楊曉娟，黃秀敏，鮑志寧，黃宜輝，戴南藝，譚穎嫦

（廣州市微生物研究所，廣東廣州 510630）

我國(guó)豆類資源豐富，并且大豆中含有蛋白質(zhì)、低聚糖、大豆異黃酮、磷脂和維生素等多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分[1]。大豆蛋白含有多種人體必需氨基酸，不僅能夠補(bǔ)充動(dòng)物蛋白中某些氨基酸的不足，還具有降低膽固醇、抗氧化和抗腫瘤等益生作用[2,3]，更好地滿足人們對(duì)蛋白質(zhì)的需求。以豆奶和牛奶為原料，依靠乳酸菌的發(fā)酵作用生產(chǎn)發(fā)酵型大豆復(fù)合蛋白飲料，既能夠起到雙重的營(yíng)養(yǎng)和保健作用[4]，又能降低生產(chǎn)成本、解決豆奶貨架期較短的狀況[5]，為我國(guó)大豆資源的利用以及新型大豆復(fù)合蛋白飲料的開(kāi)發(fā)創(chuàng)造新的途徑。

值得注意的是，實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，在豆乳基原料本身不含脲酶的情況下，用乳酸菌發(fā)酵的活菌型大豆復(fù)合蛋白飲料中有脲酶被檢出。按照《GB 7101-2015食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》規(guī)定，以大豆為原料的飲料需進(jìn)行脲酶試驗(yàn)且檢出結(jié)果為陰性，即脲酶不得檢出[6]，但國(guó)標(biāo)未注明其不適用于活菌型飲料，沒(méi)有考慮到發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌自身造成脲酶檢出陽(yáng)性的可能情況。脲酶（Urease）是能將尿素水解成NH3和CO2的酶，本身沒(méi)有毒性，大豆中含有胰蛋白酶抑制劑、植物血凝素、皂甙等熱敏性物質(zhì)，而脲酶對(duì)熱敏感性與胰蛋白酶抑制劑、植物血凝素、皂甙等極為相似，利用脲酶試驗(yàn)可以鑒別胰蛋白酶抑制劑和血凝素等的存在程度[7,8]，這也是《GB 7101-2015 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》中要求檢測(cè)以大豆為原料的飲料是否含有脲酶的原因。研究表明，在自然界中已鑒定的產(chǎn)脲酶菌株包括克雷白氏桿菌、變形桿菌、乳酸桿菌和鏈球菌[9]。國(guó)外已有對(duì)牛乳發(fā)酵中乳酸菌與脲酶活性關(guān)系等進(jìn)行較深入的研究，嗜熱鏈球菌和羅伊氏乳桿菌擁有脲酶基因簇，是少有已知可產(chǎn)生脲酶的乳酸菌菌株[10～14]；Stefania等[10]首次發(fā)現(xiàn)，在牛乳缺乏碳源的條件下，嗜熱鏈球菌的脲酶活性可提高德氏乳桿菌保加利亞亞種的胞內(nèi)pH從而促進(jìn)其生長(zhǎng)；至于豆乳飲料中乳酸菌與脲酶產(chǎn)生關(guān)系還未見(jiàn)具體研究報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料的報(bào)道也多為生產(chǎn)工藝的研究，而乳酸菌對(duì)活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料中脲酶的影響研究尚未見(jiàn)諸報(bào)端。本文從實(shí)際生產(chǎn)中質(zhì)量管理發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題出發(fā)，以不含脲酶的豆?jié){粉為原料，考察了由四種不同乳酸菌菌株發(fā)酵的大豆復(fù)合蛋白飲料在發(fā)酵過(guò)程及貯藏過(guò)程中活菌數(shù)和脲酶的變化情況，以期為該類產(chǎn)品的生產(chǎn)和推廣提供新的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus，CLB134-1）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，ST-L134-7-P），由華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保藏；羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri，CICC6118）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，GBHM-21），由廣東省微生物種質(zhì)資源庫(kù)保藏。

1.2 試劑與試驗(yàn)設(shè)備

1.2.1 主要試劑

龍王純豆?jié){粉-C42，食品級(jí)，黑龍江省龍墾龍王食品有限公司；雀巢全脂奶粉，食品級(jí)，雀巢中國(guó)有限公司；白砂糖，食品級(jí)，雷州市信通糖業(yè)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 主要儀器設(shè)備

微電腦電陶爐，廣東艾詩(shī)凱奇智能科技有限公司；超凈工作臺(tái)，江蘇凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；堿式滴定管，北玻集團(tuán)；海爾冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料的制備工藝流程

