胡凌，曾本華，王潔，董颯爽，廖振林，王麗，魏泓，方祥

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，重慶 400038）

肥胖能引起Ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪肝、癌癥等多種疾病的發(fā)生[1]，并且導(dǎo)致人身體器官組織代謝失調(diào)，從而導(dǎo)致脂肪組織脂肪沉積，是公認(rèn)的影響人類健康的疾病，目前全球已經(jīng)有超過10億的人肥胖或超重。隨著人們對健康意識的不斷提高，飲茶成為了大多數(shù)人追求健康的一種時(shí)尚。茶多酚是茶葉中最具有生物活性的成分，具有抗氧化[2,3]、抗癌[4]、預(yù)防動(dòng)脈硬化[5]，預(yù)防老年癡呆和帕金森疾病[6,7]等作用。茶多酚主要成分為兒茶素類化合物，其中EGCG是兒茶素主要成份[8]，約占兒茶素總量的50～60%[9]，被認(rèn)為是茶具備各種生理活性的主要功能物質(zhì)。除抗氧化、抗癌等功能外，近幾年越來越多的研究證實(shí)EGCG具有減肥降脂功效，Chen YK等[10]研究發(fā)現(xiàn)EGCG能預(yù)防SPF級C57BL/6J肥胖小鼠體重、血糖增加以及減輕胰島素抵抗等功效，L Maksoon等[11]證實(shí)EGCG不僅能降低SPF級C57BL/6J小鼠脂肪墊重量，還能降低血脂等。

通過腸道定植正常菌群的小鼠和無菌小鼠模型證實(shí)在腸道菌群的協(xié)助下，腸道中食物的能量利用率大幅提高，這與體質(zhì)量的增加和肥胖的發(fā)生直接相關(guān)[12]。且有實(shí)驗(yàn)小鼠通過對無菌小鼠腸道菌群研究顯示，腸道菌群和肥胖之間有直接關(guān)系[13,14]。然而，目前對于EGCG的研究基本采用是SPF小鼠，其不能夠達(dá)到反映人腸道菌群與肥胖之間的關(guān)系，從而不能真實(shí)反映人類肥胖產(chǎn)生或治療的過程或狀態(tài)。本研究利用無菌動(dòng)物接種健康成年人糞便懸液構(gòu)建人源化菌群小鼠模型，一方面可以一定程度上模擬人腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)[15]，同時(shí)也避免了直接利用人進(jìn)行腸道菌群研究存在的倫理學(xué)限制等問題[16]。并同時(shí)通過高脂飼料誘導(dǎo)肥胖模型研究EGCG的對肥胖的降脂和保護(hù)肝臟的作用，為健康飲茶提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與飼料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：50只3～4周齡無菌KM小鼠(全雄)，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心教研室提供。EGCG：購于寧波禾普生物科技有限公司，純度為80%。飼料：普通純化飼料(D12450J)和高脂純化飼料(D12492)均購于開源動(dòng)物飼料(常州)有限公司，其中普通純化飼料脂肪含量為10%，高脂純化飼料脂肪含量為60%。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司；光學(xué)顯微鏡、DFC420顯微攝像頭，德國Leica公司；RM2015切片機(jī)，德國Leica公司；Rios 5反滲透純水系統(tǒng)，德國Merk-Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HFA小鼠模型的構(gòu)建

選擇一位3個(gè)月未服用抗生素健康志愿者，收集其清晨第一次排出的新鮮糞便，并立即在無菌、厭氧條件下稱量10 g加入到90 mL 0.1 M PBS(pH 7.2)緩沖液中[15]，震蕩混勻，制成糞便懸液，分別給50只無菌KM小鼠各灌胃0.3 mL，人腸道菌群在小鼠體內(nèi)定植4周構(gòu)建HFA小鼠模型。無菌昆明小鼠在無菌隔離器中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為20～23 ℃，濕度為40%～70%，明暗周期各12 h。飼料和墊料菌經(jīng)過50 kGy60Co-γ射線輻照滅菌，飲水、鼠籠和飲水瓶等經(jīng)過高壓滅菌傳入隔離器。

1.3.2 HFA小鼠肥胖模型的構(gòu)建

將50只HFA小鼠隨機(jī)分為兩組：高脂組40只，普通組10只；高脂組喂食高脂飼料，普通組喂食普通飼料，期間小鼠自由飲食飲水，每周定時(shí)稱量體重，8周后，將普通組和高脂組各處死10只，判斷肥胖模型是否構(gòu)建成功。

1.3.3 EGCG干預(yù)及分組

將高脂飲食組(30只)分為3組：對照組正常飲水，0.2% EGCG干預(yù)組(飲用水中加0.2% EGCG)及0.8%EGCG干預(yù)組(飲用水中加0.8% EGCG)，喂食普通飼料干預(yù)8周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食飲水，每周定時(shí)稱量體重。

