王娜娜，韓宗璽，山 丹，邵昱昊，劉勝旺，李 海

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽呼吸道傳染病創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱150069)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由IB病毒(IBV)引起的一種雞的急性、高度接觸性呼吸道傳染病。該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛流行，擁有眾多基因型和血清型。根據(jù)嗜性的不同，IBV可被劃分為呼吸型、腎型和肌胃型。IBV的培養(yǎng)方式有氣管環(huán)培養(yǎng)、雞胚培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)。氣管環(huán)培養(yǎng)對傳統(tǒng)呼吸型IBV極敏感，但對其它型野毒株不敏感，容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。雞胚培養(yǎng)是IBV目前最常用的培養(yǎng)方式，適用于大多數(shù)野毒株，但雞胚中母源抗體可能會干擾IBV的復制，并且雞胚內(nèi)環(huán)境復雜性，胚體間差異大，也不利于IBV機制研究的開展[1-2]。相比之下，體外細胞感染模型不存在上述問題，更適合于IBV與宿主細胞互作機制研究。此外，穩(wěn)定高效的IBV體外細胞培養(yǎng)模型的建立也有助于IBV新型高效疫苗的研發(fā)。然而，相比其它冠狀病毒，IBV很難適應傳代細胞培養(yǎng)。目前僅IBV Beaudette弱毒株能在Vero細胞系及部分p53突變或缺失細胞系生長[3]。

本研究基于IBV具有組織嗜性的特點，通過對比嗜性組織氣管和非易感組織脾臟及非易感細胞系LMH全基因組轉(zhuǎn)錄譜差異，結(jié)合LMH和DF-1細胞體外培養(yǎng)體系的生物學功能試驗，初步探究了IBV體外增殖的宿主決定因素，為建立并完善IBV的體外細胞增殖體系奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料IBV M41株、雞LMH細胞系和雞DF-1細胞系均由本實驗室保存。十八脘基氯化羅丹明B染料(R18)購自Life Technologies公司；Gelatin購自Sigma公司；低熔點瓊脂購自Lonza公司；SCR抑制劑PP1、PP2、p53抑制劑Pifithrin-α、p53激活劑Nutlin-3a、細胞G1/S期抑制劑Cytochalasin D、Nocodazole、G2/M期抑制劑Panobinostat和Vincristine Sulfate等均購自Sigma公司。流式細胞儀購自美國BD FACSAria。

1.2 病毒侵入及細胞內(nèi)增殖檢測 為了驗證IBV M41株能否在體外培養(yǎng)條件下進入DF-1和LMH細胞，離心濃縮6 mL的IBV M41株原液(EID50=5.5)后采用R18(3μmol/L)室溫避光染色30 min，然后將100μL該病毒液分別接種到LMH和DF-1細胞，于4℃放置1 h，37℃2 h，收集細胞后采用流式細胞儀檢測(FACS)R18染料在細胞膜中擴散情況，確定病毒囊膜與宿主細胞膜融合的水平，同時設置SPF雞胚尿囊液為陰性對照。采用雞胚感染定量方法(EID50)測定活病毒滴度，應用實驗室前期發(fā)表的IBV特異性熒光定量PCR方法(qPCR)[4]檢測病毒基因組核酸的拷貝數(shù)。

1.3 IBV全基因組轉(zhuǎn)錄譜分析 參照IBV M41株易感組織氣管、非易感組織脾臟及LMH細胞全基因組轉(zhuǎn)錄譜原始數(shù)據(jù)[4-5]，應用相關(guān)R語言數(shù)據(jù)包(http://www.r-project.org/)對比分析氣管、脾臟及LMH的全基因組轉(zhuǎn)錄譜，獲得與M41株易感性相關(guān)的差異表達基因，并進一步對獲得的差異基因應用DAVID軟件進行KEGG信號通路分析，應用STRING軟件進行蛋白互作分析。

1.4 Gelatin調(diào)節(jié)2D培養(yǎng)體系細胞粘附的物理環(huán)境在常規(guī)細胞2D培養(yǎng)條件下，預先用2 %的Gelatin滴加6孔板孔內(nèi)制造粘性底壁，待干燥后以2×105個/孔分別接種LMH和DF-1細胞，于37℃，5 %CO2，DMEM(10 %胎牛血清)培養(yǎng)24 h，以1×106EID50/孔IBV M41株感染細胞，在感染第5 d收集細胞，以初始感染吸附及進入的病毒載量作為本底對照，采用qPCR方法[4]檢測IBV M41株載量，另分別設置常規(guī)細胞2D培養(yǎng)為對照，無病毒感染細胞作為陰性對照。

