何 文， 呂 杰， 李 濤， 文艷飛， 韓嬋林， 蔡柳洪△

(1中山大學附屬第三醫(yī)院生殖中心， 廣東 廣州 510630； 2江門市中心醫(yī)院，中山大學附屬江門醫(yī)院生殖中心， 廣東 江門 529030)

卵巢顆粒細胞是組成卵泡最大的細胞群，是女性生殖過程中發(fā)揮重要作用的一類細胞。顆粒細胞與卵母細胞之間存在廣泛的信息交流，二者形成功能上的統(tǒng)一體。研究表明，顆粒細胞的質量下降或凋亡增多會影響激素和細胞因子的分泌，甚至影響卵母細胞的發(fā)育以及后續(xù)的胚胎質量[1-2]。當卵泡竇腔形成后，顆粒細胞分化可為卵丘顆粒細胞(cumulus cells，CCs)和壁層顆粒細胞(mural granulosa cells，MGCs)，這2種顆粒細胞在卵泡生長過程中發(fā)揮著不同的作用[3-4]。MGCs是承擔卵巢分泌激素和細胞因子的主要功能細胞，主要通過旁分泌和自分泌的形式調節(jié)卵母細胞發(fā)育過程[5]；CCs附著于卵母細胞，與卵母細胞形成一個結構功能緊密的合胞體，通過復雜的細胞間鏈接機制參與影響卵泡發(fā)育[6]。

人卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)模型的建立，不僅可運用于女性生殖內分泌和輔助生殖技術的研究，而且可應用于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的生理及藥物毒性等的研究。由于MGCs的原代培養(yǎng)樣本較易獲取，因此關于人MGCs體外建系的文獻報道較多，但由于提取CCs需要的樣本來源較難獲得和所需樣本量大等因素限制，因此關于人CCs體外建系的研究甚少。本實驗依托中山大學附屬第三醫(yī)院生殖中心充足的臨床樣本，選取進行卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技術治療的患者，用機械切割所得卵丘顆粒細胞復合物培養(yǎng)人CCs，并與人MGCs體外培養(yǎng)進行對比，比較2種顆粒細胞建系的操作特點及細胞體外培養(yǎng)的生物學特性，旨在建立人CCs體外培養(yǎng)體系，作為人顆粒細胞亞群的補充。

材 料 和 方 法

1材料

人淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque PLUS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青/鏈霉素、L-谷氨肽胺(GlutaMAXTM-I)、非必需氨基酸(nonessential amino acids，NEAA)、0.25% 胰酶和PBS緩沖液均購于Invitrogen；抗人卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)抗體購于R&D Systems；MOPS緩沖液購于Vitrolife；驢抗小鼠熒光II抗購于Abcam；Triton X-100、Tris-HCl和Tween-20購于Amresco；4%多聚甲醛和正常山羊血清封閉液購于BOSTER；Hoechst 33342購于碧云天；CCK-8試劑盒購于Dojindo；雌激素檢測ELISA試劑盒購于Elabscience。

收集2016年11月～2017年4月于中山大學附屬第三醫(yī)院生殖中心行ICSI治療的患者樣本共30例。所有患者均年齡介于25～35歲，基礎性激素水平在正常范圍內，月經第3天竇卵泡數在7～20個之間，均采用經典黃體期長方案超排卵，獲卵數≥20個。實驗過程所涉及卵泡液和卵丘顆粒細胞復合物均為患者治療過程中的醫(yī)療廢物，所有樣本均獲得患者的知情同意，項目的實施獲得中山大學附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學倫理委員會批準。

2方法

2.1人卵丘顆粒細胞的分離、提純及培養(yǎng) 對ICSI超排卵患者收集取卵后， 常規(guī)進行卵母細胞-卵丘顆粒細胞復合物機械切割處理， 所得的卵丘顆粒細胞復合物(要求每次收集ICSI樣本獲卵數≥20個)用顆粒細胞培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基)于培養(yǎng)皿中洗滌2次， 以去除撿卵過程中的MOPS液和沖洗液中的礦物油，然后用1.5 mL顆粒細胞培養(yǎng)基接種于12孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后全量換液1次，之后每48 h全量換液1 次，光學顯微鏡觀察顆粒細胞形態(tài)。

2.2人壁層顆粒細胞的分離、提純及培養(yǎng) 收集ICSI超排卵患者取卵術采集的卵泡液(不含卵母細胞及卵丘顆粒細胞復合物)，采用密度梯度離心法分離[7]，具體操作為：300×g離心10 min，棄上清，用2 mL PBS液重懸，加入2 mL胰酶， 37 ℃消化10 min后加入1 mL顆粒細胞培養(yǎng)基終止消化;后300×g離心30 min,棄上清，加入2 mL PBS液重懸，小心加入2 mL Ficoll液面上，400×g離心20 min。離心后顆粒細胞位于上層混合液和下層Ficoll液交界液面處，用移液管輕柔吸取，加入3 mL PBS液，300×g離心3 min后棄上清，用顆粒細胞培養(yǎng)液重懸沉淀，接種6孔板, 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 24 h后全量換液1次，之后每48 h全量換液1 次，光學顯微鏡觀察顆粒細胞形態(tài)。

