宋甲寶，許 達(dá)，姜利英，宗樹(shù)成，李兆利，劉文興，李干武，步志高，胡 森

(中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的重要人獸共患傳染病。布魯氏菌為革蘭氏陰性菌，無(wú)鞭毛，不形成芽孢，導(dǎo)致動(dòng)物及人流產(chǎn)和不孕[1]。布魯氏菌病在大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家已被消滅，但在以牛羊?yàn)橹饕蟮陌l(fā)展中國(guó)家和地區(qū)仍廣泛流行[2]。

OmpR屬于EnvZ/OmpR二元調(diào)控系統(tǒng)，廣泛存在于細(xì)菌中，在適應(yīng)環(huán)境方面發(fā)揮多種功能[3-5]，主要參與滲透壓調(diào)節(jié)和酸脅迫應(yīng)答[6-7]，也參與調(diào)節(jié)糖類代謝[8-9]和毒力調(diào)控[10-11]。EnvZ/OmpR在沙門氏菌中是激活另一個(gè)二元調(diào)控系統(tǒng)—SsrA/B的重要組分，其可以通過(guò)調(diào)節(jié)毒力因子表達(dá)，使沙門氏菌在巨噬細(xì)胞吞噬囊泡酸性環(huán)境中得以復(fù)制和生存[10-11]。Chakraborty等發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌在巨噬細(xì)胞吞噬囊泡中的酸化調(diào)節(jié)過(guò)程，依賴于EnvZ/OmpR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[12]。

布魯氏菌OmpR的功能尚不清楚，為探究其功能與作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以M28為親本株，構(gòu)建OmpR基因缺失株與回補(bǔ)株，通過(guò)TSB平板培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)觀察、巨噬細(xì)胞感染試驗(yàn)、生長(zhǎng)曲線、小鼠體內(nèi)復(fù)制水平測(cè)定等試驗(yàn)對(duì)布魯氏菌OmpR基因功能進(jìn)行初步研究，為其在布魯氏菌中的作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞系、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 馬耳他布魯氏 菌M28、巨噬細(xì)胞Raw264.7、pSP72和pBBR1MCS-4、卡那霉素表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP為本實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡～8周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑PhantaTMSuper-Fidelity DNA Polymerase、ClonExpressTMMultiS重組克隆試劑盒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PstⅠ和BglⅡ酶購(gòu)自NEB公司；胰蛋白大豆液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 自殺質(zhì)粒pSP-OmpR-K的構(gòu)建與鑒定 利用CE Design V1軟件設(shè)計(jì)OmpR基因(CDD∶223816)左右同源臂和卡那霉素表達(dá)盒引物(表1)。利用基因組提取試劑盒提取M28基因組，以其為模板，分別以L-f/L-r/R-f/R-r為引物，PCR擴(kuò)增OmpR左右同源臂，以實(shí)驗(yàn)室保存的卡那霉素表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP為模板，以K-f/K-r為引物，PCR擴(kuò)增卡那霉素基因表達(dá)序列。OmpR左右同源臂片段和卡那霉素基因片段經(jīng)純化，通過(guò)同源重組試劑盒將3個(gè)片段克隆至pSP72質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取卡那霉素平板上的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，提取質(zhì)粒測(cè)序鑒定后命名為pSP-OmpR-K。

