童垣皓，蒙龍錫宇，趙亞蓉，沈蘇南，趙樹立，竇環(huán)

（1.南京大學醫(yī)學院，江蘇南京 210093）（2.南京市第一醫(yī)院，江蘇南京 210006）

酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是指過度飲入酒精而造成的肝臟疾病。根據(jù)發(fā)病程度的不同，可將ALD分為4個類型，分別是酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化[1]。隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展和人類飲食結構的改變，ALD已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)慢性肝病的最重要起因之一，其流行病學調(diào)查資料顯示在我國南方及中西部地區(qū)，成人群體ALD患病率為4.3%～6.5%，是我國最常見的肝臟疾病之一[2]。

ALD的發(fā)病機制十分復雜，氧化應激是酒精性肝損傷發(fā)生的主要機制。乙醇主要在肝臟中代謝，在其代謝過程中會產(chǎn)生大量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)[3]。ROS介導的脂質過氧化會損傷生物膜，除了對肝細胞有直接損傷外，還會破壞線粒體的正常結構，影響脂肪酸的β氧化，機體脂代謝發(fā)生紊亂，脂肪在肝細胞內(nèi)大量堆積形成脂肪肝，導致血清脂代謝相關指標變化，這可能與脂代謝相關通路基因表達水平的變化有關[4]。此外，酒精性肝損傷的發(fā)生還與腸道菌群失調(diào)有密切的關系。過量酒精攝入能增加腸道的通透性，導致腸道屏障功能減弱，革蘭氏陰性菌大量繁殖，內(nèi)毒素大量入血，血漿中大量的內(nèi)毒素到達肝臟后激活肝血竇內(nèi)的巨噬細胞Kupffer細胞，引起炎癥反應，釋放大量炎癥因子和ROS，加重氧化應激的損傷作用[5～8]。通過改善腸道菌群失調(diào)進而治療酒精性肝病是當前的研究熱點之一。

益生菌(Probiotics)，又譯為原生保健性菌種，是指可改善宿主(如動物或人類)腸內(nèi)微生態(tài)的平衡，并對宿主有正面效益的活性微生物，主要是指雙歧桿菌和乳酸菌等。研究顯示，益生菌對人體有許多正面的效益，例如治療腹瀉，改善乳糖不耐受，提高人體免疫力，對抗生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)感染等[9]。1994年，Nanji等[10,11]首先發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌Lactobacillus GG干預能夠緩解酒精灌胃大鼠造成的內(nèi)毒素血癥和肝損傷，此后越來越多的動物實驗證實，補充不同種類的益生菌能在一定程度上緩解酒精性肝損傷。梁慧等[12]以益生菌發(fā)酵乳(包含保加利亞乳桿菌、乳雙歧桿菌及嗜熱鏈球菌)為干預物進行實驗，結果表明益生菌對大鼠酒精性肝損傷的保護作用可能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群、修復腸道屏障功能等實現(xiàn)。因此，對ALD患者來說，利用益生菌制劑重建腸道微生態(tài)的平衡被認為是一項可行的治療方法。

本實驗所使用的四聯(lián)活菌制劑Bornlisy(BO)是由保加利亞乳桿菌、幼兒雙歧桿菌、芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌有機混合開發(fā)研制而成，其中芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌對ALD的保護作用還不甚明確，因此實驗結果可能在調(diào)節(jié)ALD患者的腸道菌群譜上具有一定參考價值。

此外，雖然目前保加利亞乳桿菌等益生菌對ALD的緩解和治療作用已經(jīng)有所體現(xiàn)，但其具體的作用機制仍未明確，需要進一步的探索。開展本研究的目的即評估四聯(lián)活菌制劑BO緩解酒精性肝損傷的療效，并幫助明確益生菌制劑緩解酒精性肝損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四聯(lián)活菌制劑BO，分別含有等量的由保加利亞乳桿菌、幼兒雙歧桿菌、芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌，活菌含量均為2億/mL，由南京伯恩利施生物科技有限公司提供；56度二鍋頭，北京紅星股份有限公司；SPF級♂BALB/c小鼠(20～26 g)(南京大學-南京市生物醫(yī)藥研究院，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2015-0001)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；PCR引物，南京思普金生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MM400混合球磨儀(德國RETSCH)；5810R冷凍離心機(德國eppendorf)；HERAEUS FRESCO17冷凍微量離心機(德國Thermo)；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信)；Heto Ultra Freeze超低溫冰箱(美國Thermo)；多功能微孔板檢測儀(美國BioTek)；T100TM梯度PCR儀(美國BIO-RAD)；SmartSpecTM PLUS核酸蛋白質測定儀(美國BIO-RAD)；LineGene 9640熒光定量PCR儀(杭州博日)；ZY220全自動生化分析儀(上?？迫A)。

