韓忠，王金花，成軍虎，曾新安

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣州廣東 510640）（2.廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室，廣州廣東 510640）

多孔淀粉（porous starch）是一種新型、環(huán)境友好型的天然多孔性材料，具有原料來源廣泛、成本低、綠色環(huán)保、較大的比表面積、較低的堆積密度與良好的吸附性能等諸多優(yōu)點，被廣泛地應用到化工工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)與農業(yè)等領域，引起了國內外研究者的高度關注[1,2]。目前，用來制作多孔淀粉的原料主要是谷類淀粉和根莖類淀粉，而作為全世界尤其是亞洲地區(qū)主食之一的大米，其相關研究較少。亞洲人飲食相對而言多菜少肉，造成普遍的鋅攝入量不足、吸收不良或者遺傳缺陷；而鋅元素是人體生理功能所需量僅次于鐵排名第二的微量元素，它是機體酶的重要組成成分，間接地調控著基因的表達、免疫、細胞分化和機體生長等生命過程[3～5]。因此，從日常飲食中適當?shù)匮a充鋅元素及在食品工業(yè)中添加鋅強化劑都是必不可少的。

高壓脈沖電場技術（Pulsed Electric Fields，PEF）是一種對兩電極間的流態(tài)食品反復施加高場強的短脈沖進行處理的技術，屬于非熱物理技術，能在有效保存食品天然理化性質的同時達到滅菌的效果[6]，近來又被用于大分子物質的修飾改性、天然活性成分的提取和化學反應強化等方面[7～10]。從化學反應的角度來看，脈沖電場能夠有效地降低各種反應所需的活化能，促進金屬離子的螯合效率、淀粉酯化反應效率和美拉德反應初級階段等[11～14]。因此，本文擬采用傳統(tǒng)環(huán)保的雙酶協(xié)同法制備具有強吸附性能的大米多孔淀粉[15]，并借助高壓脈沖電場促進鋅元素與多孔的吸附絡合反應，以達到高效富集鋅元素的研究目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金龍魚南方優(yōu)質絲苗米，益海嘉里糧油食品有限公司；大米淀粉參考Lumdubwong[16]方法改進優(yōu)化制得；豬胰酶（Cat.No.P7545，活力8×USP/mg），美國Sigma-Aldrich公司；淀粉葡萄糖苷酶（Cat.No.A7095，活力300 Unit/mL），美國Sigma-Aldrich公司；乙酸鋅，廣州化學試劑廠，分析純。

1.2 主要儀器

SY-2-500型脈沖電場處理裝置，華南理工大學脈沖電場課題組自制；VECTOR33型紅外光譜儀，德國Bruker公司；S3700型掃描電子顯微鏡日本日立公司；日立Z-2000塞曼原子吸收分光光度儀，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 雙酶法協(xié)同制備大米多孔淀粉

稱取一定量大米淀粉，置于100 mL離心管中，加入一定量pH值為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（固液比1:4），置于溫度為50 ℃的振蕩水浴鍋中預熱20 min。精確移取一定配比的兩種酶加入淀粉懸濁液中，振蕩，開始計時，經過一定時間，加入一定量4%氫氧化鈉溶液滅酶。淀粉乳離心(5000 r/min，離心10 min)后，吸取1 mL上清液于25 mL的比色管測定吸光度。下層淀粉固體用蒸餾水洗滌、離心三次(5000 r/min，離心10 min)，在45 ℃的條件下干燥24 h，之后用粉碎機對淀粉進行粉碎，過100目篩，得到多孔淀粉樣品，置于封口袋中保存。

1.3.2 淀粉水解率的測定

吸取1 mL樣品于25 mL的比色管中，然后加入2.00 mL DNS溶液。混勻后，置于沸水浴中顯色2 min，然后迅速冷卻至室溫，并用蒸餾水定容到25 mL，搖勻。用準備好的空白液（1 mL緩沖液，2 mL DNS，同上述處理）調零，在540 nm波長下用1 cm比色皿測定吸光度，計算水解率。

式中，C-離心后上清液還原糖濃度，（mg/mL）；N-樣品稀釋倍數(shù)；V-反應體系中液相體積，（mL）；0.9-從葡萄糖到淀粉的轉化系數(shù)；W-反應前底物重量，（mg）。