1.3.2 試驗(yàn)樣品的制備

在接種環(huán)節(jié)，1#樣品接種羅伊氏乳桿菌，2#樣品接種干酪乳桿菌，3#樣品接種德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌（活菌量1:1），4#樣品接種四種菌的組合菌（活菌量1:1:1:1），其他工藝環(huán)節(jié)相同。

1.3.3 活菌數(shù)的測(cè)定

參考國(guó)標(biāo)GB 4789.35-2010[15]。

1.3.4 脲酶的定性測(cè)定

參考國(guó)標(biāo)GB 5009.183-2003[16]。

1.3.5 脲酶的定量測(cè)定

參考國(guó)標(biāo)GB/T 8622-2006[17]。

1.3.6 分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取(p)=0.05，所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊時(shí)組間比較采用Duncan法，方差不齊時(shí)組間比較采用DunnettsT3法。p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并采用Excel 2013軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)脲酶的影響

2.1.1 發(fā)酵過(guò)程中的脲酶定性結(jié)果

四種大豆復(fù)合蛋白飲料樣品在發(fā)酵過(guò)程中的脲酶定性結(jié)果如圖1所示。1#、2#和4#樣品在發(fā)酵到第6 h開(kāi)始有脲酶檢出，而3#樣品在發(fā)酵到第3 h即開(kāi)始檢出脲酶，并且，四種樣品中檢出的脲酶定性結(jié)果均呈淡黃色或微黃色澄清液，脲酶定性為弱陽(yáng)性。由此得出，羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌在以單菌或者組合菌發(fā)酵的過(guò)程中均可產(chǎn)生脲酶。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中的脲酶定性結(jié)果Fig.1 The qualitative results of urease during fermentation

圖2 發(fā)酵過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性變化Fig.2 The changes of viable bacteria amount and urease activity during fermentation

大豆復(fù)合蛋白飲料在發(fā)酵過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性變化結(jié)果如圖2所示，而樣品間活菌數(shù)和脲酶活性的差異性分析結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.2 發(fā)酵過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性變化

表1 發(fā)酵過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性差異性分析結(jié)果Table 1 Differential analysis results of viable bacteria amount and urease activity during fermentation

在發(fā)酵過(guò)程中，四種樣品中活菌數(shù)均呈逐漸增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。由表1可知，在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)間段，四種樣品中的活菌數(shù)彼此間均存在顯著性差異（p<0.05）。相較而言，羅伊氏乳桿菌在豆乳基中的生長(zhǎng)狀況較干酪乳桿菌有優(yōu)勢(shì)，且二者在活菌數(shù)上存在顯著性差異（p<0.05），但1#和2#樣品在發(fā)酵結(jié)束時(shí)活菌數(shù)僅增加了一個(gè)數(shù)量級(jí)，可見(jiàn)單株的羅伊氏乳桿菌和干酪乳桿菌并不適合在本研究的豆乳基中生長(zhǎng)。前人研究表明，使用組合菌發(fā)酵可有效克服單一菌株發(fā)酵中的不足之處[18]。德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌組合是傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵劑的基本配方，3#樣品中活菌數(shù)增長(zhǎng)較快，兩種菌的互惠共生作用使得發(fā)酵到第3 h活菌數(shù)即增加兩個(gè)數(shù)量級(jí)。后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，由于豆乳基中乳糖被消耗，而德氏乳桿菌保加利亞亞種不產(chǎn)生蔗糖酶、半乳糖酶，不能分解利用蔗糖、水蘇糖和棉籽糖，從而使得活菌數(shù)增加不顯著。而四種菌組合發(fā)酵的4#樣品，其活菌數(shù)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)最為明顯，這可能是四種發(fā)酵菌株間存在互惠共生的機(jī)制，克服了豆乳基中乳糖不足的劣勢(shì)，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，4#樣品活菌數(shù)增加到3.16×108CFU/mL。