1.3 實驗動物模型與處理

1.3.1 急性酒精性肝損傷模型

將小鼠適應性喂養(yǎng)5 d后，隨機分為對照組、酒精模型組、BO治療組、BO上清治療組，每組6只。模型組每次給予10 mL/kg蒸餾水灌胃0.5 h后給予56 °紅星二鍋頭配制而成的50%乙醇10 mL/kg灌胃；BO治療組每次給予BO制劑10 mL/kg灌胃，BO上清治療組每次給予BO上清液(BO制劑4000 r/min離心5 min所得)10 mL/kg灌胃，0.5 h后給予BO治療組和BO上清治療組等量的30%乙醇灌胃；對照組每次給予10 mL/kg蒸餾水灌胃0.5 h后再次給予同等劑量蒸餾水灌胃。每2 d灌胃一次，共進行三次。

1.3.2 慢性酒精性肝損傷模型

小鼠分組與處理方法如表1所示。將小鼠適應性喂養(yǎng)5 d后，隨機分為對照組、酒精模型組、BO治療組、BO上清治療組，每組8只。模型組每日給予10 mL/kg蒸餾水灌胃0.5 h后給予56 °紅星二鍋頭配制而成的30%乙醇10 mL/kg灌胃；BO治療組每日給予BO制劑10 mL/kg灌胃，BO上清治療組每日給予BO上清液(BO制劑4000 r/min離心5 min所得)10 mL/kg灌胃，0.5 h后給予BO治療組和BO上清治療組等量的30%乙醇灌胃；對照組每日給予10 mL/kg蒸餾水灌胃0.5 h后再次給予同等劑量蒸餾水灌胃。持續(xù)56 d。

表1 小鼠分組與處理Table 1 Grouping and treatment of the mice

1.4 血清轉氨酶、甘油三酯、總膽固醇和脂蛋白測定

使用全自動生化分析儀檢測血清中ALT活力與TG、HDL、LDL含量。其中ALT活力以U/L血清表示，TG、HDL、LDL含量以mmol/L血清表示。

1.5 肝臟系數(shù)測定

小鼠肝臟吸干血水后，按照下列公式計算肝臟系數(shù)：肝臟系數(shù)(%)=肝重(g)/體重(g)×100%。

1.6 肝臟超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛含量測定

MDA含量采用TBA法測定，結果以nmol/mg protein表示；SOD活力采用WST-1法測定，結果以U/mg protein表示；GSH-Px活力采用比色法測定，結果以U/mg protein表示。以上操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.7 肝組織病理檢查-H&E染色法

將新鮮肝組織用中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟，然后經(jīng)水化和染色，最后采用光學顯微鏡和成像系統(tǒng)進行肝臟病理變化觀察。

1.8 定量PCR(Real time Quantitative PCR，qRT-PCR)測定mRNA水平

取100 mg肝臟組織塊，制備肝臟組織勻漿，提取小鼠肝臟mRNA。取0.5 g提取得到的mRNA，經(jīng)RT后逆轉錄得到cDNA。所得cDNA采用SYBR Green法進行qPCR測定mRNA水平。所用引物序列如表2所示。

表2 不同基因 PCR 引物序列Table 2 PCR primer sequences of different gene

1.9 肝組織病理檢查-H&E染色法

實驗數(shù)據(jù)采用Prizsm 5利用軟件的t test進行統(tǒng)計學分析，各項指標以平均值±標準差(x±s)表示，p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

目前關于酒精性肝損傷的研究大多僅側重于急性或慢性兩者之中的其中一個方面，在本實驗中，我們先建立了小鼠急性酒精性肝損傷模型初步評估BO制劑的治療效果，之后進一步建立慢性肝損傷模型進行實驗，將四聯(lián)活菌制劑BO對急性和慢性酒精性肝損傷的療效均進行了探討，總結如下：

