15]。盡管探針有助于提高RPA擴(kuò)增的特異性，但這樣的探針在一個(gè)特定的基因中通常較難找到，而且合成如此復(fù)雜探針通常價(jià)格昂貴。本研究室針對(duì)該試劑盒缺陷，直接用優(yōu)化的ILTV特異性上游引物替代復(fù)雜的探針，通過(guò)優(yōu)化引物的濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間等因素，建立了檢測(cè)ILTV的RPA-LFD方法。該方法不需要特殊的儀器設(shè)備，在恒定的溫度下實(shí)現(xiàn)ILTV的快速檢測(cè)，且敏感性與熒光定量PCR相當(dāng)，比常規(guī)PCR高100倍。

總之，本研究綜合RPA和LFD的各自優(yōu)勢(shì)，建立了一種快速、特異、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)ILTV的方法，該方法不需特殊設(shè)備，僅需一臺(tái)能控溫的水浴鍋，并且結(jié)果無(wú)需儀器而僅通過(guò)肉眼即可判定，對(duì)操作人員的要求不高，非常適合在我國(guó)獸醫(yī)臨床和基層實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，具有較好的應(yīng)用前景。