1.5 3D培養(yǎng)調(diào)節(jié)細胞粘附的物理環(huán)境 將1 %低熔點瓊脂滴加在48孔板底壁，制造粘性底壁，干燥后待用。用兩倍濃度的細胞培養(yǎng)基和預熱的1.36 %低熔點瓊脂凝膠配制成0.68 %的低熔點瓊脂。將50μL 0.68 %低熔點瓊脂分別與1×106EID50/孔IBV M41株病毒接種的2×105個/孔LMH和DF-1細胞等體積混勻，滴于48孔板中形成3D細胞培養(yǎng)環(huán)境。待膠體凝固后外圍加入200μL全培養(yǎng)基浸潤，在感染第5 d收集細胞，以初始感染的病毒載量作為本底對照，采用qPCR[4]和EID50兩種方法分別檢測M41株載量，另設置無病毒感染細胞作為陰性對照。

將1×105EID50/100μL IBV M41株10倍遞減稀釋后分別接種LMH和DF-1細胞，按照上述3D培養(yǎng)方法進行試驗，應用qPCR[4]檢測病毒載量，并與同劑量病毒接種雞胚進行比較。

1.6 SRC活性、p53活性及細胞周期的調(diào)控 應用SRC抑制劑PP1和PP2調(diào)控LMH細胞和DF-1細胞SRC活性，應用p53抑制劑Pifithrin-α和p53激活劑Nutlin-3a調(diào)控LMH細胞和DF-1細胞p53活性，應用細胞G1/S期抑制劑Cytochalasin D和Nocodazole、G2/M期抑制劑Panobinostat和Vincristine Sulfate調(diào)控LMH細胞和DF-1細胞周期，接種同等體積的二甲基亞砜(DMSO)作為對照。具體工作濃度如下：LMH：PP1(2μmol/L)，PP2(20μmol/L)，Pifithrin-α(10μmol/L)，Nutlin-3a(10μmol/L)，Cytochalasin D(1μmol/L)，Nocodazole(2.5μmol/L)，Panobinostat(5μmol/L)，Vincristine Sulfate(1μmol/L)；DF-1：PP1(2μmol/L)，PP2(20μmol/L)，Pifithrin-α(10μmol/L)，Nutlin-3a(10μmol/L)，Cytochalasin D(0.5μmol/L)，Nocodazole(1μmol/L)，Panobinostat(2.5μmol/L)，Vincristine Sulfate(0.5μmol/L)。用上述試劑按所標明濃度在37℃5 % CO2條件下分別處理LMH細胞和DF-1細胞24 h，然后接種1×106EID50/孔IBV M41株，在感染第5 d后收集細胞，采用qPCR方法[4]檢測病毒載量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 除全基因組轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)分析外，本實驗數(shù)據(jù)應用SPSS軟件包進行統(tǒng)計分析，并用學生雙尾t檢驗進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 IBV M41株侵入及細胞內(nèi)增殖檢測結(jié)果 利用高濃度R18(3μmol/L)預染的IBV M41株接種細胞，通過FACS檢測R18染料在細胞膜擴散情況，研究病毒囊膜與宿主細胞膜融合水平。結(jié)果顯示，與對照組(圖1A，黑色曲線)相比，接種病毒感染細胞(圖1A，紅色曲線)的熒光信號強度均顯著增高(p＜0.05)，表明IBV M41株可以侵入DF-1和LMH細胞。分別對病毒感染0、2 dpi、5 dpi的細胞進行qPCR檢測，結(jié)果顯示病毒核酸水平均無升高(圖1B)，表明IBV M41株無法在DF-1和LMH細胞中增殖。

圖1 FACS(A)和qPCR檢測(B)IBV M41株侵入DF-1和LMH細胞結(jié)果(n=3)Fig.1 Detection of IBV M41 in infected DF1 and LMH cells by FACS(A)and RT-qPCR assays(B)(n=3)