2.1 急性酒精性肝損傷模型

各組小鼠的生存率見圖1，急性酒精性肝損傷造模后模型組小鼠生存率降至16.67%，而BO治療組小鼠生存率為83.33%。與對照組相比，模型組小鼠生存率顯著下降(p<0.01)。與模型組小鼠相比，BO治療組的生存率顯著上升(p<0.05)而BO上清治療組生存率雖有上升趨勢，但無顯著差異(p>0.05)。初步結果表明BO治療可顯著提高急性酒精性肝損傷小鼠的生存率(p<0.01)，對酒精性肝損傷模型小鼠有保護作用，而BO上清治療組則無上述效果。

圖1 急性酒精性肝損傷模型生存曲線Fig.1 Survival curve of acute alcoholic-induced liver injury model

2.2 慢性酒精性肝損傷模型

2.2.1 小鼠體重、肝重和肝臟指數(shù)

各組小鼠的體重、肝重和肝臟指數(shù)見表2。各組小鼠初體重、終體重和肝重無顯著性差異(p>0.05)。與對照組相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著上升(p<0.05)。與模型組小鼠相比，BO治療組的肝臟指數(shù)顯著下降(p<0.05)，而BO上清治療組肝臟指數(shù)雖有下降趨勢，但無顯著差異(p>0.05)。由于各只小鼠的體重不同，僅用肝重進行橫向比較缺乏嚴謹性，因此運用肝臟指數(shù)進行比較更為合理。模型組小鼠肝臟指數(shù)的上升表明模型組小鼠肝臟出現(xiàn)腫大，BO制劑治療后抑制了肝臟指數(shù)的上升，減輕了肝臟的腫大。

表3 小鼠體重、肝臟重量和肝臟指數(shù)(肝重/體重×100%)Table 3 Mice body weight, liver weight and liver index (liver weight/ body weight×100%)

2.2.2 BO干預對小鼠肝臟功能的影響

圖2 BO干預對小鼠肝臟功能的影響Fig.2 Effects of BO intervention on mouse liver functions

酒精性脂肪肝作為酒精性肝病的初期表現(xiàn)，是肝臟發(fā)生損傷后的結果，脂代謝紊亂是其發(fā)生發(fā)展的主要原因之一。

如圖2所示，與對照組相比，模型組小鼠血清ALT含量升高了366.15%(p<0.001)；與模型組相比，BO治療組的ALT含量下降了46.37%(p<0.001)，BO上清治療組的ALT含量無顯著變化(p>0.05)。與對照組相比，模型組血清TG的含量上升了36.83%(p<0.05)，血清HDL含量下降了4.87%，血清LDL含量上升了4.55%(p>0.05)；與模型組相比，BO治療組的TG含量下降了17.81%(p<0.05)，表明BO制劑干預顯著抑制了TG含量的上升，同時抑制血清HDL含量的下降和LDL含量的上升，但無顯著差異(p>0.05)。與模型組相比，BO上清治療組的TG含量基本無差異，血清HDL含量有所上升，LDL含量有所下降，但無顯著差異(p>0.05)。以上結果顯示，慢性酒精性肝損傷可引起ALT活力的升高，脂代謝功能發(fā)生紊亂。BO制劑干預后，脂代謝相關指標趨于正常，提示BO制劑可能是通過影響脂代謝相關通路發(fā)揮治療作用。

2.2.3 BO干預對小鼠肝臟組織病理變化的影響

圖3 小鼠肝臟組織H&E染色光鏡像(×400)Fig.3 H&E staining light microscope images of mice liver tissues (×400)

如圖3所示，組織病理檢查結果顯示對照組小鼠肝小葉在鏡下結構清晰，肝細胞形態(tài)大小規(guī)整，肝索排列整齊，以中央靜脈為中心大致呈放射狀排列；模型組小鼠肝臟內(nèi)脂肪大量蓄積，表現(xiàn)為H&E染色下肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡，呈彌散性脂肪變，肝細胞腫脹明顯，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄充血；BO治療組小鼠肝臟與模型組相比肝細胞大小基本正常，脂肪空泡明顯減少，脂肪變有所緩解，肝索排列較為整齊，肝血竇清晰，整體接近于對照組，提示制劑治療有一定效果；BO上清治療組小鼠肝細胞內(nèi)仍可見大量脂肪空泡，肝細胞腫脹明顯，肝索排列仍紊亂，肝血竇狹窄充血，其與模型組相比未見明顯改善，提示制劑上清組治療效果不理想甚至基本無效果，表明BO制劑干預后能在一定程度上改善脂代謝紊亂的情況。

