盛曉生， 林 麗， 丁明星， 郭方明， 俞章平， 蔣李珍， 華 仙， 方遠(yuǎn)書(shū)

(1金華市人民醫(yī)院心內(nèi)科， 2金華市人民醫(yī)院麻醉科， 3金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 4金華市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 浙江 金華 321000)

心腎綜合征(cardiorenal syndrome，CRS)是指患者同時(shí)存在心功能不全和腎損害，且兩者之間存在復(fù)雜相互作用的臨床綜合征[1]。CRS包括不同的心臟和腎臟的病理生理障礙，任一器官的急、慢性功能障礙均可導(dǎo)致另一器官的急慢性功能障礙，兩者互為臨床發(fā)病危險(xiǎn)因素，相互加重導(dǎo)致心腎功能急劇惡化而增加死亡率，因而尋求早期特異和敏感的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)“心腎共損”，極為迫切[2]。和肽素(copeptin，CPP)是精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)原C末端的一部分，在體內(nèi)穩(wěn)定，便于檢測(cè)，已發(fā)現(xiàn)其在急性心肌梗死等心腦血管疾病的早期診斷及預(yù)后判斷方面有重要的臨床價(jià)值[3-4]，但與CRS發(fā)病及診療的相關(guān)研究較少，尤其缺乏動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)。因此，本項(xiàng)目應(yīng)用部分腎切除術(shù)(subtotal nephrectomy，SNX)合并心肌梗死(myocardial infarction，MI)的合并術(shù)式(SNX+MI)加重臟器損傷來(lái)建立CRS大鼠模型，觀察血漿及尿液中CPP濃度的動(dòng)態(tài)變化，并與腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)等指標(biāo)對(duì)比分析以評(píng)價(jià)CPP水平對(duì)CRS大鼠的預(yù)測(cè)價(jià)值，為尋找對(duì)CRS的診斷及預(yù)后的新標(biāo)志物提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

雄性SD大鼠60只，體重250～280 g，SPF級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002，合格證號(hào)為0278317。BP-300型大鼠應(yīng)用尾靜脈無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司。血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；肌酐測(cè)定試劑盒(寧波瑞源生物科技有限公司)；CPP和BNP ELISA試劑盒(USCN)。

2方法

2.1動(dòng)物造模及分組 60只實(shí)驗(yàn)大鼠在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)6 d后，采用隨機(jī)抓取方法(進(jìn)行數(shù)字編號(hào)，從每窩中隨機(jī)抓取2只放入1組)共分4組(每組15只)，包括空白對(duì)照(blank control，Con)組、腎衰組(SNX組)、心衰組(MI組)和心衰+腎衰組(CRS組)，按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法采用復(fù)合術(shù)式建模[5]?？瞻讓?duì)照組進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)，不做任何其余處理。SNX組用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，打開(kāi)腹腔，結(jié)扎左側(cè)腎臟腎動(dòng)脈、腎靜脈和輸尿管后，切除左側(cè)5/6腎臟，關(guān)閉腹腔，術(shù)后3 d肌注10萬(wàn)單位青霉素鈉抗感染。MI組用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后， 肢體Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測(cè)ECG；口鼻部戴自制呼吸面罩，連接呼吸機(jī)維持呼氣末正壓呼吸(呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為呼吸頻率55～60次/分，呼吸比為1∶2，潮氣量為20 mL/kg)；左側(cè) 3、4肋間開(kāi)胸器撐開(kāi)開(kāi)胸，暴露心臟， 左心耳下緣2～3 mm處進(jìn)針， 深度1.5～2 mm，寬度2～3 mm，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈主干；肉眼觀察左心室壁變白，ECG QRS波形變高變寬，S波與T波交點(diǎn)(J點(diǎn))明顯抬高，或者出現(xiàn)R波消失，呈典型QS波形時(shí)，提示結(jié)扎成功；術(shù)后3 d肌注10萬(wàn)單位青霉素鈉抗感染。CRS組切除左側(cè)5/6腎臟并結(jié)扎冠狀動(dòng)脈建模。所有的實(shí)驗(yàn)程序按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批準(zhǔn)協(xié)議進(jìn)行。

