張宸語(yǔ)，陳佳寧，溫建新，劉光亮

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730046；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島266109)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由PED病毒(PEDV)引起的一種可以使仔豬發(fā)生急性腹瀉、嘔吐、脫水乃至死亡的病毒性傳染病，對(duì)仔豬的病死率高達(dá)100 %，該病毒通常更易在寒冷的冬季傳播和復(fù)制[1]，而針對(duì)PEDV并無(wú)有效的防治方法。miRNA是一種長(zhǎng)度為22 nt左右的非編碼單鏈小RNA，它可以參與細(xì)胞增殖與凋亡、免疫、組織器官的分化成熟、脂肪代謝、腫瘤形成及抑制等的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，能夠以完全或者不完全的結(jié)合在靶mRNA上，進(jìn)而抑制其翻譯或降解mRNA本身，通過(guò)這種方式也可以抑制病毒的復(fù)制，宿主miRNA對(duì)病毒作用分為促進(jìn)和抑制病毒的復(fù)制，而促進(jìn)或抑制病毒復(fù)制又分為通過(guò)直接靶向病毒基因組和靶向細(xì)胞內(nèi)源基因進(jìn)而調(diào)控病毒復(fù)制兩種方式[2-3]。miRNA與病毒存在多種多樣的調(diào)控作用，但至今未見(jiàn)miRNA在PEDV中的研究，本研究建立了PEDV感染豬小腸上皮細(xì)胞(Intestine epithelial cells J2，IPEC-J2)后miRNA的表達(dá)譜并通過(guò)qPCR驗(yàn)證并測(cè)序，又進(jìn)行GO(Gene ontology，GO)分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)代謝通路分析和差異表達(dá)分析，以期為研究miRNA對(duì)PEDV復(fù)制的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、病毒及主要試劑Vero E6細(xì)胞系、IPEC-J2細(xì)胞系、GFP-PEDV-N單克隆抗體(MAb)和PEDV LJX株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物免疫遺傳學(xué)培育團(tuán)隊(duì)保存；TransZol Up Plus RNA Kit、dNTP、TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Probe qPCR SuperMix、TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR Super-Mix、TransScript Probe One-Step qRT-PCR SuperMix均購(gòu)自TransGen公司；X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent購(gòu)自Roche公司；Insulin Transferrin Selenium-X Supplement(100X)、EGF、DMEM/F-12、Opti-MEM均購(gòu)自Gibco公司M-MLV Reverse Transcriptase購(gòu)自Promega公司。

1.2 miRNA mimic、引物及探針的合成 根據(jù)Hiseq測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)miRNA的qPCR上游引物(U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA)，PEDV檢測(cè)引物及探針均根據(jù)PEDV LJX的M基因(EF185992)設(shè)計(jì)(PEDV-M F：CGTACAGGTAAGTCAATTAC/PEDVM R：CATAGAAAGCCCAACCAGTG；探針：TTC GTCACAGTCGC CAAGG，5'-FAM，3'-TAMRA)并由金為智測(cè)序公司合成；由差異表達(dá)分析結(jié)果篩選出差異性較大的兩個(gè)miRNA，分別為novel-miR-877 mimic(UGUGUGUGUGGGCGCCGGACGCC)和sscmiR-219a(AGAGUUGAGUCUGGACGUCCCG)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限合成。

1.3 PEDV感染IPEC-J2免疫熒光驗(yàn)證及生長(zhǎng)曲線繪制 培養(yǎng)IPEC-J2至70 %左右時(shí)，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞3遍，按照以下分組處理細(xì)胞：將PEDV LJX株經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至MOI=1作為感染組，以同樣稀釋的無(wú)血清培養(yǎng)基作為對(duì)照組。對(duì)照組僅添加無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋液。各組37℃培養(yǎng)1 h后棄去上清，PBS洗滌3遍后更換含2.5 %胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，在12 h、24 h、36 h、48 h時(shí)取上清檢測(cè)病毒TCID50，繪制病毒生長(zhǎng)曲線，12 h時(shí)使用帶GFP標(biāo)簽的PEDV-N蛋白MAb檢測(cè)感染后綠色熒光的表達(dá)。

1.4 miRNA高通量測(cè)序及其差異分析、靶基因GO分析及KEGG代謝通路分析 按照TransZol Up Plus RNA Kit說(shuō)明書(shū)提取感染組和對(duì)照組12 h，36 h的總RNA，由華大科技測(cè)序公司進(jìn)行Hiseq高通量測(cè)序，獲得小RNA的原始數(shù)據(jù)。對(duì)于測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)的miRNA，隨機(jī)選擇差異較大的16個(gè)miRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。對(duì)測(cè)序所得miRNA進(jìn)行差異分析，將顯著差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因GO分析和KEGG代謝通路分析。

