王靜，劉宇，馬銀花，盧存龍，董德武，劉愛民

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖 241000）

黃豆豆渣是大豆制品加工過程中的副產(chǎn)物，富含粗蛋白、粗脂肪、淀粉、膳食纖維、氨基酸和B族維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[1]。我國(guó)每年約產(chǎn)2000萬噸濕豆渣，但由于其含水量大，不易貯存，且口感粗糙，通常只用作飼料或廢棄，造成了資源浪費(fèi)[2]。隨著人們對(duì)新型資源的研究與開發(fā)，提高了豆渣的可利用性和功能性[3]，如發(fā)酵豆渣制成功能性飼料[4]、餅干[5]、面包[6]和飲料[7]等產(chǎn)品。小球藻(Chlorella vulgaris)是一種單細(xì)胞淡水藻類，因含有單細(xì)胞蛋白、維生素、核酸和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分而成為動(dòng)物性飼料和保健品的重要原料[8]，所以，將小球藻和酵母菌混發(fā)酵豆渣是一種較好的資源利用方式。維生素B2又稱核黃素，以輔酶形式參與腦的能量和物質(zhì)代謝，若攝入不足可能會(huì)出現(xiàn)“地圖舌”等口腔疾病[9]；維生素B12又稱鈷胺素，作為紅血球生成必需的重要元素，一般消化道疾病者容易缺乏，可導(dǎo)致惡性貧血病[10]。風(fēng)味是衡量發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，在豆渣的微生物發(fā)酵過程中，一般會(huì)產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì)[11]。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)有益菌種發(fā)酵豆渣產(chǎn)物中B族維生素和風(fēng)味成分有所研究，如曹蕾蕾[12]對(duì)少孢根霉發(fā)酵腐乳的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)微生物發(fā)酵后的維生素B2和B12含量有所增多，宋昊等[13]檢測(cè)出黃豆豆渣的阿舒假囊酵母固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中關(guān)鍵風(fēng)味成分為醇類、萜類和酸類化合物；姚英政[14]研究出豆渣粑經(jīng)毛霉發(fā)酵后風(fēng)味成分發(fā)生變化，醇類和醛酮類是其主要風(fēng)味成分，但目前菌藻混合發(fā)酵對(duì)豆渣中B族維生素和風(fēng)味成分影響的研究還屬空白。

在分析維生素和風(fēng)味成分的方法中，高效液相色譜法(HPLC)因處理樣品方便快速，且能同時(shí)測(cè)定多種維生素而被廣泛應(yīng)用[15]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是最常用的風(fēng)味成分鑒定方法，利用GC進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的預(yù)分離，MS對(duì)氣相色譜流出的物質(zhì)通過質(zhì)譜庫檢索進(jìn)行分子量和分子結(jié)構(gòu)鑒定，從而對(duì)色譜柱分離出的化合物進(jìn)行定性分析[16]。

本研究采用新鮮黃豆豆渣為原料，利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis 31229)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)和小球藻進(jìn)行厭氧半固態(tài)發(fā)酵。采用高效液相色譜法測(cè)定豆渣發(fā)酵前后VB含量的變化，樣品經(jīng)液液萃取法結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)，通過質(zhì)譜庫檢索對(duì)樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性，分析發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)成分及含量變化，以期為菌藻混合發(fā)酵豆渣的工藝改進(jìn)提供理論參考，同時(shí)為豆渣發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis 31229)和葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum B404)：本實(shí)驗(yàn)室提供。

將保存菌種從斜面轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基，于25 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）：采用HB-4培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照度2.4×103hl進(jìn)行擴(kuò)培，光照周期12 h/12 h，每天搖動(dòng)6次。

黃豆豆渣：學(xué)校豆?jié){銷售處提供，新鮮豆渣（含水量約85%），儲(chǔ)存于-4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)品維生素B2和維生素B12，純度≥98%。

