周興華，張曉偉，肖香，周越，趙延勝，祝瑩，張家艷，董英

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

雙酚A(BPA)自1960年工業(yè)化生產(chǎn)后，由于其加工材料無色透明、輕便及耐腐蝕等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品塑料包裝材料、金屬內(nèi)涂層及供水管的制造等[1]。但是由于BPA具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的性質(zhì)，其安全性一直受到質(zhì)疑[2～7]。目前為止，中國、歐美、美國等國家已經(jīng)禁止了BPA在嬰幼兒奶瓶的使用，法國禁止了BPA在所有食品包裝材料的應(yīng)用[8]，人們把目光轉(zhuǎn)向了與BPA結(jié)構(gòu)高度相似的雙酚S(BPS)[9]，于是BPS作為替代品廣泛應(yīng)用于各種食品包裝材料中。與此同時，BPS的產(chǎn)量每年都在增加，Liao等[10]研究發(fā)現(xiàn)在美國及7個亞洲國家（中國、印度、日本、韓國、科威特、馬來西亞和越南）的315份尿樣檢查報告中，其中81%的樣品檢出了雙酚S，而且隨著BPS替代使用范圍的擴(kuò)大，人群暴露量會更大。盡管BPS具有更好的化學(xué)穩(wěn)定性，但與BPA相比，具有更強(qiáng)的皮膚滲透性，更好的吸收率，可能造成更重的人體負(fù)擔(dān)[10～13]。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)表明，BPS及其代謝中間體具有抗雌激素或甲狀腺激素作用[14]，還能引起大鼠生殖系統(tǒng)的損傷，影響睪丸及附睪病理形態(tài)學(xué)特征及精子形成[15]。目前BPS在應(yīng)用之前并沒有對其毒理學(xué)進(jìn)行充分研究，因此BPS的安全性問題越來越受到關(guān)注[9]，尤其是BPS的低毒性效應(yīng)。秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）是一種能夠在土壤中自由生活的，常見的小型線蟲，成蟲體長約在1 mm左右，以細(xì)菌為食，與其他模式生物相比，具有體積小、繁殖能力強(qiáng)、易于培養(yǎng)、成本低、易保藏、傳代快和身體透明等特點(diǎn)，秀麗線蟲對外源化合物十分敏感，因此也是毒理學(xué)評價中的經(jīng)典模式生物[16]。本實(shí)驗(yàn)以BPS為研究對象，秀麗線蟲為模式生物，研究BPS暴露對秀麗線蟲的急性毒性、運(yùn)動行為指標(biāo)、壽命及子代數(shù)目的影響，為BPS在食品包裝材料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器設(shè)備

BPS，美國Sigma公司；活性氧ROS試劑盒，南京生物建成生物有限責(zé)任公司；其他生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司。體視顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；多功能酶標(biāo)儀，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 秀麗線蟲的培養(yǎng)

秀麗隱桿線蟲N2野生型，東南大學(xué)王大勇實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.3 秀麗線蟲的同步化

將大量處于產(chǎn)卵期的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲成蟲從NGM固體培養(yǎng)基沖洗下來，加入1 mL的裂解液，裂解5 min，3000 r/min離心1.5 min，棄上清，得到沉淀的蟲卵。反復(fù)清洗3次，以充分去除裂解液成分。最后將蟲卵轉(zhuǎn)移到涂有新鮮食物的NGM培養(yǎng)基上，在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計配制濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0 mM的BPS染毒液，染毒液中乙醇的終濃度全部為0.1%。將處于L4期的秀麗隱桿線蟲分別轉(zhuǎn)移到含有不同濃度染毒液的培養(yǎng)基中，進(jìn)行急性毒性暴露，24小時后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