表1 本研究用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 缺失株M28ΔOmpR和回補(bǔ)株M28ΔOmpRcom的篩選與鑒定 將自殺質(zhì)粒pSP-OmpR-K電轉(zhuǎn)入布魯氏菌M28感受態(tài)細(xì)胞中，用900μL SOC培養(yǎng)基重懸，置37℃振蕩培養(yǎng)12 h，將菌液涂布于卡那霉素抗性(50μg/mL)的TSB平板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)，96 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取具有卡那霉素抗性的菌落，分別劃線至卡那霉素抗性和氨芐青霉素抗性的(50μg/mL)TSB平板培養(yǎng)基，連續(xù)純化傳代8代后，挑取僅抗卡那霉素的菌落。利用引物OmpRL-f/OmpRL-r/OmpRR-f/OmpRR-r對(duì)疑似陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定，并將PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定，將陽(yáng)性菌命名為M28ΔOmpR。將擴(kuò)增的OmpR基因序列(包含OmpR啟動(dòng)子)克隆至pBBR1MCS4原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBBR1MCS4-OmpR。將pBBR1MCS4-OmpR電轉(zhuǎn)入M28ΔOmpR菌株，構(gòu)建OmpR基因回補(bǔ)株，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選純化，挑取疑似陽(yáng)性菌株P(guān)CR鑒定，并將鑒定為陽(yáng)性的菌株命名為M28ΔOmpR-com。

1.5 重組菌菌落生長(zhǎng)差異比較 將M28、M28ΔOmpR及M28ΔOmpR-com用PBS稀釋至每100μL含菌數(shù)100個(gè)～200個(gè)后涂布于TSB平板培養(yǎng)基。分別在72 h、96 h和120 h后，刻度尺測(cè)量菌落直徑并測(cè)定單菌落含菌數(shù)，比較M28、M28ΔOmpR和M28ΔOmpR-com體外生長(zhǎng)差異。

1.6 重組菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取M28和M28ΔOmpR各3μL接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將菌液稀釋到OD600nm=0.05，37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)至64 h(平臺(tái)期)，每隔8 h取一次樣，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，測(cè)定其OD600nm，繪制M28和M28ΔOmpR的體外生長(zhǎng)曲線。

1.7 重組菌巨噬細(xì)胞感染試驗(yàn) 將巨噬細(xì)胞RAW264.7接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至密度約為80 %。將M28、M28ΔOmpR及M28ΔOmpRcom按MOI=100感染RAW264.7細(xì)胞，置37℃吸附感染，4 h后用不含血清的DMEM洗3次，然后用含5 % FBS和5μg/mL慶大霉素的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。感染后8 h、24 h和48 h，用2 % Triton X-100于4℃裂解細(xì)胞10 min，徹底吹下細(xì)胞，稀釋涂板。采用胞內(nèi)菌落計(jì)數(shù)方法[13]比較M28ΔOmpR、M28及M28ΔOmpR-com在巨噬細(xì)胞中的增殖情況，判定OmpR基因缺失對(duì)布魯氏菌在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)復(fù)制的影響。

1.8 重組菌的小鼠感染試驗(yàn) 將60只6周齡～8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分成2組。分別腹腔接種M28和M28ΔOmpR，劑量為1×106cfu/只。分別在接種后第1周、2周、4周、6周和9周頸部脫臼迫殺小鼠，無(wú)菌取小鼠脾臟稱重，比較脾臟重量然后加800μL PBS，置組織研磨儀研磨。將懸液適當(dāng)稀釋后取100μL涂布于TSB平板培養(yǎng)基，96 h后菌落計(jì)數(shù)，比較不同組小鼠脾臟的布魯氏菌數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 pSP-OmpR-K重組自殺載體構(gòu)建及鑒定 以M28為模板，PCR擴(kuò)增出OmpR左、右同源臂，以pIRES2-EGFP為模板，PCR擴(kuò)增出卡那霉素表達(dá)盒，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增的3個(gè)基因片段大小分別約為：1 000 bp、1 000 bp和1 300 bp，均與預(yù)期一致(圖1A)。且測(cè)序結(jié)果顯示，3個(gè)基因片段均與各目的目的條帶100 %一致，表明擴(kuò)增了OmpR左、右同源臂和卡那霉素表達(dá)盒。將OmpR左、右同源臂和卡那霉素表達(dá)盒融合后克隆至pSP72載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pSP-OmpR-K。以pSP-OmpR-K為模板，利用L-f/R-r引物，PCR擴(kuò)增OmpR左右同源臂和卡那霉素基因序列。結(jié)果顯示擴(kuò)增得到約3 300 bp的目的條帶，與預(yù)期相符(圖1B)。表明構(gòu)建了pSP-OmpRK重組自殺載體。