2.2.4 BO干預對小鼠肝內(nèi)MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

圖4 BO干預對小鼠肝內(nèi)MDA、SOD和GSH-Px水平的影響Fig.4 Effects of BO intervention on the levels of MDA,SOD and GSH-Px in mice livers

氧化應激在酒精性肝損傷的進展中發(fā)揮重要作用，肝細胞的損傷與自由基的產(chǎn)生密切相關。飲酒后，乙醇被乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、細胞色素P4502E1(CYP2E1)氧化為乙醛，乙醛由乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)轉換為乙酸，導入三羧酸循環(huán)生成乙酰輔酶A，在這一代謝過程中會產(chǎn)生大量的ROS[15]。同時乙醇暴露會引起內(nèi)毒素血癥，血漿中大量內(nèi)毒素到達肝臟后激活Kupffer細胞也會產(chǎn)生一定量的ROS。ROS的大量生成會打破肝細胞內(nèi)氧化與抗氧化之間的相對平衡，進而使肝細胞中發(fā)生脂質過氧化損傷，降低抗氧化酶促防御體系中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活力，增加脂質過氧化產(chǎn)物如丙二醛(malondialdehyde，MDA)的形成[16]。

如圖4所示，模型組小鼠肝臟的氧化應激水平顯著增強，表現(xiàn)為氧化應激marker分子MDA含量顯著增加，以及抗氧化酶SOD和GSH-Px活力顯著減少。與對照組相比，模型組小鼠肝內(nèi)MDA含量上升了17.40%(p<0.05)，SOD活力下降了28.34%(p<0.01)，GSH-Px活力下降了83.35%(p<0.001)；與模型組相比，BO治療組MDA含量下降了9.09%(p>0.05)，SOD活力上升了43.30%(p<0.05)，GSH-Px活力上升了281.44%(p<0.01)，表明BO制劑干預有效地抑制了MDA含量的增加和SOD、GSH-Px活力的下降。與對照組相比，BO上清治療組的GSH-Px活力上升了170.65%(p<0.05)，對MDA和SOD則無顯著作用。結果表明BO制劑干預后可通過提高抗氧化酶的活力，減少脂質過氧化產(chǎn)物的生成，緩解酒精暴露引起的氧化應激對肝細胞的損傷。

2.2.5 BO干預對小鼠肝臟組織SREBP-1c通路相關基因mRNA表達的影響

圖5 BO干預對SREBP-1c通路的影響Fig.5 Effects of BO intervention on SREBP-1c pathway

固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)，是肝細胞內(nèi)調(diào)控脂肪酸合成的重要轉錄調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)控FAS等生脂酶的活性。FAS即脂肪酸合成酶，與脂肪酸的合成密切相關，SREBP-1c能夠提高FAS的活性從而調(diào)控脂肪酸代謝[17]。有研究表明，乙醇暴露會導致SREBP-1c的mRNA水平上升，進而使FAS活化[18～20]，脂肪酸合成增加，加速脂肪肝的形成。

如圖5所示，與對照組小鼠相比，模型組小鼠肝組織中SREBP-1c、FAS的mRNA水平均顯著升高(p<0.01)。然而BO及BO上清干預后對于SREBP-1c、FAS的mRNA水平影響不顯著(p>0.05)，表明BO制劑可能不是作用于SREBP-1c通路而起到治療作用。

2.2.6 BO干預對小鼠肝臟組織PPARα通路相關基因mRNA表達的影響

圖6 BO干預對PPARα通路的影響Fig.6 Effects of BO intervention on PPARα pathway

過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)包含PPARα、PPAR β/δ和PPARγ三種亞型，其中PPARα是在肝細胞內(nèi)高表達的一種調(diào)控脂肪酸氧化分解代謝的核轉錄因子，可調(diào)控多種靶基因的表達，包括參與脂代謝幾乎所有過程如脂肪酸攝取、結合與氧化，脂蛋白組合、運輸與代謝的基因，是脂代謝關鍵的調(diào)節(jié)因子[21～23]。?；o酶A氧化酶1(acyl-CoA oxidase 1，ACOX1)和肝臟脂肪酸結合蛋白(liver fatty acid-binding protein，L-FABP)是PPARα的下游靶基因[24,25]。ACOX1主要調(diào)節(jié)脂肪酸在線粒體和過氧化物酶體中的β氧化過程，促進脂肪酸的代謝，是脂肪酸β氧化的關鍵限速酶[26]。L-FABP是一族多源性的小分子胞內(nèi)蛋白質，其主要作用是調(diào)節(jié)脂肪酸的攝取和胞內(nèi)運輸，可將脂肪酸從細胞膜上運送到脂肪酸氧化和甘油三酯及磷脂合成的場所[27]。上述三者可共同介導脂肪酸在肝細胞內(nèi)的氧化代謝。并有研究顯示，乙醇暴露能夠抑制PPARα的轉錄活性及其調(diào)控的某些靶基因的表達[28～30]。