1.3.3 吸油率的測定

精確稱量離心管質量m1（g），稱取1 g左右淀粉置于離心管中，精確稱取其質量m2（g），恒溫下與5 mL色拉油攪拌混合20 min，在5000 r/min下離心20 min，棄去上清液，精確稱量淀粉質量為m3（g）。按以下公式計算吸油率（%）：

1.3.4 脈沖電場協(xié)同大米淀粉鋅絡合物的制備

稱取10 g原淀粉（或多孔淀粉）與500 mL的乙酸鋅溶液（0.1 mol/L）混合于燒杯中，并置于磁力攪拌水浴鍋進行攪拌，在室溫下將懸濁液泵入到脈沖電場處理室進行處理（電壓20 V、脈寬40 μs、頻率1 kHz、流速24 mL/min，有效處理時間分別為2.88×103μs、8.64×103μs、14.4×103μs）后，將懸濁液離心（5000 r/min），棄去上清液，下層淀粉固體用蒸餾水反復洗滌并離心三次后，置于45 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥24 h，粉碎即得大米多孔淀粉鋅絡合物樣品。

1.3.5 淀粉鋅絡合物的鋅含量的測定

稱取淀粉鋅絡合物約1～5 g于馬福爐中灰化，0.5 mol/L的硝酸溶液定容后進行火焰原子吸收光譜法測定。

1.3.6 淀粉鋅絡合物結構測定

掃描電鏡法（SEM）、紅外光譜法(FT-IR)。

2 結果與分析

2.1 水解率與比表面積及吸油率之間的關系

比表面積的大小決定著物質的吸附性能，比表面積越大吸附性能就越強，秦瑩采用灰色關聯(lián)度分析，得出了可以通過水解率的測定推測比表面積的變化情況的結論[17]，但是比表面積與多孔淀粉的吸附性不具有絕對的正相關性。因此，我們采用水解率和吸油率雙重指標來衡量多孔淀粉吸附性的優(yōu)劣。聶麗紅等通過測定不同水解率多孔淀粉的比表面積，探究多孔淀粉水解率與比表面積的關系以及水解率與吸油率的關系[18]，其結果如圖1所示。

圖1 水解率與吸油率及比表面積之間的關系Fig.1 Relationship between the hydrolysis rate (oil-absorption rate) and the specific surface area

由圖1可知，隨著水解率的上升，比表面積增大，在水解率達到30%以后，比表面積呈現(xiàn)較大增長，這是由于酶解導致淀粉顆粒粒度減小與小孔徑增大的雙重結果，但這只能體現(xiàn)淀粉水解產生還原糖的量，卻不能完全體現(xiàn)成孔吸附性能的好壞。因此，我們再結合吸油率來表征多孔淀粉的吸附性能。隨著水解率的上升，形成的空腔的體積越大，多孔淀粉的吸油率上升，當水解率為50%～55%時，多孔的空腔體積達到了淀粉顆粒的一半，此時吸油率最高；在水解率接近60%的時候，多孔淀粉的吸油率呈急劇下降趨勢，意味著多孔淀粉的孔結構出現(xiàn)崩塌，失去多孔淀粉本身穩(wěn)固的機械性質，吸附性能減弱。

2.2 復合酶法制備大米微多孔淀粉工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 酶含量對水解率和吸油率的影響

圖2 酶含量對水解率和吸油率的影響Fig.2 Effects of enzyme content on the hydrolysis rate and oil-absorption rate

在底物濃度為20%（m/m），反應溫度50 ℃，反應時間12 h，pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，酶配比（α-淀粉酶：葡萄糖苷酶）為1:12的實驗條件下，研究酶含量（0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）對水解率和吸油率的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨著酶含量的增加，水解率不斷上升，吸油率先上升后下降，在酶含量為1.0%時，多孔淀粉水解率達到50%，孔空腔體積接近淀粉顆粒體積的一半，此時，吸油率達到最大。此后，隨著水解率的增大，吸油率呈現(xiàn)下降趨勢，與圖1結果一致，由于淀粉水解過度導致的多孔結構崩塌所致，因此，制備多孔淀粉的最佳酶含量為1.0%。

2.2.2 酶配比對水解率和吸油率的影響

圖3 酶配比對水解率和吸油率的影響Fig.3 Effects of the enzyme ratio on the hydrolysis rate and oil-absorption rate

