李榮，馬慧婷，姚蘭英，陳青

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州 310018）

蛋白質(zhì)因?yàn)榫哂凶吭降臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生物活性和功能特性，廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥等領(lǐng)域，乳清蛋白則因具有良好的加工特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而備受食品工業(yè)的重視[1～3]。乳清蛋白可以形成凝膠，故而其經(jīng)常作為增稠劑、微膠囊壁材和食用膜等在食品工業(yè)中應(yīng)用[4～6]。多糖是食品中另一種常見(jiàn)的大分子組分，多糖的存在會(huì)影響乳清蛋白凝膠的形成過(guò)程，從而影響食品的質(zhì)構(gòu)、色澤等特性。因而多糖和乳清蛋白相互作用研究一直是食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7～9]。目前關(guān)于乳清蛋白和多糖的相互作用研究主要集中在乳清蛋白和果膠、黃原膠、卡拉膠等膠體上，Wagoner等[10]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白和果膠在pH為5且在85 ℃加熱25 min可形成蛋白質(zhì)-果膠可溶性復(fù)合物，復(fù)合物的粒徑隨著乳清蛋白濃度的增加而增大，可溶性復(fù)合物可以在乳清蛋白降解溫度之上進(jìn)行熱定形，熱定形處理可以提高復(fù)合物的熱穩(wěn)定性及減小粒徑分布。Lam等[11]研究發(fā)現(xiàn)，卡拉膠和乳清蛋白混合體系會(huì)通過(guò)靜電作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，混合體系的流變特性取決于卡拉膠的種類(lèi)，κ-和i-卡拉膠形成的混合凝膠儲(chǔ)能模量相差不大，但λ-卡拉膠形成的混合凝膠儲(chǔ)能模量很小，卡拉膠的添加會(huì)降低混合體系的表面張力。Le等[12]發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白/黃原膠復(fù)合凝膠的力學(xué)性能主要取決于黃原膠，β-乳球蛋白/黃原膠復(fù)配比例越小、濃度越低，孔徑越小，保水性越好。結(jié)冷膠是另一種可用于食品工業(yè)中的微生物胞外多糖，其因?yàn)榫哂惺褂昧可?、香味釋放性好、耐熱及?fù)配性好等優(yōu)點(diǎn)，使用越來(lái)越廣泛[13～15]，迄今為止，關(guān)于乳清蛋白和結(jié)冷膠的相互作用研究還非常匱乏。有鑒于此，本研究以乳清蛋白和結(jié)冷膠作為研究對(duì)象，考察離子種類(lèi)、離子濃度和基體濃度對(duì)結(jié)冷膠-乳清蛋白混合凝膠凝膠特性的影響，以期為我國(guó)的乳品工業(yè)和新型食品的開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低?；Y(jié)冷膠(Low acyl gellan，LA)，美國(guó)CP Kelco公司；乳清蛋白（Whey protein concentrated，WP，其中蛋白質(zhì)含量≥80%，灰分≤6.0%，乳脂≤7.5%），新西蘭恒天然公司；疊氮化鈉，分析純，東陽(yáng)市天宇化工有限公司；KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2，分析純，四川成都科龍化工試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

JZ78-1磁力攪拌器，杭州通用電子儀表廠(chǎng)；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；D-37520 osterode臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；TA-XT 2i物性分析儀，英國(guó)SMS公司；CR-400色差計(jì)，日本Konica Minolta公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 低?；Y(jié)冷膠-乳清蛋白混合凝膠的制備

乳清蛋白溶液的制備：室溫下將一定量的乳清蛋白粉末加入到去離子水中，磁力攪拌5 h直至乳清蛋白全部溶解，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的疊氮化鈉作為抑菌劑。

低?；Y(jié)冷膠溶液的制備：將適量結(jié)冷膠粉末加入到去離子水中，室溫下溶脹24 h，于90 ℃下進(jìn)行磁力攪拌，直至結(jié)冷膠粉末完全溶解形成澄清透明的溶液，并用90 ℃去離子水補(bǔ)償由于蒸發(fā)而損失質(zhì)量。

