許書美，付月君

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006）

桿狀病毒屬于環(huán)狀雙鏈超螺旋DNA病毒,有囊膜包被，呈桿狀形態(tài)，不同病毒的基因組大小為80～180kbp。其宿主昆蟲主要是鱗翅目、膜翅目及雙翅目昆蟲。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是首先完成基因組測序的桿狀病毒，基因組大小為133 890 bp，有156個開放閱讀框[1-3]。在所有桿狀病毒的生活史中均包含2種病毒粒子形態(tài)：出芽型病毒粒子BVs和包埋型病毒粒子ODVs，其中，BVs主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的感染，ODVs主要介導(dǎo)蟲體與蟲體間的感染[4]。甜菜夜蛾（Spodoptera exiguaHubner）隸屬于鱗翅目夜蛾科，是一種世界性分布、間歇性大發(fā)生的以危害蔬菜為主的雜食性害蟲。

AcMNPV基因組包含ac109基因，推測這個基因與子代病毒的增殖有關(guān)。ac109屬于桿狀病毒AcMNPV的156個開放性閱讀框之一，ac109為逆時針方向編碼的基因，在AcMNPV基因組的逆轉(zhuǎn)錄編碼序列的38 002～39 174 nt位置，全長1 173 bp，編碼390個氨基酸的多肽，有且僅擁有一個典型的晚期或極晚期啟動子元件（GTAAG），序列具有高度保守性[5]。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明，390個氨基酸都與未知功能病毒蛋白質(zhì)家族DUF673有很高的同源性，而這個家族并未在相關(guān)文獻(xiàn)中報道[6]。在所有目前提交已測序的53株桿狀病毒的全基因組序列中，有52種桿狀病毒全基因組都具有ac109的同源物。有研究證明，ac109核心基因是桿狀病毒核衣殼正常組裝過程中所必需的基因，表達(dá)產(chǎn)物為病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白對于病毒在細(xì)胞間的傳播至關(guān)重要。它的缺失不影響病毒DNA的復(fù)制，但能夠影響病毒正常的轉(zhuǎn)運(yùn)以及影響B(tài)V進(jìn)入細(xì)胞核[7]。

本研究為進(jìn)一步明確在病毒感染宿主昆蟲過程中Ac109蛋白的功能，采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)[8-10]構(gòu)建了重組的桿狀病毒AcMNPVAc109-EGFP，并檢測了AcMNPV-Ac109-EGFP對甜菜夜蛾幼蟲的抗蟲效率，旨在為研發(fā)和應(yīng)用高抗蟲活性的重組病毒殺蟲劑提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試草地貪夜蛾卵母細(xì)胞株Sf9由山西大學(xué)細(xì)胞分子生物學(xué)課題組保存并培養(yǎng)；AcMNPV、大腸桿菌DH10 Bac菌株和pFastBac Dual-egfp由山西大學(xué)細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。受試蟲為甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hubner），蟲卵購自河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Sam I，Xho I和T4 DNA連接酶從寶生物（大連）技術(shù)公司購買；抗體anti-β-actin和anti-GFP從上海生工生物工程有限公司購買；細(xì)胞裂解液和BCA蛋白分析試劑購自碧云天生物技術(shù)公司（江蘇）；所有的化學(xué)藥品都是分析級別，購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組桿粒Bacmid-Ac109-EGFP的構(gòu)建 為構(gòu)建重組桿粒Bacmid-Ac109-EGFP，首先構(gòu)建了重組中間載體pFastbacdual-Ac109-EGFP。首先，從AcMNPV的基因組中擴(kuò)增ac109基因片段，PCR引物序列為 ac109-Sma I-F（5′-ACCCGGGATGGAGT GCCCGTTT-3′，劃線部分表示SamI位點(diǎn)）和ac109-Xho I-R：（3′-CCGCTCGAGCCAAATAATAGTTGTA C-5′，劃線部分表示Xho I位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)產(chǎn)物被克隆到pFastBac Dual-EGFP載體的Sam I位點(diǎn)與Xho I位點(diǎn)中間。構(gòu)建好的中間載體經(jīng)測序證明構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的中間載體pFastBac Dual-Ac109-EGFP轉(zhuǎn)化進(jìn)Escherichia coli strain DH10 Bac（DH10B），與 AcMNPV 基因進(jìn)行轉(zhuǎn)座重組。通過特異引物M13-F（5′-CGCCAGGGTTTTCC CAGTCACGAC-3′）和 M13-R（5′-CACACAGGAAA CAGCTATGAC-3′）進(jìn)行PCR鑒定，確定重組桿粒Bacmid-Ac109-EGFP是否構(gòu)建成功（圖1-A）。