乙腈、甲醇、二氯甲烷，均為色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司。氮?dú)?，氣相?jí)。冰乙酸、庚烷磺酸鈉、三乙胺、3-壬酮、無水硫酸鈉，均為分析純。

1.1.3 主要儀器

水浴氮吹儀，無錫沃信儀器有限公司；高效液相色譜儀和2010 PLUS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，島津分析技術(shù)研發(fā)（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌藻混合發(fā)酵豆渣工藝

新鮮豆渣→紗布擠壓→稱重裝瓶（30 g）→高壓滅菌→接入三種酵母菌（各4 mL，濃度均約為5.0×106個(gè)/mL）和小球藻（21 mL，濃度約為5.0×106個(gè)/mL）→厭氧半固態(tài)發(fā)酵(25 ℃，5 d)→取樣測(cè)其VB2、VB12及揮發(fā)性風(fēng)味成分。

1.2.2 維生素B2和維生素B12測(cè)定

1.2.2.1 萃取液配制

150 mL乙腈+15 mL冰乙酸，混合后加超純水定容至1000 L。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備

分別準(zhǔn)確稱取維生素B2和維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，放于25 mL棕色容量瓶中，用萃取液溶解并定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾于4 ℃冰箱避光貯存。取維生素B2和維生素B12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，梯度稀釋，取20μL進(jìn)行HPLC測(cè)定，以峰面積（Y）和濃度（X）進(jìn)行回歸計(jì)算。

1.2.2.3 樣品溶液制備

分別準(zhǔn)確稱取新鮮豆渣和發(fā)酵豆渣約4.0 g(精確至0.0001 g)，放于100 mL棕色容量瓶中，加入約80 mL萃取液在45～60 ℃超聲水浴中振蕩萃取1 h，取出冷卻至室溫，用萃取液定容，混合均勻后離心分離（8000 r/min，10 min），取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，4 mL萃取液溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后為樣品液，HPLC上機(jī)測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量[17]。

1.2.2.4 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(柱長(zhǎng)250 mm×柱子口徑4.6 mm，分析柱粒徑5 μm)；流動(dòng)相為0.005 mol/L庚烷磺酸鈉溶液[18](含0.5%冰乙酸和0.005%三乙胺)-甲醇（V/V，72:28）等度洗脫；柱溫35 ℃，流速為0.8 mL/min。

維生素B2檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；維生素B12檢測(cè)波長(zhǎng)361 nm，進(jìn)樣體積為20 μL。

1.2.3 風(fēng)味成分分析

1.2.3.1 樣品萃取

萃取過程中所用實(shí)驗(yàn)器材均用色譜級(jí)甲醇45 ℃浸泡過夜，再用超純水清洗烘干。

3-任酮內(nèi)標(biāo)配制：稱取3-任酮樣品0.100 g溶于100 mL的二氯甲烷中，配成1 mg/mL的溶液。

分別準(zhǔn)確稱取新鮮豆渣和發(fā)酵豆渣各10 g（精確至0.0001 g），置于100 mL錐形瓶中，加入內(nèi)標(biāo)3-任酮40 μL，再加入二氯甲烷20 mL后密封，在搖床（35 ℃，200 r/min）保持20 min，之后于4.5 ℃冰箱內(nèi)靜置15 min，再轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中（5000 r/min，10 min）離心，取下層液體。三次萃取，合并有機(jī)相，加入5 g無水硫酸鈉，置于4.5 ℃冰箱保存24 h，再氮吹至1 mL，取液體于色譜瓶中，供GC-MS分析[19]。

1.2.3.2 GC-MS分析條件

島津GC/MS2010 PLUS測(cè)定，分析柱子RTX-5（柱長(zhǎng)30.0 m×內(nèi)徑0.25 mm×膜厚0.25 μm）。

GC條件：以氦氣為載體，柱內(nèi)流量為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流比為20:1；升溫程序：起始溫度為30 ℃，保持1 min；以1 ℃/min升溫至35 ℃，保持3 min；以2 ℃/min升溫至54.5 ℃，以4 ℃/min升溫至60 ℃，以5 ℃/min升溫至88 ℃；以6 ℃/min升到130 ℃，保留2 min；以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持2 min；再以3 ℃/min升溫至250 ℃，保留5 min。