2.3細胞鑒定 分別取培養(yǎng)至第3代的2種顆粒細胞，接種于12孔板中，培養(yǎng)至融合度60%時用PBS清洗2次，4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，PBS沖洗3次,每次5 min，用含0.1% Triton X-100的BSA液破膜并封閉1 h，PBS沖洗3次，每次5 min，用細胞免疫熒光法檢測FSHR抗體表達情況，細胞質出現紅染為陽性；Hoechst 33342檢測細胞核，胞核表現為藍染。

2.4細胞生長曲線的檢測 取2種顆粒細胞培養(yǎng)至融合度70%～80%時傳代，吸去培養(yǎng)液，PBS清洗1遍，胰酶消化，計數細胞濃度為1×109/L，接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每48 h全量換液1次。取第3代的2種顆粒細胞，以5×106/L密度接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后全量換液1次，之后每48 h全量換液1次。于培養(yǎng)第1、3、5、7、9和11天時點每孔添加10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 h后使用酶標儀測量各孔在450 mm波長處的吸光度(A)。

2.5雌激素檢測 取第3代的2種顆粒細胞，以1×109/L的密度接種于6孔板中，24 h后全量換液1次，每48 h全量換液1次，收集培養(yǎng)第1、3、5、7、9和11天的細胞培養(yǎng)液，-80 ℃儲存，用ELISA方法檢測培養(yǎng)基中雌激素含量。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析。每組實驗至少重復3次，結果以均數±標準差(mean±SD)表示，獨立樣本均數比較采用t檢驗，重復測量數據的組間比較采用重復測量方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

12種顆粒細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)學觀察

人CCs原代提取于撿卵時進行卵母細胞ICSI前處理，用細針切割卵母細胞周圍卵丘顆粒細胞復合體而得，幾乎沒有紅細胞殘留，24 h后培養(yǎng)基中復合體內顆粒細胞大部分貼壁生長，培養(yǎng)24 h后換液將剩余漂浮復合體團塊洗去，顯微鏡下觀察到顆粒細胞生長分散，細胞伸展充分，見圖1A；人MGCs原代提取培養(yǎng)24 h后大部分貼壁生長，但仍有較多數量紅細胞混雜，見圖1B，紅細胞并未對顆粒細胞貼壁產生明顯影響，培養(yǎng)24 h后全量換液可去除大部分殘留紅細胞。

Figure 1. The representative images ofinvitrocultured human cumulus cells and human mural granulosa cells (×200). A: human cumulus cells after 24 h of incubation; B: human mural granulosa cells after 24 h of incubation. a: human cumulus cells; b: human mural granulosa cells; c: remaining erythrocytes. The scale bar=50 μm.

圖1體外培養(yǎng)的人卵丘顆粒細胞和人壁層顆粒細胞

2種顆粒細胞貼壁后外觀相似，均呈梭形或多突狀，胞核大、圓，核仁明顯，細胞質顆粒豐富、均勻，細胞間偽足連接緊密。體外培養(yǎng)這2種細胞在第3～7天分裂能力達到峰值，第7～9天進入生長平臺期，隨后出現退化現象，懸浮細胞增多，細胞出現類成纖維細胞形態(tài)改變。

2免疫熒光鑒定顆粒細胞

對2種顆粒細胞進性免疫熒光方法檢測FSHR表達，結果顯示， 胞質呈紅色，說明FSHR表達陽性，陽性率達90%以上，表明2種來源所得細胞均為顆粒細胞，見圖2。

Figure 2. Immunofluorescence staining of human cumulus cells and human mural granulosa cells (×400). The scale bar=20 μm.

圖2人卵丘顆粒細胞和人壁層顆粒細胞的免疫熒光觀察

3細胞生長曲線比較

CCK-8法檢測發(fā)現，培養(yǎng)第1天，2種顆粒細胞貼壁數量相當；培養(yǎng)第3、5及7天，人CCs數量均較人MGCs多；第9及11天結果顯示， CCs開始出現細胞凋亡而MGCs進入生長平臺期。統(tǒng)計結果顯示2種顆粒細胞的生長曲線差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

4雌激素分泌能力比較

Figure 3. The growth curves of human cumulus cells and human mural granulosa cells. Mean±SD.n=10.

圖3人卵丘顆粒細胞和人壁層顆粒細胞生長曲線

ELISA方法檢測發(fā)現， MGCs分泌雌激素稍多于CCs[(3.17±0.33) nmol/Lvs(2.95±0.14) nmol/L]，但統(tǒng)計結果顯示2種顆粒細胞分泌雌激素量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 見圖4。

Figure 4. Estrogen contents in the culture media of human cumulus cells and human mural granulosa cells. Mean±SD.n=10.

