劉小惠,吳小華,2*
(1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,石家莊 050017;2.白求恩國際和平醫(yī)院,石家莊 050082)
回顧性分析2015年7月~12月主因輸卵管因素和/或男方因素在白求恩國際和平醫(yī)院生殖中心首次接受IVF/ICSI-ET助孕的76例患者,按篩選要求分為長(zhǎng)方案組(38例)及非降調(diào)方案組(38例)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡<35歲;(2)雙側(cè)卵巢AFC共10~20個(gè);(3)體重指數(shù)18~25 kg/m2;(4)月經(jīng)周期26~35 d;(5)基礎(chǔ)激素水平正常;(6)雙側(cè)卵巢無手術(shù)史;(7)無其他內(nèi)分泌疾?。?8)近6個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用過激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)高泌乳素血癥;(2)PCOS;(3)子宮內(nèi)膜異位癥。所有受試者均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),簽署知情同意書。
1.長(zhǎng)方案:治療前一周期的黃體中期皮下注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)注射用醋酸曲普瑞林(達(dá)菲林,0.1 mg/支,博福-益普生,法國)0.1 mg/d至月經(jīng)第3天起檢測(cè)血清E2、孕酮(P)、LH、FSH并超聲監(jiān)測(cè)降調(diào)情況,達(dá)降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后(E2<183.5 pmol/L,P<3.05 nmol/L,LH<5 U/L,F(xiàn)SH<5 U/L;B超顯示無直徑大于10 mm的卵泡,子宮內(nèi)膜厚度<5 mm,無功能性囊腫)改皮下注射達(dá)菲林0.05 mg/d,同時(shí)給予促性腺激素(Gn)注射用重組人促卵泡激素(果納芬,450 U/支,默克雪蘭諾,德國)150~300 U/d直至HCG日。當(dāng)B超示雙側(cè)卵巢≥18 mm的卵泡個(gè)數(shù)/≥14 mm卵泡個(gè)數(shù)≥60%,≥14 mm卵泡血清E2值平均水平為734~1 100 pmol/L時(shí),當(dāng)晚皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素(rHCG,250 μg/支,麗珠醫(yī)藥)250 μg,35~36 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。
2.非降調(diào)方案:月經(jīng)第3天起口服來曲唑(LE,2.5 mg/片,恒瑞醫(yī)藥)2.5 mg/d,同時(shí)注射用尿促性素(HMG,75 U/支,麗珠醫(yī)藥)150~300 U肌肉注射,每天1次,連續(xù)5 d,停用LE改口服枸櫞酸氯米酚(CC,50 mg/片,塞浦路斯高特制藥)50~100 mg/d,嚴(yán)密超聲監(jiān)測(cè)卵泡直徑,并檢測(cè)血E2、P、FSH、LH。達(dá)扳機(jī)標(biāo)準(zhǔn)后,當(dāng)晚皮下注射達(dá)菲林0.2 mg,吲哚美辛栓(50 mg/片,湖北東信藥業(yè))50 mg 直腸給藥 1次/8 h,余同長(zhǎng)方案組。
3.血清收集:收集月經(jīng)第3天、降調(diào)月經(jīng)第3天、Gn啟動(dòng)日、Gn第5天、HCG日、HCG次日、OPU第3天清晨空腹外周靜脈血,并于12 h內(nèi)2 000 r/min離心10 min,取上清1 ml于1.5 ml EP管,置于-80 ℃冰箱,待檢。
4.FF收集:收集OPU時(shí)清亮FF并根據(jù)卵泡大小將其分為大中小3類(大卵泡:直徑≥ 18 mm、中卵泡:14 mm≤直徑<18 mm、小卵泡:10 mm≤直徑<14 mm),3 000 r/min離心10 min,取上清液約3 ml于5 mlEP管,置于-80 ℃冰箱,待檢。
5.IGF-1、INHB、VEGF及相關(guān)指標(biāo)測(cè)定:應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(德國DRG公司)檢測(cè)血清和FF中IGF-1水平。血清E2、P、LH、FSH水平通過化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒(ELECSYS,羅氏,德國)檢測(cè)。IGF-1、INHB(美國Anshlabs公司)及VEGF(德國DRG公司)三者檢測(cè)時(shí)間相同,具體INHB、VEGF檢測(cè)方法及結(jié)果參見文獻(xiàn)[4-5]。