1.5 miRNA模擬物過(guò)表達(dá)對(duì)PEDV復(fù)制的影響由測(cè)序結(jié)果顯示novel-miR-877和ssc-miR-219a在PEDV感染期間均顯著差異表達(dá)，所以合成并分別轉(zhuǎn)染novel-miR-877 mimic、ssc-miR-219a mimic或NC mimic至IPEC-J2，24 h后感染PEDV，在感染12 h、24 h、36 h、48 h收獲細(xì)胞，提取總RNA并根據(jù)M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用探針?lè)╭PCR對(duì)PEDV-M進(jìn)行絕對(duì)定量；收獲細(xì)胞上清并使用TCID50測(cè)定miRNA過(guò)表達(dá)后對(duì)病毒滴度的影響。

2 結(jié)果

2.1 PEDV生長(zhǎng)曲線繪制及miRNA測(cè)序結(jié)果差異性分析PEDV LJX株感染IPEC-J2 12 h時(shí)，病毒復(fù)制水平達(dá)到最高，之后迅速降低，該時(shí)間免疫熒光結(jié)果表明PEDV可以感染IPEC-J2(圖1A)，感染36 h病毒復(fù)制能力降到最低，48 h時(shí)檢測(cè)不到病毒滴度。結(jié)果表明PEDV感染IPEC-J2后存在兩個(gè)不同時(shí)期的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，由此選擇測(cè)序時(shí)間點(diǎn)PEDV感染為12 h和36 h的樣品(圖1B)。

圖1 PEDV LJX感染IPEC-J2免疫熒光驗(yàn)證(A)及生長(zhǎng)曲線繪制(B)Fig.1 Immunofluorescence assay(A)and the growth curve(B)of PEDV LJX strain in IPEC-J2

對(duì)感染組與對(duì)照組miRNA的長(zhǎng)度進(jìn)行比較，結(jié)果顯示測(cè)序所得小RNA大部分處于20 nt～22 nt，表明大多數(shù)小RNA均為miRNA，且12 h、36 h感染組處于20 nt～22 nt的小RNA與對(duì)照組相比存在顯著差異(p＜0.05)(圖2)。而對(duì)感染組與對(duì)照組miRNA的表達(dá)進(jìn)行差異性分析，即統(tǒng)計(jì)兩個(gè)樣品中表達(dá)的已知miRNA，判斷該兩組之間的表達(dá)量是否存在顯著性差異，p＜0.05即為差異顯著。結(jié)果顯示，12 h感染組與對(duì)照組相比，存在15個(gè)顯著差異的已知miRNA和146個(gè)未知miRNA，36 h感染組與對(duì)照組相比有包括ssc-miR-219a在內(nèi)的13個(gè)已知miRNA和包括novel-miR-877在內(nèi)的92個(gè)未知miRNA存在顯著差異，而12 h和36 h的感染組相比，也有31個(gè)差異表達(dá)顯著的已知miRNA和133個(gè)未知miRNA(表1)。隨機(jī)挑選了16個(gè)miRNA驗(yàn)證其表達(dá)趨勢(shì)，qPCR結(jié)果顯示這些miRNA的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果基本一致，表明測(cè)序結(jié)果可信，同時(shí)，表明PEDV感染IPEC-J2可以有效改變其中miRNA的表達(dá)，miRNA確實(shí)參與了PEDV復(fù)制的調(diào)控。

表1 PEDV感染IPEC-J2后的miRNA差異表達(dá)結(jié)果Table 1 The differentially expressed miRNAs after PEDV infection

圖2 小RNA長(zhǎng)度分布Fig.2 The length distribution of the small RNAs

2.2 靶基因GO分析及KEGG代謝通路分析結(jié)果對(duì)12 h、36 h的感染組及對(duì)照組差異表達(dá)顯著的miRNA(包括novel-miR-877和ssc-miR-219a在內(nèi)的)進(jìn)行GO及KEGG分析，GO分析結(jié)果顯示，12 h、36 h感染組差異表達(dá)的miRNA主要參與生物調(diào)控、細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程等生物過(guò)程；細(xì)胞膜、細(xì)胞器等細(xì)胞成分；結(jié)合、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、受體活性等分子功能的調(diào)控(圖3A)。KEGG分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)的miRNA主要參與嗅覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞因子-受體相互作用、Toll樣受體信號(hào)通路、丙肝、麻疹、單純皰疹病毒感染、JAK-STAT信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路、調(diào)節(jié)自噬、自身免疫性甲狀腺疾病等通路的調(diào)節(jié)(圖3B)。表明miRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能及與抗病毒、免疫相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)而影響病毒的復(fù)制。

圖3 差異表達(dá)miRNA的GO分析(A)及KEGG分析(B)Fig.3 Analysis of GO(A)and KEGG(B)on the differential expression of the miRNAs

2.3 novel-miR-877和ssc-miR-219a過(guò)表達(dá)對(duì)PEDV復(fù)制的影響結(jié)果novel-miR-877是本研究首次發(fā)現(xiàn)的新miRNA，對(duì)其進(jìn)行基因組定位，得到了其穩(wěn)定的miRNA前體二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖4A)。novelmiR-877和ssc-miR-219a在IPEC-J2中過(guò)表達(dá)后，對(duì)PEDV的復(fù)制能力進(jìn)行qPCR和TCID50檢測(cè)，結(jié)果顯示在感染12 h時(shí)，NC對(duì)照組的病毒M基因表達(dá)量、病毒滴度均顯著高于novel-miR-877(圖4B)和ssc-miR-219a(圖4C)轉(zhuǎn)染組，到36 h時(shí)趨于一致。表明novel-miR-877、ssc-miR-219a的過(guò)表達(dá)可在12 h時(shí)顯著抑制PEDV在IPEC-J2中的復(fù)制。

