王繼榮， 盧 艷， 岳影星， 代繼桓， 楊舟鑫△

(浙江醫(yī)院 1浙江省老年醫(yī)學重點實驗室， 2放射科， 浙江 杭州 310013)

從骨髓中分離得到的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以黏附在塑料培養(yǎng)瓶中快速增殖，并具有向脂肪、骨髓和軟骨細胞分化的能力，因此可以作為細胞替代治療的種子細胞[1]。MSCs具有免疫調節(jié)功能，在多種免疫相關疾病中被認為有良好的應用前景。最近研究表明，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可通過再生修復、免疫調節(jié)、抗氧化和抗凋亡等減輕炎癥反應[2]。

Notch信號通路在進化上高度保守，通過相鄰細胞之間的相互作用對造血干細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞及T和B淋巴細胞的發(fā)育和功能的發(fā)揮都有重要的調節(jié)作用，并參與腫瘤、病毒感染、炎癥反應和自身免疫疾病等免疫相關疾病的發(fā)生[3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)信號能增強Notch途徑的活性，而且更重要的是，Notch1和Notch2活性形式的過量表達，會抑制TLR4開啟的炎癥細胞因子[如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 和白細胞介素6(intreleukin-6，IL-6)]的生成，并且促進抗炎細胞因子IL-10的生成[4]。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以被細胞表面TLR4識別，繼而引發(fā)多種細胞的炎癥反應[5]。然而，Notch信號是否參與LPS所誘導的炎癥反應尚不明確。在本研究中，我們探討了Notch信號通路對LPS所誘導的BMSCs增殖和炎癥因子分泌的作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑及儀器

小鼠骨髓間充質干細胞培養(yǎng)基為STEMCELL Technologies產(chǎn)品；PBS和胰酶為吉諾公司產(chǎn)品；脂多糖與DAPT為Sigma產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為Qiagen產(chǎn)品；逆轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒為Thermo產(chǎn)品；IL-6的ELISA試劑盒為eBioscience產(chǎn)品；趨化因子CXCL1的ELISA試劑盒為PeproTech產(chǎn)品。酶標儀購自Thermo；倒置相差顯微鏡購自Leica；定量PCR儀購自Roche。

2主要方法

2.1小鼠骨髓間充質干細胞的分離和原代培養(yǎng) 6～8周雄性C57BL/6小鼠購自浙江省中醫(yī)藥大學動物實驗中心，質量合格證號為No. 1612060018。頸椎脫臼法處死小鼠后，75%乙醇中浸泡5 min，取出兩側腿骨，置于裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中小心剔除粘連于骨上的肌肉組織，剪去腿骨兩端，用1 mL注射器抽取已經(jīng)預先配好的小鼠間充質干細胞完全培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔，直至骨發(fā)白，收集沖洗液，反復吹打使細胞打散，移至滅菌的10 mL離心管中，4 ℃、1 600 r/min離心5 min，棄上清，用小鼠間充質干細胞完全培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度至5×109/L，接種到T25培養(yǎng)瓶，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，輕輕吸出上清，并加入新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液1次，并觀察細胞形態(tài)。

2.2小鼠骨髓間充質干細胞消化和傳代擴增 原代細胞生長至大約80%融合時，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37 ℃條件下消化至細胞呈圓形，用完全培養(yǎng)基終止反應，用PBS沖洗細胞并轉移到一個15 mL的離心管中， 4 ℃、1 600 r/min離心5 min，棄上清，再加入完全培養(yǎng)液重懸細胞，按1∶3比例傳代，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞生長至接近80%時，重復以上操作，再次傳代。取6～10代的間充質干細胞用于后續(xù)實驗。

2.3MTT法和活細胞計數(shù)法檢測細胞增殖 將BMSCs以每孔2×103的密度種于96孔板中，細胞貼壁后分別加入LPS (10 μg/L、100 μg/L和1 mg/L)與DAPT(10 mg/L)，對照(control)組加入等體積DMSO。72 h后加入MTT檢測細胞活力，并置于培養(yǎng)箱中，3 h后棄溶液，加入100 μL DMSO溶解并在酶標儀上檢測490 nm處吸光度(A)。

將BMSCs以每孔3×104的密度種于6孔板中，細胞貼壁后分別加入LPS(1 mg/L)與DAPT(10 mg/L)，對照組加入等體積DMSO。LPS刺激72 h后，拍照，用胰酶消化后加入2 mL培養(yǎng)基重懸細胞，取20 μL細胞懸液加入80 μL臺盼藍混勻，最后用微量移液器吸取10 μL進行活細胞計數(shù)。