圖4人卵丘顆粒細胞和人壁層顆粒細胞培養(yǎng)液雌激素含量

討 論

卵巢顆粒細胞是卵母細胞生長發(fā)育內環(huán)境的重要組成部分，其體外培養(yǎng)模型的建立對研究多能干細胞分化具有重要意義，如在生殖系細胞發(fā)生的熱點研究中，將干細胞與MGCs共培養(yǎng)，發(fā)現MGCs能促進干細胞向雌性生殖細胞進一步分化[8-10]。此外，MGCs的體外模型有助于研究其與卵母細胞的互相調節(jié)機制，并且可以為卵母細胞與顆粒細胞共培養(yǎng)及多能干細胞與顆粒細胞共培養(yǎng)的研究提供不同的顆粒細胞亞類來源[11-13]。不過，上述研究的開展大部分取用壁層顆粒細胞作為研究對象，CCs作為顆粒細胞亞群之一，與卵母細胞處于同一微環(huán)境中，其所起到的作用與MGCs不同[14]，因此需要建立CCs培養(yǎng)體系，為研究卵母細胞發(fā)生和干細胞共培養(yǎng)等研究提供不同的顆粒細胞亞群。

細胞建系的關鍵在于原代顆粒細胞的分離和提純方法，本實驗采用直接培養(yǎng)法對CCs進行原代提取，比傳統(tǒng)密度梯度離心法分離MGCs更為簡單方便[15]。直接法無需消化及離心操作，有研究指出[16]，CCs生長發(fā)育受卵母細胞分泌因子的調控，脫離了卵母細胞的單獨CCs不適宜長期體外培養(yǎng)，不過該項研究基于山羊模型，因此所得結論可能不適用于人CCs的體外培養(yǎng)。此外，有國內學者認為[17]，卵丘顆粒細胞復合物中的黏液團會影響顆粒細胞的提純及生長活性。與卵母細胞體外受精操作中對卵母細胞-卵丘顆粒細胞復合物的處理比較而言，ICSI操作機械切割卵丘顆粒細胞復合物的體積更大，剝除的顆粒細胞更多，本實驗選取ICSI促排獲卵超過20個的患者作為原代提取樣本，所收集的卵丘顆粒細胞復合物量較多。本研究結果顯示，雖然黏液團未經消化，但CCs在培養(yǎng)24 h后可從黏液團中爬向皿底并貼壁，后續(xù)生長的顆粒細胞形態(tài)結構與MGCs相似，未見明顯異常。CCs樣本收集前經過MOPS液沖洗2次，基本不含血細胞影響，培養(yǎng)24 h后可除去絕大部分黏液團塊，此法可保證細胞純度的同時，操作簡單。本實驗原代樣本取自ICSI促排獲卵超過20個的患者，若種皿時選取6孔板及更大面積培養(yǎng)皿，CCs 24 h后貼壁密度低，會導致后續(xù)的生長受到影響。本實驗提示， 如果12孔板中每孔原代樣本量少20個卵丘顆粒細胞復合物，會因為貼壁的顆粒細胞密度過低，導致接下來的生長受到影響。但由于沒有對黏液團塊進行消化處理，無法提供定量種皿的細胞數，是本實驗的不足之處。

本實驗研究顯示，CCs的體外培養(yǎng)生長特點和雌激素分泌功能和MGCs相似。目前，有關人顆粒細胞體外培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的選擇文獻報道不一[18-20]，本實驗綜合當前研究報道，選擇含體積分數為10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基作為MGCs及CCs培養(yǎng)基，且未在培養(yǎng)基中添加卵泡液。CCK-8實驗結果顯示，CCs體外生長情況良好，伸展性佳，具有和MGCs相當的生長能力，因此提示本實驗選用的培養(yǎng)基適用于CCs的體外培養(yǎng)；FSHR抗體免疫熒光結果表明，從卵丘顆粒細胞復合物中分離所得細胞為顆粒細胞[21]；ELISA檢測雌激素結果提示，分離所得CCs分泌雌激素能力和MGCs相似，提示我們CCs在體外培養(yǎng)后同樣具有雌激素分泌功能。

綜上所述，本實驗建立了一種有效的分離、提取和培養(yǎng)人CCs的方法，且操作簡便，并通過與經典的人MGCs體外培養(yǎng)方法比較，結果顯示， 人CCs具有良好的體外生長能力以及雌激素分泌功能，為有關顆粒細胞的體外實驗、卵母細胞-顆粒細胞共培養(yǎng)和誘導干細胞-顆粒細胞共培養(yǎng)等研究提供了不同的顆粒細胞亞群。

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