2.2 缺失株M28ΔOmpR和回補(bǔ)株M28ΔOmpRcom的篩選鑒定 將pSP-OmpR-K自殺載體電轉(zhuǎn)化至M28中，經(jīng)抗性篩選得到M28ΔOmpR，通過(guò)PCR鑒定，結(jié)果顯示得到兩條大小分別約為1 700 bp(從左同源臂上游214 bp至卡那霉素表達(dá)盒)和1 700 bp(從卡那霉素表達(dá)盒至右同源臂下游161 bp)的目的條帶(圖1C)，測(cè)序結(jié)果正確，表明構(gòu)建了OmpR基因缺失株M28ΔOmpR。將pBBR1MCS4-OmpR電轉(zhuǎn)入M28ΔOmpR，經(jīng)氨芐青霉素篩選獲得回補(bǔ)株M28ΔOmpR-com，PCR鑒定得到大小約為1 200 bp條帶，與預(yù)期相符(圖1D)，表明構(gòu)建了回補(bǔ)株M28ΔOmpR。

圖1 pSP-OmpR-K自殺載體、缺失株M28ΔOmpR和回補(bǔ)株M28ΔOmpR-com鑒定Fig.1 Identification of plasmid pSP-OmpR-K,B.melitensis M28ΔOmpR and M28ΔOmpR-com

2.3 布魯氏菌菌落生長(zhǎng)差異比較 將M28ΔOmpR株、M28株及M28ΔOmpR-com株稀釋后涂布于TSB平板培養(yǎng)基，于不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量菌落直徑并對(duì)單菌落進(jìn)行含菌數(shù)測(cè)定。72 h時(shí)，M28與M28ΔOmpR-com菌落呈針尖大小，菌落平均直徑為0.89 mm和0.90 mm，M28ΔOmpR株未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)。96 h時(shí)，M28ΔOmpR株、M28株和M28ΔOmpR-com株直徑分別為0.95 mm、1.62 mm和1.56 mm，M28ΔOmpR與后兩者相比菌落生長(zhǎng)速度極顯著降低(p＜0.001)；此時(shí)M28ΔOmpR單菌落含菌數(shù)極顯著低于M28和M28ΔOmpR-com(p＜0.001)，3者分別為7.4 Log10、8.75 Log10和8.73 Log10。120 h時(shí)，M28ΔOmpR、M28和M28ΔOmpR-com菌落直徑分別為1.71 mm、2.48 mm和2.24 mm，M28ΔOmpR與后兩者相比菌落生長(zhǎng)速度極顯著降低(p＜0.001)；此時(shí)M28ΔOmpR單菌落含菌數(shù)顯著低于M28株和M28ΔOmpR-com株(p＜0.001)，三者分別為8.08 Log10、9.17 Log10和9.19 Log10(圖2)。以上結(jié)果表明OmpR基因缺失后顯著抑制M28菌落形成速度和單個(gè)菌落的含菌數(shù)，即降低了M28的菌落生長(zhǎng)速度。

圖2 OmpR基因缺失株菌落生長(zhǎng)試驗(yàn)Fig.2 Colony growth of the OmpR gene deleted B.melitensis strain

2.4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 每隔8 h吸取1 mL各菌液測(cè)定OD600nm，將不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定值繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，M28株和M28ΔOmpR株生長(zhǎng)曲線趨于一致，均在64 h達(dá)到平臺(tái)期，在該時(shí)期M28株OD600nm值 為2.45，M28ΔOmpR株OD600nm值 為2.59，兩者不同時(shí)間OD600nm值均無(wú)顯著差異(p＞0.05)(圖3)。表明，OmpR缺失后不會(huì)影響布魯氏菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。