在底物濃度為20%（m/m），反應溫度50 ℃，反應時間12 h，pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，酶含量為1.0%的條件下，研究酶配比（α-淀粉酶：葡萄糖苷酶）對水解率和吸油率的影響，結果見圖3。

由圖3可知，在酶配比為1:8時，水解率超出50%，淀粉結構被破壞，吸油率較低，當酶配比為1:12時，水解率達到50%左右，多孔淀粉吸油率達到峰值。酶配比的變化導致水解率和吸油率的變化主要是由于兩種酶之間存在著協(xié)同作用，α-淀粉酶是采用隨機切斷糖鏈內部的α-1,4-鏈的水解方式，當其比例較高時就容易出現(xiàn)水解過度、成孔不均的現(xiàn)象，從而導致多孔淀粉的吸油率降低；所以，選擇適宜的酶配比對多孔淀粉的成孔均勻性起著至關重要的作用，因此，制備多孔淀粉的最佳酶配比（α-淀粉酶:葡萄糖苷酶）為1:12。

2.2.3 酶解時間對水解率和吸油率的影響

圖4 酶解時間對水解率和吸油率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time on the hydrolysis rate and oil-absorption rate

在底物濃度為20%（m/m），反應溫度50 ℃，酶配比（α-淀粉酶：葡萄糖苷酶）為1:12，pH 4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，酶含量為1.0%的條件下，研究處理時間（8 h、10 h、12 h和14 h）對水解率和吸油率的影響。由圖4可知，隨著酶解時間的增加，水解率逐漸增大，而吸油率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當酶解時間為12 h時，水解率為50%左右，吸油率達到峰值.當酶解時間增加到14 h時，水解率繼續(xù)增加，但吸油率已出現(xiàn)快速下降，這說明長時間的酶解導致多孔淀粉結構崩塌。因此，制備多孔淀粉的最佳酶解時間為12 h。

2.2.4 正交優(yōu)化多孔大米淀粉的制備

在單因素試驗的基礎上，采用L9(33)正交試驗來考察酶含量、酶配比和酶解時間對多孔淀粉吸油率的影響，正交實驗水平因素表如表1所示。

由表2可知，三個因素對淀粉水解率的影響主次順序依次為：酶含量>酶配比>酶解時間，最佳條件為A2B2C2，三個因素對淀粉吸油率的影響主次順序依次為：酶解時間>酶配比>酶添加量，最佳條件為A2B2C2，綜上所述，雙酶協(xié)同制備大米多孔淀粉工藝的最佳條件為A2B2C2，即酶含量1.0%，酶配比（α-淀粉酶：葡萄糖苷酶）1:12，酶解時間12 h。經驗證實驗得：最佳條件下可制得水解率50%、吸油率96.3%的大米多孔淀粉。

表1 正交實驗水平因素表Table 1 Orthogonal experiment level factors

表2 正交實驗設計及實驗結果Table 2 Orthogonal experiment design and results

2.3 脈沖電場協(xié)同制備大米多孔淀粉鋅絡合物

圖5 不同脈沖電場處理時間對淀粉鋅絡合量的影響Fig.5 Effects of PEF treatment time on the znic content of starch-Zn complex

由圖5可知，原淀粉本身的鋅含量非常少，且隨著電場處理時長的增加，淀粉的鋅絡合量呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，很明顯地體現(xiàn)了脈沖電場處理對鋅絡合反應的促進作用。產生此現(xiàn)象的原因有二，其一為電場本身的電擊穿作用導致的淀粉表面破損，使得參與金屬離子絡合反應的比表面積增大；其二，脈沖電場具有產生瞬時高能的作用，可以促使淀粉顆粒無定型通道的張開，從而牽引鋅離子進入淀粉顆粒內部進行絡合配位反應。

其中，從脈沖電場強化不同水解率的多孔大米淀粉的鋅絡合反應來看：40%水解率、電場處理2.88 ms的多孔淀粉鋅絡合物中鋅含量最高，其次是30%水解率、電場處理8.64 ms的多孔淀粉鋅絡合物，50%水解率、電場處理2.88 ms的多孔淀粉鋅絡合物中鋅含量最低；40%水解率的多孔淀粉鋅絡合物中鋅含量都高于50%水解率淀粉的，且隨著電場處理時間的增加而減少；這是由于低水解率的多孔淀粉具有多孔吸附和高無定形區(qū)金屬離子配位點的雙重特點所致，此外高水解率的多孔淀粉孔隙結構機械強度相對較低，在強電場作用下容易出現(xiàn)崩塌，從而導致其鋅離子絡合能力降低[20,21]。