如圖6所示，與對照組小鼠相比，模型組小鼠肝組織中PPARα和L-FABP的mRNA水平極顯著降低(p<0.001)，ACOX1的mRNA水平顯著降低(p<0.05)；與模型組相比，BO制劑干預則抑制了PPARα、ACOX1和L-FABPmRNA水平的降低(p<0.05)，表現(xiàn)為三者的mRNA水平顯著提高；而BO制劑上清干預后對于PPARα、ACOX1的mRNA水平無顯著影響(p>0.05)，但對對于L-FABP的mRNA水平有一定影響(p<0.05)。這些結果表明BO制劑干預能夠有效抑制PPARα、ACOX1 和L-FABP轉錄活性的降低。綜合以上結果，提示BO制劑可能是通過選擇性調(diào)控PPARα通路相關基因的表達緩解脂代謝紊亂，對酒精性肝損傷起到保護作用。

2.2.7 BO上清干預對小鼠的影響

在本實驗中我們還設法探究了BO制劑上清液的治療作用。BO制劑上清液是由BO制劑4000 r/min離心5 min所得，所棄沉淀為深褐色塊狀固體。實驗結果顯示，與BO制劑組相比，BO制劑上清治療組無顯著的治療效果。病理切片顯示，BO制劑上清治療組小鼠肝細胞內(nèi)仍可見大量脂肪空泡，肝細胞腫脹明顯，肝索排列仍紊亂，肝血竇狹窄充血，與模型組相比未見明顯改善，并且其所測各項生化指標及基因表達水平與模型組相近。推測原因可能是所棄沉淀含有大量的菌體成分，而菌體成分是發(fā)揮治療作用的主要因素，所以BO制劑上清的治療作用不甚理想。

3 結論

3.1 長期大量攝入酒精可引起肝損傷，表現(xiàn)為肝臟腫大，肝指數(shù)上升，肝細胞腫脹、脂肪變，伴有血清學指標的改變，如血清谷丙轉氨酶(ALT)活力的升高(p<0.001)、脂代謝相關通路的基因表達水平發(fā)生改變，表現(xiàn)為肝組織中SREBP-1c通路相關基因mRNA水平的升高以及PPARα通路相關基因mRNA水平的顯著降低。BO制劑干預能顯著提高急性酒精性肝損傷小鼠的生存率(p<0.05)。對于慢性酒精性肝損傷小鼠，BO制劑干預能緩解小鼠肝臟的腫大，減輕肝組織病理學改變，顯著降低血清ALT活力，降低血清TG和LDL的含量，升高血清HDL的含量，并可降低脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，顯著升高超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力。同時，BO制劑干預后顯著抑制了PPARα、ACOX1和L-FABP mRNA水平的降低，肝組織病理檢查也顯示肝細胞損傷有所緩解。綜合以上結果，BO制劑對酒精性肝損傷具有保護作用，作用機制可能與提高肝組織的抗氧化能力，抑制脂質過氧化，緩解酒精暴露引起的氧化應激對肝細胞的損傷，并選擇性地調(diào)控與脂代謝相關的PPARα通路相關基因的表達，緩解脂代謝紊亂有關。

3.2 現(xiàn)今益生菌制劑對于酒精性肝損傷的保護作用在許多研究中已得到初步體現(xiàn)，但大多數(shù)研究還停留在乳桿菌、雙歧桿菌等單一或兩種菌體治療效果的探究，對于多種菌種聯(lián)合應用的研究還少之又少。本實驗采用的BO制劑為一種四聯(lián)活菌制劑，對于復雜的腸道微生態(tài)而言，多種益生菌之間潛在的相互協(xié)同作用以及其對腸道菌群的影響或許對酒精性肝損傷有著更好的療效，可能在未來為ALD的防治提供一種更加切實有效的方法和途徑。

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