圖3 M28和缺失株M28ΔOmpR的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of B.melitensis M28 strain and M28ΔOmpR strain

2.5 巨噬細(xì)胞感染試驗(yàn) 將M28ΔOmpR株、M28株和M28ΔOmpR-com株按MOI=100感染RAW264.7巨噬細(xì)胞，于不同時(shí)間點(diǎn)分離胞內(nèi)菌并計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，感染8 h、24 h和48 h后M28ΔOmpR株胞內(nèi)菌分離數(shù)均極顯著低于M28株及M28ΔOmpR-com株(p＜0.001)。感染8 h時(shí)，M28ΔOmpR株胞內(nèi)菌分離數(shù)為5.07 Log10，極顯著低于M28株(6.83 Log10)(p＜0.001)和M28ΔOmpR-com株(6.88 Log10)的胞內(nèi)菌分離數(shù)(p＜0.001)。M28ΔOmpR株在胞內(nèi)復(fù)制緩慢。感染24 h時(shí)，M28ΔOmpR株、M28株和M28ΔOmpR-com株胞內(nèi)菌分離數(shù)分別為5.13 Log10、6.92 Log10和7.09 Log10。感染48 h時(shí)，3者分別為5.73 Log10、8.0 Log10和8.35 Log10(圖4)。結(jié)果表明，OmpR基因缺失顯著降低馬耳他布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力。

圖4 M28株、缺失株M28ΔOmpR及互補(bǔ)株M28ΔOmpR-com在RAW264.7巨噬細(xì)胞中的復(fù)制Fig.4 Replication of B.melitensis M28,M28ΔOmpR strain and complementary strain M28ΔOmpR-com in RAW264.7

2.6 小鼠體內(nèi)感染試驗(yàn) 將M28株和M28ΔOmpR株按1×106cfu/只劑量腹腔接種小鼠，比較不同時(shí)間點(diǎn)小鼠脾重及細(xì)菌分離情況，評(píng)估缺失株在體內(nèi)的復(fù)制能力。結(jié)果顯示，感染第1周，M28ΔOmpR組小鼠脾重(0.3 g)極顯著低于M28組(0.59 g)(p＜0.001)。第4周時(shí)，M28ΔOmpR組小鼠脾重(0.31 g)極顯著低于M28組(0.61 g)(p＜0.001)(圖5A)。隨后各組小鼠脾重均開(kāi)始下降，差異也逐漸縮小。小鼠脾臟布魯氏菌分離數(shù)結(jié)果顯示，M28ΔOmpR和M28在感染1周后該分離數(shù)達(dá)到峰值，隨后降低，感染4周時(shí)二者差異最大，M28ΔOmpR組小鼠脾臟細(xì)菌分離數(shù)為5.3 Log10，M28組為6.1 Log10(p＜0.01)(圖5B)。結(jié)果表明OmpR基因缺失顯著降低M28株對(duì)小鼠致病性及其在體內(nèi)的復(fù)制能力。

圖5 M28株和缺失株M28ΔOmpR小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中小鼠脾臟重量(A)和脾臟荷菌量(B)差異比較Fig.5 The spleen weight profiles(A)and bacterial counts in the spleen(B)for M28 and deletion strain M28ΔOmpR infected BALB/c mice

3 討論

OmpR調(diào)控蛋白屬于EnvZ/OmpR二元調(diào)控系統(tǒng)，主要參與細(xì)菌滲透壓調(diào)節(jié)[6]和酸性調(diào)節(jié)[5]，也是OmpR經(jīng)典調(diào)控方式，同時(shí)還參與調(diào)控沙門氏菌的胞內(nèi)復(fù)制[12]，在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境中發(fā)揮重要作用。Suzanne等研究顯示，OmpR-EnvZ和SsrA-SsrB二元調(diào)控系統(tǒng)共調(diào)節(jié)沙門氏菌SPI-2 type III分泌系統(tǒng)，參與其毒力調(diào)節(jié)。近來(lái)研究顯示，OmpR還參與調(diào)控鼠疫耶氏菌對(duì)小鼠的毒力，OmpR基因突變后鼠疫耶氏菌對(duì)小鼠毒力顯著降低[14]。目前關(guān)于布魯氏菌OmpR功能機(jī)制尚不清楚，本研究針對(duì)OmpR基因在布魯氏菌中參與的功能進(jìn)行了初步探究。