2.2心功能與血壓(blood pressure，BP)評(píng)估 各組大鼠于造模后9 d和第5周處死前，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，頸部正中縱行切開(kāi)2 cm切口，暴露右頸總動(dòng)脈，PE50導(dǎo)管插管至左心室，采用生物信號(hào)處理系統(tǒng)分析心功能參數(shù)[心率(heart rate，HR)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)等]的變化。各組大鼠應(yīng)用尾靜脈無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量BP的變化，每周1次，共5次。

2.3腎功能評(píng)價(jià) 建模成功后，通過(guò)大鼠眼眶取血，收集尿液，每周1次，共5次，進(jìn)行腎功能檢測(cè)。應(yīng)用BUN測(cè)試盒以生化法檢測(cè)血清中各組大鼠BUN的水平；應(yīng)用肌酐測(cè)定試劑盒以肌氨酸氧化酶法檢測(cè)各組大鼠血清及尿液中的肌酐水平。

2.4ELISA檢測(cè)CPP和BNP水平 建模成功后，眼眶取血及收集尿液，每周1次，共5次。分別采用CPP和BNP ELISA試劑盒按照試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)各組大鼠血清及尿液中CPP和BNP水平。

2.5心和腎的組織學(xué)觀察 分別于建模后第9天和第5周殺死大鼠，取心和腎組織進(jìn)行常規(guī)HE染色切片組織光鏡檢查，以確認(rèn)CRS大鼠心和腎組織病理形態(tài)的改變。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)；正態(tài)分布資料的相關(guān)分析采用Pearson直線相關(guān)，非正態(tài)分布資料的相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。應(yīng)用受試者工作特征 (receiver operating characteristic, ROC)曲線確定CPP、BNP及BUN對(duì)CRS的早期診斷價(jià)值。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1各組大鼠心功能和血壓的變化

血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Con組相比，SNX組大鼠的LVEDP在9 d時(shí)顯著升高(P<0.05)，MI組大鼠LVSP在9 d時(shí)顯著降低，LVEDP顯著升高(P<0.05)，CRS組大鼠LVSP在9 d時(shí)顯著降低，LVEDP顯著升高(P<0.05或P<0.01)。血壓檢測(cè)結(jié)果示，與Con組比，SNX組大鼠的收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)和平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)在1周時(shí)顯著降低(P<0.05)，MI組大鼠的SBP、DBP和MAP在3周時(shí)顯著降低(P<0.05)，而CRS組大鼠的SBP、DBP和MAP在各時(shí)點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表1。

2各組大鼠腎功能的變化

與Con組比，SNX組在造模后3周BUN顯著升高(P<0.05)， CRS組在造模后1和3周BUN顯著升高(P<0.05)；與Con組相比，SNX組大鼠的血清肌酐(serum creatinine，SCr)在造模3周顯著升高(P<0.05)，尿肌酐(urinary creatinine，UCr)在1周、3周時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)，MI組大鼠的UCr在1周時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P<0.05)，CRS組大鼠的UCr在1周、3周時(shí)間點(diǎn)均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)和血壓的變化

*P<0.05，**P<0.01vsCon group.

表2 各組大鼠第1、3周腎功能的變化

*P<0.05，**P<0.01vsCon group.

3CPP與BNP水平的變化及其與其它指標(biāo)的關(guān)系

與Con組相比，SNX組在造模3和5周血清和尿液中CPP均顯著升高(P<0.05)；MI組在造模后3周血清中CPP顯著升高(P<0.05)；CRS組在造模后1、3和5周血清中CPP顯著升高(P<0.05)，造模后3周尿液中CPP顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表3。同時(shí)，與Con組相比，SNX組在造模后1和3周血清中BNP顯著升高(P<0.05)，造模后5周尿液中BNP顯著升高(P<0.05)；MI組在造模后1、3和5周尿液中BNP顯著升高(P<0.05)；CRS組在造模后1和3周血清中BNP顯著升高(P<0.05)，造模后5周尿液中BNP顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

相關(guān)分析顯示，CRS組在造模后1周血清中CPP與BNP和BUN無(wú)相關(guān)性(r分別為0.109和0.683，P>0.05)，尿液中CPP與BNP和BUN亦無(wú)相關(guān)性(r分別為-0.342和0.293，P>0.05)。

表3 各組大鼠CPP水平的變化

*P<0.05vsCon group.