1.3.4 樣品采集與處理

小鼠分別在肥胖模型構(gòu)建8周和EGCG干預(yù)8周后禁食12 h，眼球取血，放置半小時(shí)后3000 r/min離心15 min收集血清，血清生化指標(biāo)由陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院檢驗(yàn)科檢驗(yàn)?？焖俳馄食龈闻K和附睪脂肪墊，稱重并將其于置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片5 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色，最后中性樹膠封片制作肝臟和附睪脂肪墊HE染色切片。并利用Image pro-plus 6.0圖像處理軟件對脂肪細(xì)胞長徑、短徑及面積進(jìn)行測量。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用Graph Pad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，以p<0.05為有顯著差異，p<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 EGCG對肥胖HFA小鼠體重、肝重及脂肪墊重量變化影響

肥胖常常伴隨高血脂等多種代謝性疾病的發(fā)生，而肥胖原因多半是由于膳食結(jié)構(gòu)不合理和高糖高脂飲食的攝入導(dǎo)致，現(xiàn)如今隨著人們對肥胖越來越關(guān)注，構(gòu)建肥胖模型是研究肥胖相關(guān)疾病及減藥物肥最有用工具[17]，高脂飲食誘導(dǎo)肥胖與人類肥胖最為接近[17]。

表1為高脂飲食干預(yù)8周后小鼠體重、肝重和附睪脂肪墊重量變化。試驗(yàn)前各小組體重?zé)o顯著差異，高脂飲食8周后，高脂組小鼠體重顯著增加(p<0.05)，平均體重較普通組增加了24%。根據(jù)人類肥胖和超重標(biāo)準(zhǔn)，肥胖度大于20%視為肥胖模型構(gòu)建成功[18]，說明本實(shí)驗(yàn)HFA小鼠肥胖模型構(gòu)建成功。同時(shí)由表1可知普通組肝重和附睪脂肪墊重量分別為1.69±0.15，0.58±0.06，高脂組肝重和附睪脂肪墊的重量分別為2.26±0.12，2.67±0.18，高脂組肝重和附睪脂肪墊重量較普通組顯著升高(p<0.05，p<0.01)，說明高脂飲食能顯著增加HFA小鼠肝重和脂肪沉積。

表2為EGCG干預(yù)8周后小鼠體重、肝重及附睪脂肪墊重量變化。由表2可知低劑量組和高劑量組HFA小鼠體重和肝重較對照組都有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)對照組、低劑量組以及高劑量組附睪脂肪墊重量分別為1.08±0.17、0.97±0.19和0.56±0.13，低劑量EGCG組和高劑量EGCG組附睪脂肪墊重量較對照組分別降低了10.19%、48.15%，高劑量組顯著低于對照組(p<0.05)，這與附有EGCG的高脂飼料喂養(yǎng)小鼠較只有高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠的脂肪墊重量明顯降低[19,20]的結(jié)論一致，說明EGCG能減輕HFA肥胖小鼠體內(nèi)脂肪沉積，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.2 EGCG對肥胖HFA小鼠血清中血糖血脂的影響

表3為高脂飲食干預(yù)8周后血糖血脂變化。高脂組小鼠空腹血糖(GLU)、總膽固醇(Tch)含量較普通組分別升高了55.48%、24.48%，高脂組GLU和Tch含量均顯著高于普通組(p<0.05)，甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量較普通組有一定升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)較普通組降低。

總膽固醇含量升高是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化重要原因之一[21]，低密度脂蛋白是將膽固醇運(yùn)載到組織和細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能會有膽固醇沉積在血管壁上，因此LDL-C含量升高可能會導(dǎo)致冠心病發(fā)生[22]。本研究利用EGCG干預(yù)8周后結(jié)果顯示(表4)，高劑量EGCG干預(yù)組總膽固醇(Tch)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量較對照組分別降低了28.64%和43.16%(p<0.05，p<0.05)，另外，干預(yù)組空腹血糖(GLU)和甘油三酯(TG)含量較對照組有一定降低，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)較對照組有一定升高，但差異不顯著。

表1 高脂飲食對小鼠體重、肝重及脂肪墊重量的影響Table 1 Effects of high-fat diet on the bodyweight, liver weight and fat pad weight of mice

表2 EGCG干預(yù)對小鼠體重、肝重及脂肪墊重量的影響Table 2 Effects of EGCG on the bodyweight, liver weight and fat pad weight of mice

表3 高脂飲食對小鼠血糖血脂含量的影響Table 3 Effect of high fat diet on blood glucose and blood lipid levels of mice

表4 EGCG干預(yù)對小鼠血清中血糖血脂含量的影響Table 4 Effect of EGCG on serum glucose and blood lipid levels of mice