低?；Y(jié)冷膠-乳清蛋白混合凝膠的制備：將制備好的乳清蛋白溶液與低?；Y(jié)冷膠溶液在60 ℃下磁力攪拌5 min進(jìn)行混合，并加入一定數(shù)量的NaCl和CaCl2溶液混合均勻，趁熱分裝在Φ30 mm×20 mm的模具中，用15 ℃的冷水浴冷卻10 min，在4 ℃冰箱中放置24 h凝膠。將凝膠脫模后進(jìn)行單軸應(yīng)力壓縮、保水性及不透光性測(cè)試。在進(jìn)行相關(guān)性能測(cè)試前，凝膠試樣均在室溫下穩(wěn)定0.5 h。

本研究中所用低酰基結(jié)冷膠的最終質(zhì)量濃度分別為：0.1、0.2、0.3%，乳清蛋白的質(zhì)量濃度分別為7.5、10.0、12.5、17.5%。鈉離子的濃度為30、60、90和120.0 mmol/L，鈣離子的濃度為10、20和30 mmol/L。

1.3.2 不透明指數(shù)(Opacity Index，OI)測(cè)定

將按照方法1.3.1制備的混合凝膠用實(shí)驗(yàn)室自制的切割工具切成厚度為2 mm的薄片，用色差計(jì)測(cè)定混合凝膠的明亮度L。L=0表示黑色，L=100表示白色。樣品放在白色背景下測(cè)得的明亮度記為L(zhǎng)w；黑色背景下測(cè)得的明亮度記為L(zhǎng)b。不透明指數(shù)（OI）為：

1.3.3 單軸應(yīng)力壓縮

力學(xué)性質(zhì)采用單軸應(yīng)力壓縮法進(jìn)行測(cè)試，選用直徑為45 mm的圓柱形夾具，測(cè)試模式為compression。具體的測(cè)試參數(shù)為：測(cè)試速度為1 mm/s，壓縮應(yīng)變?yōu)?0%直至凝膠破碎。根據(jù)得到的力-時(shí)間關(guān)系曲線(xiàn)，計(jì)算出相應(yīng)參數(shù)。本研究中用于混合凝膠凝膠特性分析的參數(shù)主要有斷裂應(yīng)變、斷裂應(yīng)力和楊氏模量。因?yàn)樵趬嚎s測(cè)試中試樣橫截面積會(huì)發(fā)生改變，故而我們把測(cè)得的力和變形分別根據(jù)公式（1）和（2）進(jìn)行了校正，將它們分別轉(zhuǎn)化成Hencky應(yīng)力（σH）和Hencky應(yīng)變（εH）：

式中：F(t)，t時(shí)刻的應(yīng)力，N；H(t)，t時(shí)刻時(shí)試樣的高度，mm；A0，試樣的初始橫截面積，mm2；H0，試樣的初始高度，mm。

斷裂應(yīng)力和斷裂應(yīng)變分別是σH-εH曲線(xiàn)最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的應(yīng)力和應(yīng)變。楊氏模量則是σH-εH曲線(xiàn)初期呈直線(xiàn)變化部分的斜率（本研究中應(yīng)變<0.05）。

1.3.4 保水性(WHC)測(cè)試

將按照1.3.1方法制備好的混合凝膠脫模，從其中部切出尺寸為20 mm×20 mm×15 mm的樣品。在空離心管中加入切好的凝膠，在12000 g下離心15 min，去除水，并記錄剩余凝膠的質(zhì)量，根據(jù)下式計(jì)算保水性：

式中：w0是空離心管質(zhì)量，g；w1是離心前凝膠和離心管的總質(zhì)量，g；w2則是離心后凝膠和離心管的總質(zhì)量，g。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

文中所有數(shù)據(jù)均利用origin 8.0和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。在實(shí)驗(yàn)中為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高數(shù)據(jù)的可信度，不透光指數(shù)檢測(cè)重復(fù)三次，保水性和力學(xué)性質(zhì)重復(fù)五次。