2.2 IBV全基因組轉(zhuǎn)錄譜分析 基于上述試驗分析結(jié)果，本研究進一步分析了氣管、脾臟及LMH本身基因組表達差異，結(jié)果顯示有1541個基因的表達水平在M41非易感的脾臟和LMH細胞中均高于M41易感的氣管，有2091個基因的表達水平在脾臟和LMH細胞中均低于氣管。KEGG信號通路分析顯示，在M41非易感組織和細胞共同低表達的2091基因主要富集在細胞黏附連接相關(guān)信號通路，而共同高表達的1541個基因主要富集在細胞周期相關(guān)通路和p53信號通路(圖2A和圖2B)。通過差異表達基因的蛋白互作分析，結(jié)果預測SRC可能也是限制M41株體外增殖的關(guān)鍵宿主調(diào)控因子(圖2C)。

圖2 IBV感染對雞脾臟、氣管和LMH細胞轉(zhuǎn)錄譜影響的分析Fig.2 Genome-wide transcriptional profile analysis of spleen,trachea and LMH cells upon IBV infection

2.3 Gelatin調(diào)節(jié)2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)對IBV M41株在體外培養(yǎng)細胞中增殖的影響 根據(jù)以上分析結(jié)果，本實驗采用Gelatin調(diào)節(jié)2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)兩種方法調(diào)節(jié)細胞粘附的物理環(huán)境，檢測細胞粘附物理環(huán)境對M41株體外細胞培養(yǎng)增殖的影響。qPCR檢測結(jié)果顯示，常規(guī)體外2D培養(yǎng)條件下，M41株無法在DF1和LMH細胞中增殖，進一步驗證了2.1中結(jié)果。而與常規(guī)2D培養(yǎng)相比，預先在培養(yǎng)皿底部孵育Gelatin可以有效引發(fā)M41株在DF-1細胞中的增殖(圖3A)；而在LMH細胞中盡管統(tǒng)計學差異不顯著(p=0.29)，但也觀察到了類似的趨勢(圖3B)。3D培養(yǎng)在DF1和LMH細胞中均有效引發(fā)M41增殖，并且其增殖幅度均顯著高于2D孵育Gelatin組(圖3A和圖3B，p＜0.05)。EID50檢測獲得相同的結(jié)論(圖3C)。表明調(diào)節(jié)細胞粘附的物理環(huán)境可以引發(fā)IBV在體外細胞培養(yǎng)條件下增殖。

利用qPCR方法檢測雞胚培養(yǎng)系統(tǒng)與3D體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)IBV M41株感染敏感度，結(jié)果顯示，10倍～1 000倍稀釋的IBV M41株無論在雞胚培養(yǎng)體系還是3D體外培養(yǎng)體系中均可以檢測到該病毒增殖(圖4)，表明雞胚培養(yǎng)體系與3D體外培養(yǎng)體系具有相同的靈敏度。

圖3 不同細胞粘附作用對病毒體外增殖的影響Fig.3 Effects of cell adhesion on IBV replication in vitro

2.4 SRC活性、p53活性及細胞周期對M41株增殖的影響 采用SRC抑制劑PP1、PP2及p53抑制劑Pifithrin-α，p53激活劑Nutlin-3a分別處理細胞，在IBV M41株感染第5 d應用IBV特異性qPCR檢測病毒載量，結(jié)果顯示，調(diào)控p53或SRC活性均對M41株的增殖無顯著影響(圖5A和圖5B)；而采用細胞周期抑制劑處理細胞，在M41株感染第5 d應用IBV特異性qPCR檢測病毒載量，結(jié)果顯示，G1/S期和G2/M期細胞周期抑制均對M41的增值無顯著影響(圖5C和圖5D)。表明細胞周期、p53活性及SRC活性對IBV體外增殖均無顯著影響。

圖4 IBV M41株感染雞胚培養(yǎng)系統(tǒng)與3D體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)后病毒載量檢測結(jié)果Fig.4 Comparison of the sensitivities of chicken embryo culture system and 3D cell culture system to IBV infection in vitro

3 討論

圖5 p53活性、SRC活性及細胞周期對IBV M41株體外增殖的影響Fig.5 The effect of p53 activity,SRC activity and cell cycle on IBV M41 replication in vitro