通過(guò)脲酶活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在豆乳基本身不含脲酶的情況下，四種大豆復(fù)合蛋白飲料樣品在發(fā)酵過(guò)程中均有脲酶活性被檢出，但檢出的脲酶活性較低，最高不超過(guò)0.020 U/g。由圖2可見(jiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌單菌發(fā)酵的1#、2#樣品在發(fā)酵第6 h即可檢出脲酶活性，與脲酶定性試驗(yàn)相符，并且脲酶活性逐漸增加，與活菌數(shù)呈正相關(guān)性。圖2中2#樣品中脲酶活性較1#樣品高，但表2差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，二者差異不顯著（p>0.05）。至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，2#樣品脲酶活性為0.01656±0.00367 U/g，與3#、4#樣品中脲酶活性存在顯著性差異（p<0.05）。在由德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵的3#樣品中，發(fā)酵第3 h開(kāi)始檢出脲酶活性，與脲酶定性試驗(yàn)相符，在發(fā)酵6 h后，脲酶活性并未隨著活菌數(shù)的增加而增加，反而出現(xiàn)了減少的態(tài)勢(shì)，這可能同保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在豆乳基中的共生機(jī)理存在一定的相關(guān)性。由于本研究所使用豆乳基配料的特殊性，對(duì)于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程來(lái)說(shuō)乳糖是相對(duì)缺乏的，發(fā)酵前期，僅有的乳糖可提供嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)從而使得脲酶活性較高，到發(fā)酵中后期，乳糖不足，限制了兩種菌的生長(zhǎng)，脲酶活性在一定程度上受到抑制而使得活性降低。同樣的，由四種菌組合發(fā)酵的4#樣品中脲酶活性也未隨著活菌數(shù)的增加而增加，在發(fā)酵后3 h變化趨勢(shì)不明顯。由表1可知，3#、4#樣品在發(fā)酵3 h和6 h時(shí)脲酶活性存在顯著性差異（p<0.05），而發(fā)酵7 h和8 h時(shí)兩樣品中脲酶活性無(wú)顯著性差異（p>0.05）。由此推測(cè)，在由組合菌發(fā)酵的3#、4#樣品中，菌種間的共生作用可使脲酶活性受到一定程度的抑制，但具體抑制機(jī)理還不得而知。

2.2 乳酸菌活菌量在貯藏過(guò)程中對(duì)脲酶的影響

2.2.1 4 ℃貯藏過(guò)程中的脲酶定性結(jié)果

活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料在4 ℃貯藏過(guò)程中的脲酶定性結(jié)果如圖3所示。

圖3 4 ℃貯藏過(guò)程中的脲酶定性結(jié)果Fig.3 The qualitative results of urease during storage at 4 ℃

研究發(fā)現(xiàn)，貯藏2周后，2#、3#樣品脲酶檢測(cè)為陰性，而1#、4#樣品在第3周時(shí)脲酶檢測(cè)為陰性，表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中的脲酶活性逐漸減弱，直至消失。

2.2.2 4 ℃貯藏過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性變化

圖4 4 ℃貯藏過(guò)程的活菌數(shù)和脲酶活性變化Fig.4 The changes of viablebacteria amount and urease activity during storage at 4 ℃

活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料在4 ℃貯藏過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性變化結(jié)果如圖4所示。而樣品間活菌數(shù)和脲酶活性的差異性分析結(jié)果見(jiàn)表2。由圖4和表2可知，低溫的限制以及后酸化作用造成的酸度升高致使四種樣品活菌穩(wěn)定性減弱，在3周的貯藏過(guò)程中，四種樣品活菌數(shù)均逐漸降低，且各個(gè)貯藏時(shí)間段活菌數(shù)均呈現(xiàn)顯著性差異（p<0.05）。其中，1#、2#樣品中活菌數(shù)分別在貯藏時(shí)間為第3周及第2周時(shí)降為0；3#樣品中活菌數(shù)降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)（貯藏3周），為（3.03±0.04）×106CFU/mL，而4#樣品中活菌數(shù)僅下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)，為（6.33±0.18）×107CFU/mL。上述結(jié)果表明，四種菌組合發(fā)酵的4#樣品貯藏穩(wěn)定性優(yōu)勢(shì)明顯，可見(jiàn)多菌的共生作用有利于提高發(fā)酵菌株貯藏穩(wěn)定性。

除單菌羅伊氏乳桿菌發(fā)酵的1#樣品外，其他三種活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料中脲酶活性均在貯藏過(guò)程中逐漸減弱或消失，與脲酶定性試驗(yàn)相符，而1#樣品在貯藏3周后仍有脲酶活性，這可能與羅伊氏乳桿菌本身產(chǎn)脲酶的特性有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。

表2 4 ℃貯藏過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性差異性分析結(jié)果Table 2 Differential analysis results of viablebacteria amount and urease activity during storage at 4 ℃

2.2.3 25 ℃貯藏過(guò)程中的脲酶定性結(jié)果

圖5 25 ℃貯藏過(guò)程中的脲酶定性結(jié)果Fig.5 The qualitative results of urease during storage at 25 ℃