MS條件：離子原溫度250 ℃，采用scan掃描方式：0～1.9 min和2.1～51 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)定數(shù)據(jù)的方差分析、數(shù)據(jù)差異性分析、相關(guān)性分析利用SPASS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件、origin繪圖軟件和Excel軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌藻混合發(fā)酵對(duì)豆渣中維生素B2和維生素B12含量的影響

2.1.1 定性分析

通過標(biāo)樣和未發(fā)酵、已發(fā)酵樣品中維生素B2和B12在色譜柱中的保留時(shí)間進(jìn)行定性，其色譜圖見圖1至圖3所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品VB2和VB12色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard VB2 and VB12

圖2 未發(fā)酵和已發(fā)酵豆渣中VB2色譜圖Fig.2 VB2 chromatogram of unfermented and fermented soybean residue

圖3 未發(fā)酵和已發(fā)酵豆渣中VB12色譜圖Fig.3 VB12 chromatogram of unfermented and fermented soybean residue

2.1.2 定量分析

VB2和VB12回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：

VB2Y=5×107X+2369，r=0.993；

VB12Y=1×107X+4688，r=0.994。

樣品含量計(jì)算結(jié)果見表1。

表1 豆渣發(fā)酵前后的維生素B2和B12含量變化Table 1 Content of VB2 and VB12 before and after fermentation

由表1可知，經(jīng)微生物發(fā)酵后，豆渣中的維生素B2和B12含量均有一定程度的增長(zhǎng)，分別由發(fā)酵前的1.25 mg/100 g、0.29 mg/100 g，增至1.90 mg/100 g、1.99 mg/100 g，各增長(zhǎng)了約0.5倍和5.9倍。根據(jù)相關(guān)研究[20]，很多微生物可合成維生素B2，如工業(yè)生產(chǎn)常用的阿舒假囊酵母，此外多種假絲酵母、細(xì)菌和霉菌也能少量形成維生素B2，所以維生素B2含量增高的原因可能是酵母菌產(chǎn)生了維生素B2，豆渣中含有的脂肪和碳水化合物可作為碳源，酵母菌經(jīng)厭氧發(fā)酵后產(chǎn)生維生素B2從而使其含量增高。維生素B12主要存在動(dòng)物性食品中，植物中較缺乏，所以發(fā)酵前豆渣中維生素B12含量較低。放線菌和細(xì)菌是合成維生素B12的主要微生物，少量酵母和霉菌也具有合成維生素B12的能力[21]，在發(fā)酵過程中，酵母菌可能產(chǎn)生了維生素B12。此外，由于小球藻中含有豐富的維生素B2和B12，故此也可能是維生素B2和B12含量增高的原因。

2.2 菌藻混合發(fā)酵對(duì)豆渣中風(fēng)味成分的影響

2.2.1 定性分析

對(duì)未發(fā)酵和已發(fā)酵豆渣樣品進(jìn)行GC-MS測(cè)定，得到的風(fēng)味成分總離子圖見圖4和圖5。未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，與質(zhì)譜庫對(duì)比，選取高度相關(guān)的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜定性。

圖4 未發(fā)酵豆渣中風(fēng)味成分的總離子色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of flavor components of unfermented soybean residue

圖5 已發(fā)酵豆渣中風(fēng)味成分的總離子色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of flavor components of fermented soybean residue

2.2.2 定量分析

3-任酮是用來定量，樣品中添加3-任酮計(jì)算提取率和指引作用，根據(jù)各風(fēng)味成分在總離子圖譜的峰面積與內(nèi)標(biāo)3-壬酮的峰面積進(jìn)行比較，確定其絕對(duì)含量，用峰面積歸一化法計(jì)算其風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量，結(jié)果見表2和表3。