圖1 小鼠脂肪細(xì)胞HE染色Fig.1 HE staining of adipocytes in mice

圖2 小鼠脂肪細(xì)胞HE染色Fig.2 HE staining for adipocytes of mouse

2.3 EGCG對肥胖HFA小鼠脂肪細(xì)胞形態(tài)及大小的影響

脂肪細(xì)胞在HE染色下，細(xì)胞內(nèi)的脂肪被溶解而成空泡狀。由圖1可看出高脂飲食8周后，同一視野下高脂組脂肪細(xì)胞數(shù)明顯少于普通組，且脂肪細(xì)胞明顯膨大，而普通組細(xì)胞形態(tài)大小較小且均一。通過Image pro-plus 6.0圖像處理軟件測量結(jié)果顯示，普通組脂肪細(xì)胞短徑、長徑、面積分別為54.22±3.3、71.93±3.51和3404±318，高脂組脂肪細(xì)胞短徑、長徑、面積分別為100±4.2、136±9.36和8956±1290，普通組脂肪細(xì)胞短徑、長徑、面積均極顯著小于高脂組(表5，p<0.001)，由此說明長期高脂飲食在增加機(jī)體內(nèi)脂肪沉積同時(shí)也會增大脂肪細(xì)胞，而白色脂肪增加和脂肪細(xì)胞肥大是肥胖的典型特征[23]。

EGCG干預(yù)8周后脂肪細(xì)胞切片如圖2所示，同一視野下對照組脂肪細(xì)胞數(shù)量明顯多于EGCG干預(yù)組細(xì)胞數(shù)量，對照組細(xì)胞大且形態(tài)不均一，EGCG干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)均一，且細(xì)胞短徑、長徑及面積均極顯著小于對照組細(xì)胞(表6，p<0.001)，低劑量組脂肪細(xì)胞短徑、長徑及面積大小較對照組減少27.38%、42.17%和53.93%，高劑量組脂肪細(xì)胞短徑、長徑及面積大小較對照組分別減少了35%、41.25%和60.54%，說明EGCG干預(yù)對于HFA肥胖小鼠脂肪細(xì)胞大小有一定的抑制作用。

表5 高脂飲食對小鼠脂肪細(xì)胞大小的影響Table 5 Effects of high-fat diet on the adipocyte size of mice

表6 EGCG干預(yù)對小鼠脂肪細(xì)胞大小的影響Table 6 Effects of EGCG on the adipocyte size of mice

2.4 肝臟HE染色

長期高脂飲食會加重脂質(zhì)在肝臟的沉積和脂肪變性，容易引起或加重肝損傷。通過研究EGCG對由高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝損傷修復(fù)作用，為健康飲茶提供科學(xué)依據(jù)。

圖3為高脂飲食8周后小鼠肝臟HE染色切片。普通組肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，無脂肪變性，高脂組脂肪變性嚴(yán)重，脂肪空泡較多，視野中分布較集中，中央靜脈周圍脂肪變性更為明顯。

圖4為EGCG干預(yù)8周后小鼠肝臟HE染色切片。由圖可看出，對照組肝臟仍有較多脂肪空泡，脂肪變性仍較為嚴(yán)重，低劑量EGCG組和高劑量EGCG組脂肪變性程度都有所減輕，其中高劑量作用效果更為明顯，這可能是因?yàn)镋GCG通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝，從而改善了肝臟脂肪變性程度。

圖3 小鼠肝臟HE染色Fig.3 HE staining for liver of mouse

圖4 小鼠肝臟細(xì)胞HE染色Fig.4 HE staining for liver of mouse

3 結(jié)論

本研究首先通過構(gòu)建人源菌群小鼠模型，達(dá)到更好的模擬人腸道菌群環(huán)境，再利用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖，使小鼠體重、肝重、附睪脂肪墊重量以及空腹血糖(GLU)和總膽固醇(Tch)含量都發(fā)生了顯著性增加，高脂組小鼠脂肪細(xì)胞大小明顯增大并且肝臟HE染色脂肪變性嚴(yán)重。進(jìn)而，再利用構(gòu)建的HFA肥胖小鼠模型證實(shí)EGCG是否具有治療肥胖的功效。EGCG干預(yù)8周后結(jié)果顯示，EGCG干預(yù)組小鼠的附睪脂肪墊重量、總膽固醇(Tch)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量較對照組都有顯著降低。同時(shí)EGCG能使人源性肥胖小鼠的脂肪細(xì)胞恢復(fù)成接近正常小鼠脂肪細(xì)胞，且使肝臟細(xì)胞脂滴明顯變少、減輕肝臟脂肪變性癥狀。這些數(shù)據(jù)表明高脂飲食可以誘導(dǎo)肥胖產(chǎn)生，且除已報(bào)道的EGCG能抑制高脂飲食誘導(dǎo)肥胖產(chǎn)生外[24]，EGCG對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖具有一定的治療效果。

綜上所述，EGCG可以通過降低血糖血脂、減輕肝臟損傷及改善脂肪組織形態(tài)對高脂飲食誘導(dǎo)人源性肥胖小鼠起到減肥和修復(fù)肝臟作用，這對治療人類肥胖及其產(chǎn)生的代謝綜合癥有一定的指導(dǎo)作用；但其確切的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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