納入76例IVF助孕患者,長(zhǎng)方案及非降調(diào)方案組各38例,共76個(gè)COH周期。兩組患者年齡、月經(jīng)周期、不孕年限、基礎(chǔ)內(nèi)分泌情況及AFC差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),兩組資料具有可比性(表1)。
(3)注意整個(gè)施工過程的維護(hù)工作,尤其是進(jìn)行防滲漏施工時(shí),涂刷好防水涂料后必須要進(jìn)行一定的防護(hù),防止后期出現(xiàn)其他問題,影響施工質(zhì)量。
表1 兩組患者一般資料比較(-±s)
表2 兩組患者COH相關(guān)參數(shù)比較[(-±s,%)]
注:與長(zhǎng)方案組比較,*P<0.05,**P<0.01
統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與非降調(diào)組相比,Gn啟動(dòng)日長(zhǎng)方案組血清IGF-1水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Gn啟動(dòng)后兩組血清IGF-1水平呈上升趨勢(shì)至HCG次日達(dá)高峰后下降;兩組基礎(chǔ)及Gn啟動(dòng)后的其它時(shí)間的血清IGF-1水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);兩組FF中IGF-1水平隨卵泡直徑增大而升高,兩組大、中卵泡IGF-1水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P>0.05);非降調(diào)組小卵泡IGF-1水平明顯高于長(zhǎng)方案組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3,圖1)。
表3 兩組患者血清及FF中IGF-1水平變化(-±s)
注:d3:基礎(chǔ)月經(jīng)第3天;dMPDR3:降調(diào)月經(jīng)第3天;dGn0:Gn啟動(dòng)日;dGn5:Gn第5天;dHCG:HCG日;dHCG1:HCG次日;dOPU2:OPU后2天;BF:大卵泡;MF:中卵泡;SF:小卵泡;與長(zhǎng)方案組比較,*P<0.05,**P<0.01
d3:基礎(chǔ)月經(jīng)第3天;dMPDR3:降調(diào)月經(jīng)第3天;dGn0:Gn啟動(dòng)日;dGn5:Gn第5天;dHCG:HCG日;dHCG1:HCG次日;dOPU2:OPU后2天;BF:大卵泡;MF:中卵泡;SF:小卵泡圖1 兩組患者血清(A)和卵泡液(B)中IGF-1水平變化
兩方案中血清及FF IGF-1水平與Gn用量負(fù)相關(guān),與反應(yīng)COH結(jié)局的獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN受精數(shù)、可利用胚數(shù)等正相關(guān);與COH結(jié)局相關(guān)性由強(qiáng)到弱的血清IGF-1檢測(cè)時(shí)間分別為:Gn第5天、基礎(chǔ)月經(jīng)第3天、HCG日、HCG次日、Gn啟動(dòng)日及OPU第3天,長(zhǎng)方案降調(diào)月經(jīng)第3天IGF-1水平與COH結(jié)局無明確相關(guān)性(P>0.05);兩方案中大卵泡IGF-1水平與COH結(jié)局相關(guān)性最強(qiáng);中卵泡IGF-1水平與COH結(jié)局也存在一定的相關(guān)性;但小卵泡IGF-1水平與COH結(jié)局的相關(guān)性不明確;除降調(diào)月經(jīng)第3天及小卵泡IGF-1,兩組血清及FF IGF-1水平與INHB水平顯著正相關(guān)(P<0.01);除降調(diào)月經(jīng)第3天及Gn啟動(dòng)日IGF-1,兩組血清及FF IGF-1水平與VEGF水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)(表4)。
IGF-1是一種結(jié)構(gòu)和功能與胰島素相似,分子量為7 471 Da的多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子,與IGF受體結(jié)合后具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、參與新陳代謝等胰島素樣生物學(xué)效應(yīng)。IGF-1主要由肝臟產(chǎn)生,卵巢顆粒細(xì)胞分泌的IGF-1可在局部通過自/旁分泌調(diào)節(jié)作用參與卵泡募集、生長(zhǎng)發(fā)育、閉鎖及卵母細(xì)胞成熟等,在卵泡和胚胎發(fā)育方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。
表4 血清及FF中IGF-1與COH結(jié)局、INHB及VEGF相關(guān)性分析
注:*P<0.05,**P<0.01