2 結(jié)果與分析

圖1 離子和濃度對(duì)低?；Y(jié)冷膠/乳清蛋白混合凝膠不透明性的影響Fig.1 Effects of ion and concentrations on the opacity index of LA/WP mixed gels

圖1給出了離子和濃度對(duì)低?；Y(jié)冷膠-乳清蛋白混合凝膠不透明指數(shù)的影響。不難發(fā)現(xiàn)，在所研究的濃度范圍內(nèi)，乳清蛋白和結(jié)冷膠均形成了不透明混合凝膠。隨著離子濃度的增大，混合凝膠的不透明指數(shù)也隨之增大，空白組的不透明指數(shù)與加入離子的其他組差異顯著（p<0.05），當(dāng)離子濃度超過(guò)一定值之后，混合凝膠的不透明指數(shù)則基本保持恒定?；旌象w系內(nèi)低酰基結(jié)冷膠和乳清蛋白濃度越高，混合凝膠的不透明指數(shù)越大。與鈉離子相比，鈣離子濃度對(duì)混合凝膠不透明指數(shù)的影響更為顯著（p<0.05），和對(duì)混合凝膠宏觀(guān)形貌的研究結(jié)果一致。在對(duì)低?；Y(jié)冷膠-乳清蛋白混合凝膠宏觀(guān)形貌觀(guān)察時(shí)發(fā)現(xiàn)，混合凝膠是不透明凝膠。當(dāng)體系內(nèi)低?；Y(jié)冷膠濃度固定不變時(shí)，乳清蛋白濃度較低的混合凝膠呈現(xiàn)乳白色，表面光滑且質(zhì)地均勻。隨著乳清蛋白濃度的增加，混合凝膠會(huì)呈現(xiàn)出乳清蛋白的黃色，凝膠成型性減弱且質(zhì)地變得粗糙。當(dāng)乳清蛋白含量固定不變時(shí)，體系內(nèi)結(jié)冷膠濃度較小時(shí)，形成的凝膠較軟；結(jié)冷膠濃度增大，混合凝膠則變得堅(jiān)實(shí)且尺寸穩(wěn)定性越好。這是因?yàn)榈王；Y(jié)冷膠形成的凝膠硬而脆，故而當(dāng)體系內(nèi)低酰基結(jié)冷膠濃度增大，形成的混合凝膠就更堅(jiān)實(shí)。

2.2 混合凝膠的力學(xué)性質(zhì)

圖2 離子和濃度對(duì)低?；Y(jié)冷膠/乳清蛋白混合凝膠斷裂應(yīng)變的影響Fig.2 Effects of ion and concentrations on the fracture strain of LA/WP mixed gels

圖3 離子和濃度對(duì)低酰基結(jié)冷膠/乳清蛋白混合凝膠斷裂應(yīng)力的影響Fig.3 Effects of ion and concentrations on the fracture stress of LA/WP mixed gels

圖2給出了離子種類(lèi)及其濃度對(duì)低?；Y(jié)冷膠-乳清蛋白混合凝膠斷裂應(yīng)變的影響。由圖可見(jiàn)，無(wú)論是添加鈉離子還是鈣離子，混合凝膠的斷裂應(yīng)變均隨著離子濃度的增大而略有減小，這兩種離子的區(qū)別并不明顯。體系內(nèi)低?；Y(jié)冷膠濃度越大，乳清蛋白濃度越低，混合凝膠的斷裂應(yīng)變則越大。相對(duì)于乳清蛋白而言，結(jié)冷膠濃度的增大對(duì)混合凝膠斷裂應(yīng)變的影響程度更顯著（p<0.05），這是因?yàn)榛旌夏z形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)骨架主要是由低?；Y(jié)冷膠提供的，而乳清蛋白主要是以聚集體的形式填充在結(jié)冷膠形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，因此低?；Y(jié)冷膠濃度越高，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，混合凝膠的結(jié)構(gòu)越強(qiáng)。Spotti等[16]考察了乳清分離蛋白-紫穗槐狀皂莢木膠(ECG)混合凝膠的力學(xué)性能和微觀(guān)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不凝膠的ECG多糖對(duì)混合凝膠斷裂應(yīng)變影響很小，這和我們的研究結(jié)果類(lèi)似。