基因敲除是研究基因功能的常用手段，同源重組法具有專一性強(qiáng)、整合位點(diǎn)精確，可以將外源基因?qū)牖蚪MDNA的特定區(qū)域并使其穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)[15]。本研究將M28的OmpR基因通過(guò)同源重組法敲除，構(gòu)建了OmpR缺失株，并構(gòu)建了回補(bǔ)株，通過(guò)比較三者的生長(zhǎng)差異，初步闡明了OmpR在布魯氏菌生長(zhǎng)與復(fù)制中的作用。

單菌落含菌數(shù)結(jié)果顯示，M28ΔOmpR菌落生長(zhǎng)速度低于M28，但回補(bǔ)株M28ΔOmpR-com菌落生長(zhǎng)速度得到恢復(fù)。表明OmpR基因影響馬耳他布魯氏菌在TSB平板培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)速度。但M28ΔOmpR株和M28株的體外生長(zhǎng)曲線并無(wú)明顯差異，這與固體培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)觀察結(jié)果不一致，推測(cè)可能由于生長(zhǎng)環(huán)境不同，OmpR基因?qū)Σ剪斒暇L(zhǎng)影響不同，具體產(chǎn)生差異的機(jī)理還需進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

巨噬細(xì)胞感染結(jié)果表明M28ΔOmpR株、M28株及M28ΔOmpR-com株胞內(nèi)菌分離數(shù)差異極顯著，三組感染后48 h胞內(nèi)布魯氏菌均達(dá)到峰值，M28ΔOmpR胞內(nèi)菌分離數(shù)比M28株低2 Log10以上。許多胞內(nèi)病原體可以在巨噬細(xì)胞生物膜形成的酸性吞噬囊泡中存活，Chakraborty等發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入細(xì)胞后的細(xì)胞質(zhì)酸化，依賴于OmpR即EnvZ/OmpR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，使得沙門氏菌更易侵入巨噬細(xì)胞并能夠在吞噬囊泡中復(fù)制[12]。同樣，布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞后，可以與巨噬細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)形成包含布魯氏菌的囊泡(Brucella-containing vacuole，BCV)，BCV和晚期內(nèi)體/溶酶體空泡作用，并控制內(nèi)體/溶酶體空泡內(nèi)部酸化環(huán)境，抑制巨噬細(xì)胞蛋白水解酶和組織蛋白酶D對(duì)布魯氏菌的降解[16]。馬耳他布魯氏菌是否也依賴于EnvZ/OmpR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與pH調(diào)節(jié)，影響其侵入巨噬細(xì)胞并復(fù)制增殖，具體機(jī)制有待繼續(xù)探究。

小鼠感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失OmpR基因后，M28ΔOmpR株感染的小鼠脾臟重量顯著低于M28株感染的小鼠脾臟重量，且該組小鼠脾臟布魯氏菌分離數(shù)低于M28株，相差0.8 Log10。這表明在一定程度上，OmpR基因缺失對(duì)馬耳他布魯氏菌毒力影響顯著。

綜上所述，本研究顯示OmpR基因缺失抑制了布魯氏菌菌落生長(zhǎng)速度，顯著降低了其在巨噬細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力，表明OmpR基因在馬耳他布魯氏菌中起著至關(guān)重要作用，為探究OmpR在布魯氏菌中的功能奠定了基礎(chǔ)。