2.4qPCR檢測基因表達 BMSCs以每孔1×105的密度種于6孔板中，細胞貼壁后LPS刺激組加入1 mg/L 的LPS，DAPT組加入10 mg/L的DAPT，LPS刺激24 h后，收集細胞。使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)抽提細胞總RNA，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的逆轉錄體系合成cDNA，并使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix來進行qPCR。使用LightCycler 480實時定量PCR擴增儀(Roche)進行 PCR擴增。以β-actin為內參照，分析目的基因的相對表達量。擴增產(chǎn)物的特異性通過繪制熔解曲線來進行驗證。用于qPCR的引物見表1。

2.5Western blot法檢測蛋白表達 BMSCs以每孔1×105的密度種于6孔板中，細胞貼壁后LPS刺激組加入1 mg/L 的LPS，LPS刺激的48 h后，收集細胞。

表1 qPCR引物

F: forward； R: reverse.

Western blot按照標準的流程進行，主要包括：蛋白的提取和定量、電泳樣本制備及SDS-PAGE；然后轉到PVDF膜上，將轉印后的膜用5% BSA室溫封閉1 h，TBST清洗后加入I抗(Notch1、Notch2、Jagged1、Dll3、Dll4和Hes1抗體購自Cell Signaling Technology；Notch3、Notch4、Jagged2、Dll1和Hey1抗體購自Abcam)4 ℃孵育過夜；TBST清洗后再用熒光II抗室溫孵育1 h；清洗后以Odyssey顯像系統(tǒng)觀察和拍攝Western blot條帶。

2.6ELISA檢測IL-6與CXCL1的分泌 吸取未加MTT的方法2.3培養(yǎng)條件下的細胞培養(yǎng)上清，使用ELISA 試劑盒，按照說明書的方法，檢測IL-6或CXCL1濃度。

3統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，經(jīng)SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)及Dunnett’s檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1LPS對BMSCs活力和IL-6分泌的影響

分離小鼠原代BMSCs，貼壁培養(yǎng)后觀察，細胞呈梭形且可以在體外迅速擴增，進一步經(jīng)流式分析發(fā)現(xiàn)其表達CD29與CD106而非CD31與CD45，并且具備成骨與成脂分化能力，說明分離篩選成功，詳見參考文獻[6]，本實驗材料與該文獻中所用BMSCs為同一批。添加LPS刺激BMSCs，MTT結果顯示不同濃度LPS均可以促進小鼠BMSCs的增殖，其中100 μg/L與1 mg/L有顯著作用，見圖1A；ELISA結果顯示10 μg/L、100 μg/L和1 mg/L LPS均可以促進IL-6的分泌，其中1 mg/L的效果最為明顯，見圖1B。因此后續(xù)的實驗均選取LPS濃度為1 mg/L。

2LPS對BMSCs中Notch信號通路相關蛋白的影響

Notch信號通路在干細胞分化與增殖中發(fā)揮重要作用，我們檢測了脂多糖對Notch信號通路受體、配體與靶基因表達的影響。qPCR結果顯示，BMSCs表達Notch信號的受體，包括Notch1～Notch4，其中Notch1和Notch3的相對表達量較高；然而，Notch信號受體的mRNA水平并沒有由于LPS的刺激而發(fā)生明顯變化，見圖2A。BMSCs也可檢測到Notch信號配體的表達，包括Jagged1、 Jagged2、Dll1、Dll3和Dll4，其中Jagged1的相對表達量較高；同樣，LPS并不影響Notch信號配體的mRNA水平，見圖2B。同時，我們利用Westerm blot檢測上述Notch信號受體與配體的蛋白表達，結果顯示，LPS并不影響Notch信號受體與配體的蛋白水平，見圖3A。另外，我們檢測了Notch信號靶基因Hes1與Hey1的表達，結果發(fā)現(xiàn)LPS顯著誘導Hes1與Hey1的蛋白表達(P<0.05)，見圖3B。

Figure 1. The effects of LPS on the cell viability (A) and secretion of IL-6 (B) in the BMSCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1脂多糖對BMSCs活力和IL-6分泌的促進作用

Figure 2. The mRNA expression levels of Notch receptors (A) and ligands (B) in the BMSCs treated with LPS. Mean±SD.n=4.