由表2可知，豆渣發(fā)酵前后的風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量、組成和相對(duì)含量有所變化。在未發(fā)酵豆渣中主要風(fēng)味成分共有39種，其相對(duì)含量總計(jì)占總揮發(fā)性物質(zhì)的56.49%，發(fā)酵豆渣中主要風(fēng)味成分共有47種，其相對(duì)含量總計(jì)占總揮發(fā)性物質(zhì)的45.14%。豆渣在發(fā)酵后，醇類、醛類、酸類及含氮化合物的數(shù)量都各有所增加，酯類和烴類的數(shù)量有所減少，其中變化較大的是醇類和醛類，發(fā)酵前各有13種和2種，發(fā)酵后增至18種和7種。

發(fā)酵前豆渣中相對(duì)含量較高的風(fēng)味成分主要是醇類、酯類、酸類及含氮化合物。而在發(fā)酵后豆渣中醇類、酯類、醛類和酮類的相對(duì)含量較高，一般醇類具有芳香和植物香氣，酯類是脂肪氧化產(chǎn)生的醇和游離脂肪酸相互作用形成的，主要呈水果香味，醛類來源于脂肪氧化及氨基酸直接經(jīng)Strecker降解，酮類主要由氨基酸分解或者是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[22]，這幾類物質(zhì)可能對(duì)發(fā)酵豆渣風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)較大。烷烴類物質(zhì)對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較弱，而烯和炔類對(duì)風(fēng)味影響尚不明確[23]。

由表3可知，豆渣發(fā)酵后，風(fēng)味成分中有3,3-二甲基-2-戊醇、14-甲基十五烷酸甲酯、癸二酸二異辛酯、反式-2,4-癸二烯醛、1-(1-甲基環(huán)己基)乙酮和亞硫酸己基辛酯等物質(zhì)的含量明顯增加，其中，反式-2,4-癸二烯醛具有桔子和新鮮甜橙香氣，亞硫酸己基辛酯是黃牡丹（荷花的一個(gè)品種）中特有的香味成分之一[24]。發(fā)酵后產(chǎn)生新的風(fēng)味成分主要有活性戊醇、苯乙醇、2-丁基辛醇、2-乙基己基草酸戊酯、E-14-十六碳烯醛、桃醛、(Z)-7-十六碳烯醛、異佛爾酮、2,2,4,6-四甲基-3,5-庚二酮、3-庚烯酸、月桂酸等物質(zhì)，其中苯乙醇、2-乙基己基草酸戊酯、E-14-十六碳烯醛、(Z)-7-十六碳烯醛、異佛爾酮的含量均大于0.01 μg/g。苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香味；2-乙基己基草酸戊酯是鐵觀音中特有的風(fēng)味物質(zhì)之一，具有茶香味[25]；桃醛又稱γ-十一內(nèi)酯，并不是真正意義上的醛，而是屬于內(nèi)酯化合物，具有強(qiáng)烈的桃子香氣，可作為重要的香料；異佛爾酮又稱1,1,3-三甲基環(huán)己烯酮，帶有薄荷香或樟腦香味；月桂酸又稱十二烷酸，屬于飽和脂肪酸，微有月桂油香味。這些物質(zhì)對(duì)發(fā)酵豆渣特殊風(fēng)味的構(gòu)成具有重要作用[26]，也有助于發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的改善和適口性。

種類 發(fā)酵前

發(fā)酵后

化合物數(shù)量 相對(duì)含量/% 化合物數(shù)量 相對(duì)含量/%

醇類 13 30.85 18 8.26酯類 8 3.14 6 4.84醛類 2 0.46 7 19.24酮類 3 0.54 3 3.01酸類 3 4.59 4 2.41酚類 1 0.86 1 0.93烴類 6 2.33 4 2.34含氮化合物 2 13.53 3 1.37含硫化合物 1 0.19 1 2.74