時間一分一秒地過去，激蕩在內(nèi)心的憤恨盛怒已消失殆盡，恐慌焦慮悄然爬上心頭。昨天老四曾囑咐我們要善于發(fā)現(xiàn)對手的弱點(diǎn)，但皮特除了缺乏討喜的品質(zhì)外，沒有任何弱點(diǎn)。他夠高夠強(qiáng)壯，塊頭大，但又沒有大到使行動遲緩；他對別人的弱點(diǎn)有很好的判斷力；他生性惡毒，肯定不會對我有半點(diǎn)慈悲心。我本想理直氣壯地告訴他不要小瞧我，可這分明是個謊言。皮特猜得一點(diǎn)沒錯，我真是一點(diǎn)打斗能力都沒有。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 運(yùn)動行為指標(biāo)的測定

首先，針對跨區(qū)域活動的趨勢，我國應(yīng)當(dāng)盡快在中央建立專門的反黑領(lǐng)導(dǎo)機(jī)構(gòu)，再組建一支國家級的打黑專業(yè)隊(duì)伍。這支隊(duì)伍的主體應(yīng)當(dāng)從公、檢、法抽調(diào)精兵強(qiáng)將組成，并相對獨(dú)立于各政法部門，直接對反黑領(lǐng)導(dǎo)機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)，再輔之以法律、金融等相關(guān)行業(yè)的專家組成顧問團(tuán)，主要負(fù)責(zé)全國反黑情報的收集、研判、立案、流轉(zhuǎn)、指導(dǎo)等工作。［20］這種做法的優(yōu)勢在于，可以從中央層面掌握和分析全國有組織犯罪態(tài)勢，制定宏觀的打擊戰(zhàn)略和方針，協(xié)調(diào)各執(zhí)法部門工作，統(tǒng)籌打擊力量，確保打擊效果;相對獨(dú)立和高級別的機(jī)構(gòu)也能較少受到“保護(hù)傘”的干擾，有利于深挖國家公職人員中的“內(nèi)線”。［21］

將暴毒后的線蟲依次挑起置于沒有涂布大腸桿菌的NGM培養(yǎng)基上，在體式顯微鏡下觀察。記線蟲身體向前走過一個波長為一次身體彎曲，記錄30 s內(nèi)線蟲的身體彎曲次數(shù)。

頭部擺動頻率：滴取適量M9于載玻片上，挑取暴毒后的線蟲于M9液滴中，在體式顯微鏡下觀察，頭部擺動頻率的標(biāo)準(zhǔn)為1 min內(nèi)頭部從一側(cè)擺到另一側(cè)再擺回來的次數(shù)。

回顧世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展的脈絡(luò)可見，試圖打造在資源配置中統(tǒng)管一切的全能政府是不切實(shí)際的。因?yàn)?，全能政府模式是通過行政權(quán)的運(yùn)用來達(dá)致經(jīng)濟(jì)決策與執(zhí)行的高度統(tǒng)一，而不是考慮如何通過市場促進(jìn)社會經(jīng)濟(jì)的協(xié)調(diào)發(fā)展。與此相反，負(fù)面清單管理模式以一種相對消極的權(quán)力模式對待新的經(jīng)濟(jì)發(fā)展形態(tài)，主動將管理權(quán)部分地讓渡給社會民眾，通過社會民眾自發(fā)自為的管理替代強(qiáng)力約束。但是，如若一味地追求無為而過度推崇負(fù)面清單模式，也可能會產(chǎn)生混亂。

暴毒結(jié)束后，在涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上挑1只待產(chǎn)卵的線蟲，并保證在產(chǎn)卵期內(nèi)每天將線蟲轉(zhuǎn)移到新的NGM培養(yǎng)基內(nèi)，含有蟲卵的舊平板繼續(xù)放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，然后對每個平板內(nèi)的線蟲的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計、相加。等到線蟲的排卵期結(jié)束后，計算每條線蟲總的子代數(shù)目。