圖4 novel-miR-877的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(A)及novel-miR-877(B)、ssc-miR-219a(C)過(guò)表達(dá)對(duì)PEDV復(fù)制的影響Fig.4 Hairpin structures of novel-miR-877(A)and the effect of over expression of novel-miR-877(B)and ssc-miR-219a(C)on PEDV replication

3 討論

在獸醫(yī)上對(duì)miRNA表達(dá)差異研究較多的是針對(duì)豬繁殖與綜合征病毒和為狂犬病毒等，對(duì)PEDV研究較少，本研究對(duì)PEDV侵入IPEC-J2后細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的分析，首次發(fā)現(xiàn)了novel-miR-877，并對(duì)novel-miR-877、ssc-miR-219a在PEDV復(fù)制中的作用做了初步驗(yàn)證。

PEDV在全國(guó)范圍內(nèi)出現(xiàn)了大面積的暴發(fā)，對(duì)仔豬的致病率和致死率均很高，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，但是目前并沒(méi)有針對(duì)該病毒有效的防治手段。miRNA能夠參與病毒的侵入和復(fù)制時(shí)的調(diào)控，但是有的宿主miRNA可以幫助病毒的復(fù)制和侵入，比如miR-27可以通過(guò)抑制SNAP25和TXN2的表達(dá)而抑制腺病毒的感染[4]；miR-22通過(guò)靶向宿主因子HO-1可以促進(jìn)豬繁殖和呼吸綜合征病毒的復(fù)制[5]；miR-21可以促進(jìn)2型登革病毒在HepG2中的復(fù)制[6]；miR-4331可以通過(guò)靶向Rb1進(jìn)而促進(jìn)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)介導(dǎo)的誘導(dǎo)的線粒體損傷，上調(diào)白細(xì)胞介素-1受體輔助蛋白(IL1RAP)的表達(dá)，還能體外激活p38 MAPK通路[7]。而至今未見(jiàn)miRNA在PEDV中的研究，PEDV在豬體內(nèi)可以感染并引起IPEC-J2微絲骨架及其緊密連接的改變[8]，但是在該細(xì)胞中復(fù)制能力較差，其原因未見(jiàn)報(bào)道。IPEC-J2已經(jīng)可以穩(wěn)定傳代，具有經(jīng)濟(jì)又方便的優(yōu)點(diǎn)，所以選擇IPEC-J2研究其編碼的miRNA在病毒復(fù)制期間對(duì)病毒的作用。

一般來(lái)說(shuō)，小RNA的長(zhǎng)度區(qū)間為18 nt～30 nt，長(zhǎng)度分布的峰值有助于判斷sRNA的種類，如miRNA集中在21 nt或22 nt，siRNA集中在24 nt，piRNA集中在28 nt～30 nt[9]。本研究根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將低質(zhì)量，大于24 nt或小于18 nt的片段，污染的測(cè)序結(jié)果剔除掉，再將miRNA聚類分析后，并對(duì)miRNA進(jìn)行差異分析和GO分析，找到有顯著差異表達(dá)的與免疫相關(guān)的miRNA：let-7家族成員、miR-10、miR-106a、miR-126、miR-146、miR-150、miR-155、miR-17-3b、miR-17-5b、miR-181、miR-19、miR-19a、miR-20、miR-221、miR-424。根據(jù)這一現(xiàn)象可以推斷，PEDV感染宿主IPEC-J2后，可能受到這些miRNA的調(diào)控而被抑制其在宿主體內(nèi)的復(fù)制，還有可能利用這些miRNA逃避宿主免疫及抗病毒反應(yīng)。GO分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)的miRNA可以調(diào)控結(jié)合、受體活性，表明PEDV可能通過(guò)改變miRNA的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)自身在IPEC-J2中的復(fù)制和感染能力。通過(guò)KEGG分析顯示，miRNA可以參與JAK-STAT信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。JAK-STAT信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)，而Toll樣受體信號(hào)通路也與天然免疫有著密切的關(guān)系，由此可以判斷宿主自身miRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身免疫能力進(jìn)而影響病毒的侵入和復(fù)制能力。novel-miR-877是測(cè)序中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的miRNA，在此之前并未被報(bào)導(dǎo)過(guò)，本研究發(fā)現(xiàn)其具有其抗病毒作用，對(duì)其進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，顯示它有可能靶向TGFβ1、DDX3等與抗病毒有關(guān)的基因。ssc-miR-219a雖然早在豬脂肪組織、乳外泌體中被檢測(cè)出[10-11]，但是其抗病毒作用也是首次在本研究中發(fā)現(xiàn)，這可能是通過(guò)直接靶向病毒基因組或作用于細(xì)胞其它基因進(jìn)而抑制PEDV的復(fù)制，總之，本研究為miRNA在PEDV感染機(jī)制中作用的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。