IBV除Beaudett株外均難于在體外傳代細胞中生長，嚴重限制了對該病毒生物學特性的研究[3]。病毒感染細胞分為吸附、侵入、脫殼、核酸和蛋白的合成、包裝及出芽等過程[6]。首先，本研究檢測IBV M41株是否可以在體外細胞培養(yǎng)條件下侵入宿主細胞。R18是一種與脂膜結(jié)合的染料，高濃度狀態(tài)下為無熒光的二聚體，在膜融合時被稀釋成可以發(fā)光的單體。本研究采用高濃度R18(3μmol/L)預染的M41株接種細胞，再通過FACS檢測細胞膜中的R18染料在細胞膜擴散情況即病毒囊膜與宿主細胞膜融合水平，從而確定M41株能否侵入DF-1和LMH細胞。本研究顯示，M41株可以侵入LMH和DF-1細胞但不能在細胞內(nèi)增殖，提示限制M41株在體外培養(yǎng)細胞中增殖的因素存在于細胞內(nèi)。為了探究IBV M41株體外細胞培養(yǎng)環(huán)境中限制其增殖的宿主因素，本實驗進一步對比分析易感組織氣管和非易感組織脾臟及非易感細胞系LMH的本底全基因組基因表達情況，顯示細胞粘附、細胞周期、p53及SRC活性可能是影響M41株在體外培養(yǎng)細胞內(nèi)增殖的重要因素。

進一步通過2D和3D培養(yǎng)方法對IBV M41株生物學功能驗證顯示，改變細胞粘附的物理環(huán)境可以有效引發(fā)該病毒在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中增殖。細胞粘附環(huán)境由黏著分子和細胞骨架中的微絲、微管相互作用形成。大量研究表明，這些成分在病毒的侵入及擴散中發(fā)揮重要作用。在病毒侵入細胞時，會通過受體介導宿主脂膜構(gòu)象的改變，形成合適的侵入通道促進病毒的侵入，柯薩奇B病毒通過緊密連接蛋白TJ的構(gòu)象改變形成巨胞飲方式侵入細胞[7]；水泡型口炎病毒利用網(wǎng)格蛋白介導的微絲輔助的胞吞方式侵入[8]。本研究顯示改變宿主細胞粘附的物理環(huán)境可以調(diào)控IBV M41株增殖，這可能是由于調(diào)節(jié)細胞粘附性改變了M41株侵入及擴散相關(guān)蛋白的構(gòu)象，形成了更利于病毒增殖的整體環(huán)境。此外，3D凝膠培養(yǎng)通過相互交聯(lián)的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以形成保水的三維緊密聯(lián)接的微環(huán)境，模擬了自然條件下的組織結(jié)構(gòu)[9]，增加細胞間接觸的面積，這也有利于提高M41擴散的幾率。

研究表明IBV的Beauttete株可以感染具有野生型p53的Vero細胞和p53缺失的H1299細胞系，并引起相應細胞凋亡和細胞周期抑制[10]。此外，有報道顯示，宿主SRC可以通過抑制ATP1A1抑制冠狀病毒感染[11]。然而本研究結(jié)果顯示，調(diào)控宿主p53活性、SRC活性及細胞周期對IBV的體外增殖均無顯著影響。一方面，這可能是由于不同細胞間功能相似的信號通路的調(diào)控機制不同或引起相似分子網(wǎng)絡變化過程中起主要調(diào)控作用的節(jié)點因子不同。另一方面，也可能由于上述因子和細胞生命活動分子網(wǎng)絡需要相互協(xié)同共同發(fā)揮作用，因此單純調(diào)控某一方面并不能影響IBV的體外增殖能力。

目前，全球養(yǎng)禽業(yè)主要應用IBV弱毒疫苗進行IB的防控。然而，IBV變異快，疫苗的研發(fā)速度遠遠趕不上IBV新毒株產(chǎn)生的速度[12]。此外，疫苗株的施用還存在同現(xiàn)地野毒重組的風險。因此，研究IBV與宿主互作機制，探究新型防治策略具有重要理論和應用意義。鑒于除了Beauttete株外IBV尚無體外細胞培養(yǎng)體系，本研究為IBV成熟體外細胞培養(yǎng)體系的建立及IBV致病機制研究奠定了基礎。