1.5.4 活性氧自由基[17]的測定

1.5.1.1 頭部擺動頻率

總而言之，化學(xué)實(shí)驗(yàn)是初中化學(xué)教學(xué)的重要組成內(nèi)容，其作用是其他教學(xué)所無法替代的。在初中化學(xué)實(shí)驗(yàn)課堂教學(xué)中，教師必須不斷改進(jìn)教學(xué)觀念，發(fā)展教學(xué)理念，用素質(zhì)教育理念作為教學(xué)的指導(dǎo)思想，推動初中化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果的不斷提升，實(shí)現(xiàn)初中生綜合素養(yǎng)的均衡提高。

線蟲的壽命是指從線蟲的卵開始直到死亡的這段時間。

2、選擇利用 ISO國際標(biāo)準(zhǔn)指紋模塊AS608指紋模塊集成了光路和指紋處理部分的一體化指紋處理模塊，體積小、功耗低、接口簡單可靠性高識別速度快等特點(diǎn)，對于干濕手指均有相應(yīng)快的特點(diǎn)。

1.5.3 壽命的測定

暴毒結(jié)束后，每個濃度挑取50只待測線蟲至Costar 24孔板內(nèi)，然后每個孔內(nèi)分別加入ROS試劑，使熒光探針CM-H2DCFDA的終濃度為1 μmol/L。在無菌生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后取出處理后的受試線蟲，用M9緩沖液沖洗3次，以去除殘留的ROS試劑。用多功能酶標(biāo)儀來檢測各個濃度的受試線蟲的ROS水平，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設(shè)置為485 nm和535 nm，讀出ROS的平均熒光強(qiáng)度。ROS水平的單位定義為相對熒光強(qiáng)度/50條受試線蟲。

1.5.2 子代數(shù)目的測定

1.5.1.2 身體彎曲頻率

暴毒結(jié)束后，將秀麗隱桿線蟲挑到新的培養(yǎng)基上，產(chǎn)卵期內(nèi)每天將線蟲轉(zhuǎn)移到新的平板上，后期每兩天轉(zhuǎn)移一次。

1.6 統(tǒng)計分析

利用origin 8.5對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，并用SPSS做顯著性分析，與對照組相比較，顯著水平設(shè)定為*p<0.05和**p<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPS急性暴毒對秀麗隱桿線蟲運(yùn)動行為的影響

圖1 BPS急性暴露對秀麗隱桿線蟲運(yùn)動行為的影響Fig.1 Effects of BPS acute exposure on the movement behavior of C. elegans

圖1顯示了不同濃度的BPS急性暴露對秀麗隱桿線蟲運(yùn)動行為的影響。如圖所示，當(dāng)BPS濃度達(dá)到10 μmol/L時，秀麗線蟲的頭部擺動頻率顯著下降（p<0.01）。BPS濃度為100 μmol/L時，與對照組相比，頭部擺動頻率下降13.49%。而當(dāng)BPS濃度達(dá)到1 μmol/L時，秀麗線蟲的身體彎曲頻率顯著下降（p<0.05），BPS濃度為100 μmol/L時，與對照組相比，身體彎曲頻率下降23.64%。研究表明，BPS可以顯著地抑制秀麗線蟲運(yùn)動行為能力，BPS濃度越高，秀麗線蟲的運(yùn)動行為能力抑制越顯著。

2.2 BPS對壽命的影響

圖2顯示了不同濃度的BPS對秀麗線蟲的壽命的影響。如圖所示，與對照組相比，當(dāng)BPS濃度達(dá)到0.001 μmol/L時，秀麗線蟲的壽命顯著降低（p<0.01）。BPS濃度越高，秀麗線蟲壽命的負(fù)面影響越顯著。BPS濃度為100 μmol/L時，與對照組相比，壽命下降35.42%。研究表明，BPS可以顯著降低秀麗線蟲的壽命，并與濃度呈現(xiàn)出一定的線性關(guān)系。

2.3 BPS對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目的影響

不同濃度的BPS對秀麗線蟲子代數(shù)目的影響如圖3所示，與對照組相比，濃度越高，子代數(shù)目下降越明顯。BPS為10 mol/L時，與對照組相比，秀麗線蟲子代數(shù)目下降28.13%，濃度為100 μmol/L時，子代數(shù)目下降30.47%。研究表明，BPS可以顯著影響秀麗線蟲的子代數(shù)目。