凝膠強(qiáng)度可用斷裂應(yīng)力進(jìn)行表征，斷裂應(yīng)力越大，說(shuō)明凝膠越強(qiáng)?；旌夏z斷裂應(yīng)力的變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。隨著離子濃度的升高，混合凝膠的斷裂應(yīng)力出現(xiàn)了先增大后減小的變化趨勢(shì)，當(dāng)鈉離子和鈣離子濃度分別為60 mM和10或20 mM時(shí)，混合凝膠的斷裂應(yīng)力存在最大值。獲得相同凝膠強(qiáng)度時(shí)需要的二價(jià)離子濃度比一價(jià)離子更低。陽(yáng)離子誘導(dǎo)凝膠理論認(rèn)為[17]，陽(yáng)離子的添加可以減小低?；Y(jié)冷膠分子鏈上羧基（負(fù)電荷）之間的靜電排斥，促使結(jié)冷膠雙螺旋結(jié)構(gòu)的聚集，增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度；但過(guò)多的陽(yáng)離子又會(huì)增大分子鏈間的排斥作用，因而離子濃度存在一個(gè)最佳值。鈉離子可以通過(guò)水分子與結(jié)冷膠分子形成羧基-鈉離子-水分子-鈉離子-羧基的鏈接，而二價(jià)鈣離子則形成羧基-鈣離子-羧基的鏈接方式，故而達(dá)到相同凝膠強(qiáng)度時(shí)鈣離子所需的濃度更低。

2.3 混合凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑

凝膠的宏觀(guān)性質(zhì)和微觀(guān)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，Spotti認(rèn)為乳清蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑可用公式（4）進(jìn)行計(jì)算[16]：

式中，ξ是孔徑，Kb是波茲曼常數(shù)，T是絕對(duì)溫度，E是力學(xué)性能測(cè)試中得到的楊氏模量，

低酰基結(jié)冷膠-乳清蛋白混合凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑的變化規(guī)律如圖4所示?？梢?jiàn)，當(dāng)乳清蛋白濃度維持恒定時(shí)，低?；Y(jié)冷膠濃度越大，混合凝膠的孔徑越小。當(dāng)結(jié)冷膠濃度是0.1%時(shí)，凝膠孔徑約為280～320 nm，但當(dāng)結(jié)冷膠濃度增大至0.3%時(shí)，孔徑減小到200～280 nm，說(shuō)明結(jié)冷膠濃度越大，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密。當(dāng)結(jié)冷膠濃度保持恒定時(shí)，凝膠的網(wǎng)絡(luò)孔徑則隨著乳清蛋白含量的增加而略有增大。

對(duì)比低?；Y(jié)冷膠和乳清蛋白濃度的影響，不難發(fā)現(xiàn)，低?；Y(jié)冷膠濃度對(duì)混合凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑的影響更加明顯，這可能是因?yàn)榫植繚舛仍黾铀?。?duì)于本研究中使用的乳清蛋白而言，其未經(jīng)過(guò)熱處理，自身不能形成有效的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，混合凝膠的網(wǎng)絡(luò)骨架是由低?；Y(jié)冷膠形成的，低酰基結(jié)冷膠濃度越大，分子間的作用越強(qiáng)，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密。而乳清蛋白不是網(wǎng)絡(luò)的主要形成物質(zhì)，因而其對(duì)孔徑的影響較小。離子種類(lèi)和離子濃度對(duì)混合凝膠孔徑也有影響，隨著離子濃度的增加，混合凝膠的孔徑先減小而后增大，即存在一個(gè)最佳離子濃度，在此濃度下，混合凝膠的孔徑最小。鈣離子誘導(dǎo)得到的混合凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑均小于鈉離子誘導(dǎo)凝膠，表明鈣離子更利于形成致密結(jié)構(gòu)的混合凝膠。這部分的研究結(jié)果和混合凝膠力學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果一致。