1.3.2 重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP的構(gòu)建將生長狀態(tài)良好的（對數(shù)生長期的）Sf9細(xì)胞均勻鋪入96孔板中，待細(xì)胞長至80%后，將重組桿粒Bacmid-Ac109-EGFP（0.2 μg）和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑liposome TransFastTMTransfection Reagent（0.6 μL）（美國Promega公司）混勻后，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，用熒光顯微鏡檢測Ac109-EGFP的表達(dá)，轉(zhuǎn)染3～4 d后收集上清液，即為第1代重組病毒。然后，再用第1代病毒液侵染新鋪板的Sf9細(xì)胞，3～4 d后再次收集上清液，即為第2代重組病毒，依次類推，獲得了第3代重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP（熒光顯微鏡觀察如圖1-B所示）。第3代重組病毒即可用于后期活性檢測試驗(yàn)。

1.3.3 蝕斑試驗(yàn) 將生長狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞均勻鋪入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后，分別用不同稀釋度的1 mL病毒液AcMNPVAc109-EGFP侵染Sf9細(xì)胞2 h，然后移去病毒液，并用PBS清洗，加入1.8%的營養(yǎng)瓊脂，待其凝固后倒置。感染4～5 d后，用熒光顯微鏡檢測并統(tǒng)計AcMNPV-Ac109-EGFP處理組細(xì)胞形成的綠色熒光斑。根據(jù)綠色熒光斑數(shù)計算得出具有侵染活性的芽生型病毒滴度。

病毒滴度（pfu/mL）＝最高稀釋倍數(shù)的蝕斑數(shù)×最高稀釋倍數(shù)×接種病毒量（mL/孔） （1）

感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）＝病毒滴度（pfu/mL）×接種病毒量（mL）/感染細(xì)胞總數(shù)（2）

1.3.4 Western blot免疫印跡分析與熒光顯微鏡觀察 將生長狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞按6×106個/孔鋪入6孔板中，然后用5 MOI（multiplicity of infection，感染復(fù)數(shù)）的AcMNPV-Ac109-EGFP分別侵染12～72 h，熒光顯微鏡觀察Ac109-EGFP的表達(dá)情況。同時，Western blot定量分析Ac109-EGFP的表達(dá)量。收集侵染的細(xì)胞、裂解液裂解細(xì)胞，并收集蛋白樣，再通過BCA蛋白分析試劑測定總蛋白樣品濃度。然后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，再將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)5%的脫脂奶粉封閉液封閉1h后，4℃過夜孵育一抗（anti-β-actin和anti-GFP），之后用PBST清洗4次，每次15 min，然后再次孵育熒光二抗（IRDye680LT）1h，然后PBST再清洗4次，每次15 min。最終將PVDF膜置于ODSSY CLx中檢測。一抗anti-β-actin和anti-GFP均按1∶2 000稀釋，二抗IRDye 680LT（Li-COR有限公司，美國）按 1∶20 000 稀釋[11-12]。

1.3.5 抗蟲活性分析 采用人工飼喂病毒法經(jīng)口感染甜菜夜蛾幼蟲，檢測重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP對宿主甜菜夜蛾的致死作用。幼蟲孵化后即移入裝有27 mm3小塊人工飼料的12孔板內(nèi)，每孔1頭，成長為2齡幼蟲即可用于試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置了1個PBS緩沖液對照組和2個病毒處理組（AcMNPV-EGFP和AcMNPV-Ac109-EGFP），每組60頭幼蟲。待蟲體成長為二齡幼蟲時，每天將20 μL1×107pfu/mL的2種病毒分別滴加到試驗(yàn)組培養(yǎng)基上，連續(xù)滴加5d。對照組滴加PBS緩沖液，然后逐天記錄蟲體的質(zhì)量，并統(tǒng)計死亡率、蛹化率及羽化率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗(yàn)都進(jìn)行3個獨(dú)立試驗(yàn)，使用Excel進(jìn)行t檢驗(yàn)，評估其統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05為顯著，P＜0.01或P＜0.001為極顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Western blot免疫印跡和熒光顯微鏡檢測Sf9細(xì)胞內(nèi)Ac109的表達(dá)量

熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，在試驗(yàn)時間段內(nèi)，隨著AcMNPV-Ac109-EGFP侵染時間的延長，熒光強(qiáng)度顯著增加，侵染72 h時侵染率達(dá)到最高（圖2-A）；Western blot免疫印跡結(jié)果如圖2-B所示，其中，融合蛋白Ac109-EGFP的大小為69 ku，β-actin的大小為42 ku，與免疫印跡條帶大小一致，這進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的構(gòu)建是成功的。這一結(jié)果同樣表明，隨著時間增加，Ac109的表達(dá)量顯著增加，在侵染后的72 h時，Ac109-EGFP表達(dá)量增大。

2.2 重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP抗蟲活性分析

由圖3可知，2組病毒處理組中的甜菜夜蛾幼蟲與PBS對照組相比生長緩慢，并且有低的蛹化率和羽化率以及高的致死率，說明該類病毒對甜菜夜蛾幼蟲有較強(qiáng)的致敏性。如圖3-A所示，2組病毒處理組的幼蟲質(zhì)量均低于PBS處理組的蟲體質(zhì)量，其中，重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP處理組中蟲體質(zhì)量又略低于AcMNPV處理組；如圖3-D所示，AcMNPV與重組病毒處理組AcMNPV-Ac109-EGFP的甜菜夜蛾的半致死時間（LT50）分別為20，16 d，說明重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP與AcMNPV相比，影響了蟲體生長，且對甜菜夜蛾有更快的致死效果。

蛹化率也是檢測抗蟲效率的一個重要標(biāo)志。AcMNPV與AcMNPV-Ac109-EGFP病毒處理組的蛹化率分別為41.67%與25.00%（圖3-B），羽化率分別為20.00%和11.67%（圖3-C）。這些結(jié)果都表明，過表達(dá)ac109使得重組病毒AcMNPV-Ac109- EGFP具有更高的抗蟲效應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，過表達(dá)Ac109蛋白的重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP的抗蟲效率相較于野生型桿狀病毒更強(qiáng)。ac109基因是一種結(jié)構(gòu)基因，是桿狀病毒科中31個核心基因之一，是病毒復(fù)制的必需基因[13]。桿狀病毒核心基因?qū)λ纳顒佑兄匾绊懀鼈儗Σ《綝NA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄和核衣殼組裝等過程有關(guān)鍵作用。理論上，侵染性BV產(chǎn)量越高將導(dǎo)致越高的細(xì)胞毒性，進(jìn)而產(chǎn)生高的殺蟲效率。用重組病毒AcMNPV-Ac109-EGFP經(jīng)口服感染甜菜夜蛾幼蟲，幼蟲致死率明顯高于AcMNPV的致死率，病毒處理的幼蟲體質(zhì)量均低于PBS處理組的幼蟲體質(zhì)量，且化蛹率和羽化率也明顯低于對照組病毒及PBS處理組，說明重組病毒AcMNPVAc109-EGFP在進(jìn)入幼蟲體內(nèi)提高了子代侵染性病毒BV增殖率，從而使其在蟲體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更高的毒性。先前研究結(jié)果表明，AcMNPVac109核心基因編碼晚期結(jié)構(gòu)蛋白，是桿狀病毒核衣殼正常組裝過程中所必需的基因，表達(dá)產(chǎn)物為病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白對于病毒在細(xì)胞間的傳播至關(guān)重要[14]。ac109基因的缺失不影響病毒DNA的復(fù)制，但是會影響病毒正常的轉(zhuǎn)運(yùn)以及影響B(tài)V進(jìn)入細(xì)胞核[15]。因此認(rèn)為，過表達(dá)Ac109可以增強(qiáng)桿狀病毒的轉(zhuǎn)運(yùn)以及加快出芽型病毒BV進(jìn)入細(xì)胞核的過程，從而使子代病毒增殖加快，進(jìn)而導(dǎo)致更高的殺蟲效率。

本研究結(jié)果明確了Ac109對宿主昆蟲的殺蟲效率，為揭示AcMNPV的抗蟲機(jī)制和本文構(gòu)建的重組病毒潛在的抗蟲應(yīng)用價值提供了試驗(yàn)依據(jù)。過表達(dá)ac109基因的病毒可提高桿狀病毒的殺蟲效率，因此，可單獨(dú)或聯(lián)合其他抗蟲基因（重組形成多價病毒）作為重組微生物殺蟲劑。同時，ac109基因是病毒自身基因，因此，從生物安全性方面考慮是安全的。

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