總計(jì) 39 56.49 47 45.14

表3 豆渣發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)含量Table 3 Content of flavor compounds in soybean residue before and after fermentation

1-十六烷醇 0.01 0.00 0.70 0.16法呢醇 0.04 0.00 25.25 0.22 2-己基-1-癸醇 0.01 0.01 0.73 0.45酯類碳酸二異戊酯 0.01 - 0.59 -新戊酸異己酯 0.01 - 0.38 -甲氧基乙酸-2-十五烷基酯 0.01 - 0.42 -二十二烷酸二十二烷基酯 - 0.00 - 0.17 14-甲基十五烷酸甲酯 0.05 0.02 0.31 1.90棕櫚酸異丙酯 0.01 0.00 0.09 0.26 2-乙基己基草酸戊酯 - 0.01 - 0.95硬酯酸甲酯 0.00 - 0.14 -癸二酸二異辛酯 0.00 0.01 0.21 0.48鄰苯二甲酸二正辛酯 0.01 0.01 0.99 1.089醛類己醛 - 0.01 - 0.42 E-2-庚烯醛 - 0.01 - 0.46反式-2,4-癸二烯醛 0.00 0.05 0.19 4.32 2-十一烯醛 - 0.00 - 0.19十一醛 0.00 - 0.27 -E-14-十六碳烯醛 - 0.03 - 2.19桃醛 - 0.05 - 0.37(Z)-7-十六碳烯醛 - 0.14 - 11.29酮類5-（2-甲基-3-亞甲基-4-丁基） -2（5H）- 呋喃酮 0.00 - 0.11 -1-(1-甲基環(huán)己基)乙酮 0.00 0.01 0.14 0.51異佛爾酮 - 0.03 - 2.00 2,2,4,6-四甲基-3,5-庚二酮 - 0.01 - 0.50 5-癸酮 0.00 - 0.29 -酸類壬酸 0.00 0.00 0.20 0.22 3-庚烯酸 - 0.01 - 0.44月桂酸 - 0.01 - 0.40棕櫚酸 0.02 0.02 1.41 1.34亞油酸 0.04 - 2.98 -酚類3,5-二叔丁基苯酚 0.01 0.01 0.86 0.93烯烴2-十一烯 - 0.00 - 0.24 4-甲基-1-十一碳烯 0.00 - 0.12 -烷烴3,3-二甲基己烷 0.01 - 0.50 -

注：“-”表示未檢出。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以酵母菌和蛋白核小球藻混合發(fā)酵豆渣，對(duì)豆渣發(fā)酵前后VB2、VB12及風(fēng)味成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，發(fā)酵后的豆渣中VB2和VB12含量均比發(fā)酵前明顯增多。豆渣發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量、組成和含量均發(fā)生變化，根據(jù)相對(duì)含量的高低，醇類、酯類、醛類和酮類是發(fā)酵產(chǎn)物的主要風(fēng)味成分，苯乙醇、2-乙基己基草酸戊酯、亞硫酸己基辛酯、反式-2,4-癸二烯醛、桃醛、異佛爾酮和月桂酸可能是發(fā)酵豆渣的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。豆渣發(fā)酵前后風(fēng)味成分的變化說明微生物起到了一定的作用，微生物發(fā)酵過程中會(huì)釋放多種胞外酶，將豆渣中的蛋白、脂肪和多糖等降解成小分子物質(zhì)，作為風(fēng)味物質(zhì)的前體，再經(jīng)各種復(fù)雜的生化反應(yīng)合成多種風(fēng)味化合物，形成豆渣發(fā)酵產(chǎn)物的特征風(fēng)味。探究豆渣發(fā)酵產(chǎn)物中VB2、VB12含量及風(fēng)味成分變化，為提高發(fā)酵產(chǎn)品VB2、VB12含量和改善風(fēng)味提供基礎(chǔ)依據(jù)，同時(shí)為發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供參考，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

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