就能得出奇異值差分譜序列的峰值譜N,以及相應(yīng)的重構(gòu)階數(shù).如差分譜峰值dk,以角標(biāo)數(shù)字k找出奇異值序列中的對應(yīng)峰值σk,即在k值前的奇異值變化較大,而之后的奇異值將接近于某一值后穩(wěn)定.說明峰值σk是信號與噪聲的分界點(diǎn),此時取k值前的奇異值重構(gòu)信號,該信號就是降噪處理后的真實(shí)振動特征數(shù)據(jù).

圖2 BPS急性暴露對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.2 Effects of BPS acute exposure on the lifespan of C. elegans

圖3 BPA急性暴露對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)量的影響Fig.3 Effects of BPS acute exposure on the brood size of C.elegans

2.4 BPS對秀麗線蟲ROS的影響

圖4 BPS急性暴露對秀麗線蟲ROS水平的影響Fig.4 Effects of BPS acute exposure on ROS level of C. elegans

圖4顯示了不同濃度BPS急性暴露對秀麗線蟲ROS水平的影響，如圖所示，與對照組相比，BPS濃度達(dá)到0.01 μmol/L時，秀麗線蟲的ROS水平顯著升高（p<0.01）。BPS濃度越高，ROS水平越高。BPS濃度為100 μmol/L時，與對照組相比，ROS水平升高了776.64%。研究表明，BPS可以顯著升高秀麗線蟲ROS水平，推測BPS可能通過氧化應(yīng)激途徑進(jìn)而損害秀麗線蟲。

3 結(jié)論

隨著BPA逐漸進(jìn)入公眾的視野，其安全性備受質(zhì)疑，很多食品包裝材料及嬰幼兒奶瓶也打上了“無BPA”的字眼，卻使用了另外一種結(jié)構(gòu)高度相似的化合物BPS，然而關(guān)于BPS的毒理學(xué)研究甚少，尤其是以秀麗線蟲作為模式生物，目前僅有兩篇相關(guān)報道[1,18]。本論文研究了BPS急性暴露對秀麗線蟲毒性作用，選取了不同的低濃度水平分析BPS對秀麗線蟲運(yùn)動行為、生長發(fā)育及繁殖能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BPS濃度達(dá)到1 μmol/L時，BPS顯著性的抑制了秀麗線蟲的運(yùn)動行為能力，其中頭部擺動頻率和身體彎曲頻率顯著下降，同時子代數(shù)量也在下降。Mersh等[1]研究了BPS胚胎期暴露對秀麗線蟲的非聯(lián)合型學(xué)習(xí)能力，研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，濃度達(dá)到0.1 μmol/L時，對秀麗線蟲刺激次數(shù)顯著性增加，也就是說，低濃度的BPS也能影響秀麗線蟲的習(xí)慣化學(xué)習(xí)能力，需要更多的外部刺激才能使秀麗線蟲適應(yīng)環(huán)境的變化，推測這種習(xí)慣化學(xué)習(xí)行為的改變可能是BPS與雌二醇結(jié)構(gòu)的相似性，干擾了神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性的變化，進(jìn)而影響了秀麗線蟲的學(xué)習(xí)記憶及運(yùn)動行為能力[19]，研究也發(fā)現(xiàn)濃度超過1 μmol/L時，子代數(shù)量也在顯著降低。Chen等[18]研究了BPS對秀麗線蟲的生殖細(xì)胞及繁殖功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPS和BPA均能引起的生殖系統(tǒng)損傷，增加生殖細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致胚胎致死率上升，而研究也發(fā)現(xiàn)，BPS和BPA可能是通過不完全相同途徑作用生殖系統(tǒng)。我們研究還發(fā)現(xiàn)，低濃度的BPS能夠顯著縮短秀麗線蟲的壽命，促進(jìn)ROS的生成，推測ROS的過度產(chǎn)生可能是加速秀麗線蟲的衰老的主要原因。