活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料在25 ℃貯藏過(guò)程中的脲酶定性結(jié)果如圖5所示。由圖5可見(jiàn)：4#樣品經(jīng)過(guò)1周貯藏，其脲酶檢測(cè)為陰性，2#樣品經(jīng)過(guò)2周貯藏，其脲酶檢測(cè)為陰性；而1#、3#樣品經(jīng)過(guò)3周貯藏，其脲酶檢測(cè)為陰性。同時(shí)，相比于4 ℃條件下貯藏，4#樣品在25 ℃條件下脲酶消失得更快。

2.2.4 25 ℃貯藏過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性變化

圖6 25 ℃貯藏過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性變化Fig.6 The changes of viable bacteria amount and urease activity during storage at 25 ℃

活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料在4 ℃貯藏過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性變化結(jié)果如圖6所示，而樣品間活菌數(shù)和脲酶活性的差異性分析結(jié)果見(jiàn)表3。

在25 ℃貯藏下，活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料中的菌株依然處于產(chǎn)酸增殖的狀態(tài)，當(dāng)產(chǎn)酸量累積到較高水平，又會(huì)抑制菌株增殖甚而使其失活。圖6中除4#樣品外，1#、2#和3#樣品中活菌數(shù)在3周的貯藏過(guò)程中均逐漸降低，其中，1#、2#樣品中活菌數(shù)經(jīng)過(guò)2周的貯藏即分別降為0。4#樣品中活菌數(shù)經(jīng)過(guò)1周的貯藏增加至7.29×108CFU/mL，與其他三種豆酸奶活菌數(shù)存在顯著性差異（p<0.05），表明菌株間的相互作用仍在促進(jìn)其活菌數(shù)的增長(zhǎng)，但隨著產(chǎn)酸增加，樣品活菌數(shù)逐漸降為0。

表3 25 ℃貯藏過(guò)程中的活菌數(shù)和脲酶活性差異性分析結(jié)果Table 3 Differential analysis results of viable bacteria amount and urease activity during storage at 25 ℃

3 結(jié)論

3.1 本研究綜合分析了羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌以不同配比接種后對(duì)活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料中脲酶的影響，得出以下結(jié)論：（1）在豆乳基原料本身不含脲酶的情況下，羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌不論是單菌還是組合菌發(fā)酵均可產(chǎn)生脲酶，脲酶定性為弱陽(yáng)性，脲酶活性最高不超過(guò)0.020 U/g；單菌發(fā)酵樣品中脲酶活性與活菌數(shù)呈正相關(guān)性，而組合菌發(fā)酵樣品中脲酶活性卻未隨著活菌數(shù)的增加而提高。（2）在4 ℃和25 ℃貯藏過(guò)程中，隨著活菌型發(fā)酵大豆復(fù)合蛋白飲料樣品中活菌數(shù)的降低，脲酶活性逐漸減弱或消失。

3.2 現(xiàn)行的《GB 7101-2015食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》中規(guī)定以大豆為原料的飲料中脲酶試驗(yàn)應(yīng)該為陰性，即脲酶不得檢出，但國(guó)標(biāo)未提及經(jīng)由活性乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生脲酶從而造成脲酶檢出陽(yáng)性的情況。本研究結(jié)果證實(shí)在豆乳基原料本身不含脲酶的情況下，羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌不論是以單菌發(fā)酵還是以組合菌發(fā)酵均可產(chǎn)生脲酶。目前含有大豆蛋白的活菌型發(fā)酵飲料也在逐步進(jìn)入市場(chǎng)，在此類產(chǎn)品中檢出脲酶是否就意味著產(chǎn)品質(zhì)量不合格，或者是否應(yīng)對(duì)此類產(chǎn)品中的脲酶活性進(jìn)行安全范圍的限度，希望本研究能夠引起相關(guān)關(guān)注和討論。

3.3 本研究也有自身的局限與不足：（1）由于沒(méi)有專門檢測(cè)食品或大豆蛋白飲料中脲酶活性的國(guó)標(biāo)，本研究參考了《GB/T 8622-2006飼料用大豆制品中尿素酶活性的測(cè)定》，這在檢測(cè)值上可能與真實(shí)值存在一定的誤差；（2）本研究?jī)H涉及四株乳酸菌，并不能代表其他菌株，因此不能定論所有乳酸菌菌株發(fā)酵的含大豆蛋白飲料均產(chǎn)脲酶，篩選不產(chǎn)脲酶的菌株也是解決本問(wèn)題的有效途徑之一；（3）本研究也未進(jìn)行純牛乳、純豆乳發(fā)酵是否有脲酶活性檢出的對(duì)比試驗(yàn)，這也是有待于去研究完善的地方。

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