自然周期中血清IGF-1水平隨著卵泡發(fā)育逐漸升高[7],關(guān)于其在COH過程中的具體變化鮮有報(bào)道[8-9]。本文研究結(jié)果顯示:COH降調(diào)過程中血清IGF-1水平呈下降趨勢(shì),降調(diào)足夠長(zhǎng)時(shí)間(18 d)時(shí)血清IGF-1水平顯著下降;且Gn啟動(dòng)日長(zhǎng)方案組血清IGF-1水平較非降調(diào)組明顯下降??赡茉?yàn)椋篊OH過程中垂體分泌的生長(zhǎng)激素(GH)可通過與其跨膜受體結(jié)合后啟動(dòng)IGF-1及其相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)IGF-1 mRNA的表達(dá)[10]。此外,垂體分泌的Gn可通過促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的擴(kuò)增,使顆粒細(xì)胞分泌的IGF-1增加[11]。COH降調(diào)過程中,外源性給予GnRH-a使垂體處于脫敏狀態(tài),垂體分泌的促進(jìn)IGF-1表達(dá)的Gn和GH受到抑制,IGF-1生成減少;與此同時(shí),IGF-1可通過與下丘腦上的IGF-1受體結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)垂體分泌Gn及GH的作用[12],垂體降調(diào)節(jié)間接引起的處于低水平的IGF-1會(huì)抑制IGF-1通過下丘腦對(duì)垂體Gn及GH分泌的促進(jìn)作用,進(jìn)而導(dǎo)致IGF-1分泌的進(jìn)一步下降。因此,COH降調(diào)過程中IGF-1分泌受下丘腦-垂體軸的影響呈現(xiàn)出循環(huán)減少。
降調(diào)過程中,GnRH-a對(duì)垂體Gn分泌的直接抑制作用以及IGF-1分泌的循環(huán)減少對(duì)Gn分泌的間接抑制作用可使COH過程中對(duì)Gn刺激有反應(yīng)的循環(huán)募集受到抑制,使中小竇卵泡發(fā)育受到抑制,這樣有利于卵泡的同步化發(fā)育。本研究中,GnRH-a降調(diào)足夠長(zhǎng)時(shí)間(18天)明顯下降的血清IGF-1水平預(yù)示著降調(diào)節(jié)對(duì)竇卵泡的同步化作用較好,可用于臨床選擇合適的Gn啟動(dòng)時(shí)間。然而,本文降調(diào)后的血清IGF-1水平與預(yù)測(cè)卵巢對(duì)Gn反應(yīng)性的Gn用量及獲卵數(shù)關(guān)系不大(P>0.05),說明降調(diào)后的血清IGF-1水平不能很好的預(yù)測(cè)卵巢反應(yīng)性,對(duì)于指導(dǎo)臨床選擇合適的Gn啟用量及COH過程調(diào)整Gn用量的意義有待探討。
本研究中,Gn啟動(dòng)后的兩組血清IGF-1水平呈上升趨勢(shì)至HCG次日達(dá)高峰后下降。Gn啟動(dòng)后IGF-1升高的可能原因:(1)外源性及內(nèi)源性增加的Gn對(duì)顆粒細(xì)胞分泌的IGF-1的正性調(diào)節(jié)作用;(2)COH過程中,E2水平及顆粒細(xì)胞上表達(dá)的E2受體不斷增加,而E2又可通過與E2受體結(jié)合提高IGF-1基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)顆粒細(xì)胞表達(dá)IGF-1 mRNA[13];(3)IGF-1作為顆粒細(xì)胞重要的有絲分裂原,可以促進(jìn)FSH對(duì)顆粒細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用[14],同時(shí)可通過影響P450生成促進(jìn)顆粒細(xì)胞上芳香化酶的活性使E2水平升高,進(jìn)而促進(jìn)卵泡發(fā)育及顆粒細(xì)胞擴(kuò)增,使顆粒細(xì)胞分泌的IGF-1進(jìn)一步增加[15-16]。呂芳等[17]的最新研究支持本文觀點(diǎn)。而HCG次日后IGF-1水平下降則可能是由于OPU時(shí)造成顆粒細(xì)胞減少或受損引起。由于臨床工作的局限性,本文取材未收集到OPU當(dāng)日及OPU次日的血清標(biāo)本,有待進(jìn)一步研究。
此外,本文Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明:雖然基礎(chǔ)及Gn第5天的血清IGF-1水平與Gn用量及E2HCG存在一定的相關(guān)性,但其他時(shí)間的血清IGF-1水平與其相關(guān)性不大;各個(gè)時(shí)期的血清IGF-1與COH結(jié)局呈正相關(guān)關(guān)系,且Gn第5天IGF-1水平與其相關(guān)性最好。以上說明血清IGF-1水平用于預(yù)測(cè)卵巢對(duì)Gn反應(yīng)性的意義尚不明確,有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究,但血清IGF-1水平可以很好地用于COH結(jié)局的預(yù)測(cè),并且在臨床工作中可根據(jù)Gn第5天IGF-1水平及時(shí)調(diào)整Gn用量。