[1] Mersha M D, Patel B M, Patel D, et al. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults [J]. Behavioral &Brain Functions, 2015, 11(1): 27

[2] Miyawaki J, Sakayama K, Kato H, et al. Perinatal and postnatal exposure to bisphenol a increases adipose tissue mass and serum cholesterol level in mice [J]. Journal of Atherosclerosis & Thrombosis, 2007, 14(5): 245

[3] Moral R, Wang R, Russo I H, et al. Effect of prenatal exposure to the endocrine disruptor bisphenol A on mammary gland morphology and gene expression signature [J]. Journal of Endocrinology, 2008, 196(1): 101

[4] Zhang X, Chang H, Wiseman S, et al. Bisphenol A disrupts steroidogenesis in human H295R cells [J]. Toxicological Sciences An Official Journal of the Society of Toxicology,2011, 121(2): 320

[5] Rochester J R. Bisphenol A and human health: a review of the literature [J]. Reproductive Toxicology, 2013, 42(12):132-155

[6] Rezg R, Elfazaa S, Gharbi N, et al. Bisphenol A and human chronic diseases: current evidences, possible mechanisms,and future perspectives [J]. Environment International, 2014,64(3): 83

[7] Rubin B S, Paranjpe M, Dafonte T, et al. Perinatal BPA exposure alters body weight and composition in a dose specific and sex specific manner: the addition of peripubertal exposure exacerbates adverse effects in female mice [J].Reproductive Toxicology, 2016, 68: 130-144

[8] Amat E, Rihouey-Robini L. Bisphenol A in January 2015:French prohibition and EFSA study [J]. European Food and Feed Law Review, 2015, 10(2): 138-138

[9] Glausiusz, Josie. Toxicology: The plastics puzzle [J]. Nature,2014, 508(7496): 306-308

[10] Liao C, Liu F, Alomirah H, et al. Bisphenol s in urine from the united states and seven asian countries: occurrence and human exposures [J]. Environmental Science & Technology,2012, 46(12): 6860-6866

[11] Ike M, Chen M Y, Danzl E, et al. Biodegradation of a variety of bisphenols under aerobic and anaerobic conditions [J].Water Science & Technology A Journal of the International Association on Water Pollution Research, 2006, 53(6):153-159

[12] Danzl E, Sei K, Soda S, et al. Biodegradation of Bisphenol A,Bisphenol F and Bisphenol S in Seawater [J]. International Journal of Environmental Research & Public Health, 2009,6(4): 1472-1484

[13] Héliès-Toussaint C, Peyre L, Costanzo C, et al. Is bisphenol S a safe substitute for bisphenol A in terms of metabolic function? An in vitro study[J]. Toxicology & Applied Pharmacology, 2014, 280(2): 224-235

[14] Skledar D G, Schmidt J, Fic A, et al. Influence of metabolism on endocrine activities of bisphenol S [J]. Chemosphere,2016, 157: 152

[15] Ullah H, Jahan S, Ain QU, et al. Effect of bisphenol S exposure on male reproductive system of rats: A histological and biochemical study [J]. Chemosphere, 2016, 152: 383-391

[16] Corsi A K, Wightman B, Chalfie M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans [J].Genetics, 2015, 200(2): 387-407

[17] Rosenfeldt E J, Linden K G. Degradation of endocrine disrupting chemicals bisphenol A, ethinyl estradiol, and estradiol during UV photolysis and advanced oxidation processes [J]. Environmental Science & Technology, 2004,38(20): 5476-5483

[18] Chen Y, Shu L, Qiu Z, et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function[J]. Plos Genetics, 2016, 12(7): e1006223

[19] Baudry M, Bi X, Aguirre C. Progesterone-estrogen interactions in synaptic plasticity and neuroprotection [J].Neuroscience, 2013, 239: 280-294