圖4 離子和濃度對(duì)低?；Y(jié)冷膠/乳清蛋白混合凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑的影響Fig.4 Effects of ion and concentrations on the pore size of LA/WP mixed gels

2.4 混合凝膠的保水性

圖5 離子和濃度對(duì)低?；Y(jié)冷膠-乳清蛋白混合凝膠保水性的影響Fig.5 Effects of ion and concentrations on the WHC of LA/WP mixed gels

保水性是凝膠一個(gè)非常重要的性質(zhì)，有研究者發(fā)現(xiàn)，低?；Y(jié)冷膠具有優(yōu)異的保水性，但其受離子的影響顯著。圖5給出了混合凝膠保水性的變化規(guī)律，可見(jiàn)，混合凝膠的保水性會(huì)隨著離子濃度的增大而略有降低。體系內(nèi)低?；Y(jié)冷膠濃度越大、乳清蛋白濃度越小，混合凝膠的保水性則越好。結(jié)冷膠凝膠會(huì)形成含有大量孔隙的海綿狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[18]，低?；Y(jié)冷膠濃度越高，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，故而保水性越好。與低酰基結(jié)冷膠相比，乳清蛋白對(duì)凝膠保水性的影響更為微弱。這和我們對(duì)混合凝膠孔徑以及力學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果一致。

2.5 鈉離子和鈣離子的協(xié)同效應(yīng)

圖6 Ca2+(5 mmol/L)和Na+協(xié)同作用對(duì)低酰基結(jié)冷膠/乳清蛋白混合凝膠力學(xué)性能的影響Fig.6 Effects of Na+ concentration on the mechanical properties of LA/WP mixed gels containing 5 mmol/L Ca2+

一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子都有促進(jìn)基體高分子聚集的作用，當(dāng)兩者共存時(shí)，一方面可能由于離子的相互競(jìng)爭(zhēng)從而阻礙結(jié)冷膠的雙螺旋構(gòu)型聚集，表現(xiàn)為凝膠弱化；另一方面，可能產(chǎn)生協(xié)同作用，使得混合凝膠增強(qiáng)。圖6給出了鈉離子和5 mmol/L的鈣離子對(duì)混合凝膠力學(xué)性質(zhì)的影響。顯然，當(dāng)體系中沒(méi)有鈉離子加入時(shí)，混合凝膠的斷裂應(yīng)力和斷裂應(yīng)變均為最大，斷裂應(yīng)力約為13 kPa，隨著鈉離子濃度的升高，混合凝膠的斷裂應(yīng)力和斷裂應(yīng)變逐漸降低，這要?dú)w因于鈉離子濃度較低時(shí)，結(jié)冷膠上的羧基和鈉離子的鏈接不能形成足夠多的氫鍵，并減弱了鈣離子在羧基間形成的鏈接，故而隨著鈉離子濃度的升高，凝膠會(huì)弱化。同時(shí)，在鈣離子存在的情況下，二者之間無(wú)法形成有序的雙螺旋構(gòu)型，因此可以認(rèn)為鈣離子和鈉離子在促進(jìn)混合凝膠形成上不存在協(xié)同效應(yīng)。

3 結(jié)論

本文研究了低酰基結(jié)冷膠-乳清蛋白混合凝膠的凝膠特性，考察了離子種類(lèi)、離子濃度和基體濃度對(duì)混合凝膠光學(xué)特性、力學(xué)性質(zhì)、網(wǎng)絡(luò)孔徑以及保水性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，混合凝膠的保水性和斷裂應(yīng)變隨著離子濃度的增加逐漸減小，而斷裂應(yīng)力和凝膠孔徑則隨著離子濃度的增加出現(xiàn)了先增大后減小的變化趨勢(shì)。鈣離子形成的凝膠強(qiáng)度更大。相對(duì)于乳清蛋白而言，低?；Y(jié)冷膠的添加對(duì)混合凝膠性質(zhì)影響更為顯著。鈣離子和鈉離子在促進(jìn)凝膠形成上無(wú)協(xié)同效應(yīng)。

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