圖2Notch信號通路受體與配體的mRNA表達

Figure 3. The protein levels of Notch receptors, ligands and target genes in the BMSCs treated with LPS. A: Western blot assay of Notch receptors and ligands; B: Western blot assay of target genes. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖3Notch信號通路受體、配體與靶基因的蛋白水平

3Notch信號對LPS誘導的BMSCs增殖的影響

我們進一步利用Notch信號通路抑制劑DAPT處理BMSCs，檢測Notch信號通路對BMSCs活力的影響。MTT法結果顯示，LPS顯著提高BMSCs活力，而DAPT不僅降低對照組BMSCs活力，更顯著地抑制了LPS所誘導的BMSCs的活力，見圖4A。進一步通過活細胞計數(shù)的方法，我們確定在LPS處理組和不處理組，DAPT均可以降低BMSCs的增殖能力(P<0.05或P<0.01)，見圖4B。

Figure 4. The cell viability (A) and numbers (B) of BMSCs treated with DAPT in the presence or absence of LPS. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsDMSO group.

圖4DAPT對LPS刺激下的細胞增殖的影響

4Notch信號對LPS誘導的IL-6與CXCL1分泌的影響

為了進一步檢測Notch信號對炎癥的影響，利用LPS與Notch信號通路抑制劑DAPT共同刺激BMSCs。結果顯示，LPS顯著誘導IL-6與CXCL1的分泌，而DAPT可以顯著降低LPS所誘導的細胞培養(yǎng)上清中IL-6與CXCL1的濃度(P<0.01)，說明DAPT對LPS誘導的BMSC細胞炎癥因子的分泌有抑制作用，見圖5。

Figure 5. The secretion of IL-6 (A) and CXCL1 (B) in the BMSCs treated with DAPT in the presence or absence of LPS. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsDMSO group.

圖5DAPT對LPS誘導的IL-6與CXCL1分泌的影響

討 論

在脂多糖處理下，小鼠間充質干細胞增殖能力增強，并且細胞因子如IL-6分泌能力改變。大腸桿菌、盲腸穿孔與急性肺損傷誘導的膿毒癥模型中，給予人MSCs均可以提高小鼠存活率，降低IL-6和TNF-α水平，同時提高抗炎因子IL-10的水平[7-9]。本研究中，我們研究了Notch信號通路抑制劑DAPT對脂多糖誘導的間充質干細胞的作用。DAPT可以抑制LPS誘導的間充質干細胞的增殖和IL-6與CXCL1的分泌，這說明Notch信號通路對于LPS誘導的BMSCs性質的改變有調節(jié)作用。

Notch信號通路對正常MSCs的增殖均存在調節(jié)作用，本研究中通過DAPT抑制Notch信號通路，也可以明顯降低BMSCs的增殖能力。Notch信號通路對于細胞增殖的正向調節(jié)能力已見于多篇文獻中報導[10-11]。盡管LPS處理后間充質干細胞增殖的明顯上升并不一定與Notch信號通路相關，但通過抑制Notch信號通路可以改變LPS誘導的BMSCs相關性質的改變。這提示Notch信號通路可能是感染誘導干細胞變化的重要治療靶點。

脂多糖對MSCs的調節(jié)作用依賴于TLR4，并通過NF-κB信號通路和Wnt信號通路促進MSC的增殖和成骨分化[12]。本研究也進一步證實了LPS對BMSCs增殖和IL-6的促進作用，在此基礎上，本研究表明，Notch信號通路也可以參與LPS誘導的BMSC的增殖能力和IL-6與CXCL1分泌的變化。Li等[13]發(fā)現(xiàn)在再生障礙性貧血小鼠模型中MSCs通過Notch/RBP-J/FOXP3/ROR信號調節(jié)Treg/Th17的平衡。Notch信號通路可以上調NF-κB的活性[14]；Notch信號通路和Wnt信號也有協(xié)同作用[10, 15]。因此，Notch信號通路可能是通過與NF-κB和Wnt信號通路相互作用，共同調節(jié)LPS誘導間充質干細胞的性質。

總之，Notch信號通路抑制劑DAPT可以抑制LPS誘導的BMSCs增殖及IL-6和CXCL1的分泌。本項研究的結果為研究膿毒癥等疾病中間充質干細胞性質的變化提供了更多的信息，為間充質干細胞在這些疾病中的應用提供基礎。

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