FF中各種細(xì)胞因子在很大程度上能刺激卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育,與卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育潛能密切相關(guān)。FF中IGF-1通過卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞核與質(zhì)的成熟過程中發(fā)揮著重要作用[17]。本文中FF IGF-1水平隨卵泡直徑增大而升高,且大卵泡IGF-1水平與卵巢反應(yīng)性及COH結(jié)局相關(guān)性最好,中卵泡IGF-1水平與其也有較好的相關(guān)性,但小卵泡IGF-1水平與卵巢反應(yīng)性及COH結(jié)局的相關(guān)性不明確。以上表明大中卵泡IGF-1水平可用于卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育潛能的評(píng)估。Mehta等[1]的研究支持本文觀點(diǎn)。這是因?yàn)镃OH過程中在IGF-1的作用下卵泡壁層顆粒細(xì)胞及卵丘細(xì)胞數(shù)目逐漸增加[18],其上表達(dá)的GDF-9及BMP-15受體數(shù)目增加,從而可以加強(qiáng)卵母細(xì)胞分泌的GDF-9及BMP-15與顆粒細(xì)胞及卵丘細(xì)胞上表達(dá)的特異性受體結(jié)合,進(jìn)而發(fā)揮GDF-9及BMP-15促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟、受精和提高卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育潛能的作用[19]。此外,顆粒細(xì)胞分泌的IGF-1可通過與IGF-1R結(jié)合,激活酪氨酸激酶,啟動(dòng)絲裂原激活蛋白酶(MAPK)途徑和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑,促進(jìn)其抗凋亡作用,進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟及胚胎形成[20]。
本文顯示:除降調(diào)月經(jīng)第3天及小卵泡IGF-1,兩組血清及FF IGF-1水平與INHB水平顯著正相關(guān)(P<0.01),提示在COH過程中IGF-1對(duì)INHB分泌可能存在正向調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),IGF-1與顆粒細(xì)胞結(jié)合后可促進(jìn)顆粒細(xì)胞合成INHB及LH,增加的INHB和LH又可擴(kuò)大IGF-1效應(yīng)[21],包括其通過PI-3激酶途徑介導(dǎo)的甾體激素生成。因此,在COH過程中,IGF-1與INHB相互促進(jìn),參與了卵泡的募集、生長(zhǎng)發(fā)育、成熟及胚胎發(fā)育,與COH結(jié)局密切相關(guān)。
此外,本文中除降調(diào)月經(jīng)第3天及Gn啟動(dòng)日IGF-1,兩組血清及FF IGF-1水平與VEGF水平負(fù)相關(guān)(P<0.05),提示在COH過程中IGF-1對(duì)VEGF分泌可能存在負(fù)向調(diào)節(jié)作用。Clarke等[22]的研究表明在常氧狀態(tài)下IGF-1可促進(jìn)VEGF表達(dá),而在缺氧狀態(tài)下時(shí)則主要表現(xiàn)為由低氧通過PI-3激酶途徑引起VEGF代償性增高。COH過程中由于多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育,卵泡供氧不足常表現(xiàn)為VEGF代償性升高,IGF-1在此過程中與VEGF的具體關(guān)系尚不明確。本文研究為COH過程中IGF-1與VEGF的關(guān)系提供了一定的理論依據(jù),但關(guān)于其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。
總之,降調(diào)后顯著下降的血清IGF-1水平預(yù)示著降調(diào)節(jié)對(duì)卵泡同步化作用較好;COH過程中的血清及FF IGF-1水平與卵巢反應(yīng)性的關(guān)系尚不明確,但是血清及大中卵泡IGF-1水平與COH結(jié)局密切相關(guān),并且可能促進(jìn)INHB分泌,抑制VEGF產(chǎn)生。IVF助孕患者通過檢測(cè)血清及FF中IGF-1水平對(duì)選擇合適的Gn啟動(dòng)時(shí)間、及時(shí)調(diào)整Gn用量及預(yù)測(cè)COH結(jié)局具有重要指導(dǎo)意義。
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