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2.4 脈沖電場協(xié)同制備大米多孔淀粉鋅絡合物的形態(tài)觀察

圖6 掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy photographs

時間的增加，淀粉顆粒表面變得粗糙甚至出現(xiàn)一些坑洞。圖6e～f分別為40%水解率的多孔淀粉在脈沖電場（2.88 ms和8.64 ms）協(xié)同下進行鋅絡合反應之后的掃描電鏡圖由圖可知，酶解淀粉具有更多的空隙，這是雙酶協(xié)同水解淀粉顆粒的無定形區(qū)的結果[19]，同時，比表面積的增大有助于其對鋅元素的吸附及脈沖電場的強化絡合作用。但隨著脈沖電場處理時間的增加，相同水解率的淀粉空隙出現(xiàn)部分崩塌，與結果2.3中40%水解率的多孔淀粉在脈沖電場處理下，時間越長、鋅絡合量越低相符合。

2.5 大米多孔淀粉鋅絡合物的紅外光譜分析（FT-IR）

圖7 大米淀粉及不同處理條件下淀粉鋅絡合物的紅外衍射圖Fig.7 Infrated diffraction patterns of rice starch and starch-Zncomplex with different treatments

紅外光譜分析能夠有效的鑒別有機物中的官能團，圖7分別為原淀粉、原淀粉鋅絡合物、40%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡合物，50%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡合物的紅外光譜圖。

淀粉的結構特征在紅外光譜圖中的紅外吸收峰位置及結構歸屬分別為：3377 cm-1為氫鍵締合的O-H伸縮振動，該峰寬而強；2931 cm-1為CH2的C-H不對稱伸縮振動吸收峰；1643 cm-1為H20的彎曲振動吸收峰；1340 cm-1～1500 cm-1為CH2的彎曲振動吸收峰；1150 cm-1～978 cm-1主要歸屬于淀粉各羥基的C-O伸縮振動和環(huán)醚C-O-C吸收峰；1018 cm-1、1081 cm-1和1157 cm-1分別是伯醇、仲醇和叔醇的C-O伸縮振動吸收特征峰；578 cm-1、761 cm-1和854 cm-1等處是-CH2的搖擺振動吸收特征峰。

原淀粉、原淀粉鋅絡合物、40%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡合物和50%水解率-PEF多孔淀粉鋅絡合物的紅外圖譜吸收峰大部分是相同的，說明基本骨架相同。與原淀粉相比，原淀粉鋅絡合物淀粉、經脈沖電場作用的多孔淀粉鋅絡合物與乙酸鹽作用主要影響羥基伸縮振動，伯醇的C-O伸縮振動吸收特征峰移動明顯，而仲醇C-O伸縮振動吸收特征峰和叔醇C-O伸縮振動吸收特征峰變化不明顯，說明Zn與淀粉羥基相互作用，伯醇OH參與反應，仲、叔醇-OH可能參與反應。與原淀粉相比，淀粉鋅絡合物的羥基伸縮振動變化明顯，說明鋅離子與淀粉羥基基發(fā)生反應。

3 結論

3.1 以水解率和吸油率為指標，通過單因素與正交試驗得到了多孔大米淀粉最優(yōu)工藝條件：酶含量1.0%、酶配比1:12、酶解12 h，此時，多孔大米淀粉的水解率為50%，吸油率為96.3%。同時，利用脈沖電場處理強化多孔淀粉鋅絡合反應，結果顯示：水解率40%的多孔大米淀粉經脈沖電場（2.88×103μs）處理后的鋅絡合含量最高，為352.85 mg/100 g。

3.2 借助掃描電鏡可觀察到：酶解使淀粉呈現(xiàn)隨機性的多孔，脈沖電場進一步加強了原淀粉與30%和40%水解率淀粉多孔的形成與吸附能力，而水解率達到50%的多孔淀粉在脈沖電場的處理下會出現(xiàn)空隙崩塌，導致其鋅絡合量下降。紅外光譜顯示：淀粉鋅絡合物相對于原淀粉而言，羥基伸縮振動變化明顯，說明鋅離子與淀粉羥基發(fā)生了配位反應。

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