表4 各組大鼠BNP水平的變化

*P<0.05vsCon group.

4CPP與BNP水平對(duì)CRS的早期診斷價(jià)值

選取各模型組血清CPP(sCPP)及尿液 CPP(uCPP)與BNP在造模后1周和3周的檢測(cè)結(jié)果為檢驗(yàn)變量，以組別為狀態(tài)變量，定義SNX組和MI組為組別0、CRS組為組別1，進(jìn)行ROC曲線分析。結(jié)果顯示，上述各指標(biāo)檢測(cè)診斷CRS時(shí)，sCPP在1周時(shí)的曲線下面積(area under the curve，AUC)為 0.908(95% CI為0.789～1.028)，以56.59 ng/L為閾值，其診斷敏感性為87.5%，特異性為80.0%。而sCPP在3周及 uCPP 與BNP在1和3周的檢測(cè)結(jié)果顯示，在相應(yīng)的閾值下的AUC及其診斷敏感性與特異性均低，無(wú)診斷價(jià)值，見(jiàn)圖1、表5。

Figure 1. ROC curves of serum CPP (sCPP), urinary CPP (uCPP) and BNP in the diagnosis of CRS. A: at 1 week, the areas under the curve (AUC) of sCPP, uCPP and BNP were 0.908， 0.475 and 0.617， respectively. B: at 3 weeks, the AUC of sCPP, uCPP and BNP were 0.489, 0.422 and 0.489， respectively.

圖1血清CPP及尿液CPP與BNP診斷CRS的ROC曲線

表5 血清及尿液CPP與BNP診斷CRS的ROC曲線分析

5各組大鼠心和腎的組織病理學(xué)改變

心臟組織 HE 染色顯示，CK組未見(jiàn)明顯的病理改變，SNX組、MI組和CRS組均見(jiàn)心肌組織紊亂，少數(shù)心肌變性、溶解及斷裂，毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張，以CRS組最為明顯，見(jiàn)圖2A。腎臟 HE 染色顯示，CK組無(wú)明顯病理改變，SNX組和MI組可見(jiàn)輕度損傷，CRS組最為嚴(yán)重，見(jiàn)圖2B。

Figure 2. Pathological changes of the cardiac (A) and renal (B) tissues in each group at 5 weeks (HE staining， ×200).

圖2各組大鼠第5周時(shí)心和腎的組織病理學(xué)改變

討 論

本研究證實(shí)，SNX+MI的合并術(shù)式加重臟器損傷，可用于建立CRS大鼠模型。該模型能體現(xiàn)心腎的雙向互動(dòng)作用，可以用來(lái)評(píng)估CRS的診療效應(yīng)。通過(guò)造模后1～5周動(dòng)態(tài)觀察血清及尿液中CPP濃度的變化，證實(shí)檢測(cè)CRS大鼠血清CPP水平有助于早期發(fā)現(xiàn)心腎并損程度，從而起到預(yù)警作用。CPP可以作為CRS早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，具有較高的敏感性和特異性。

近來(lái)隨著CRS概念的提出，心腎疾病之間的關(guān)系已被廣泛關(guān)注，臨床上進(jìn)一步的研究迫切需要穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。CRS的大鼠模型最早始于2004年，采用心肌梗死術(shù)合并單側(cè)腎切除術(shù)，但該模型未觀察出心功能伴隨腎功能減退的進(jìn)行性損傷[6]。而本文采用的SNX+MI方法由Entin-Meer等[7]在CRS模型研究中創(chuàng)建，通過(guò)部分腎切除術(shù)合并心肌梗死術(shù)造模顯示出其優(yōu)勢(shì)，能體現(xiàn)心腎的雙向互動(dòng)作用。本項(xiàng)目中，我們采用大鼠造模后1～5周血液動(dòng)力學(xué)、血壓及腎功能指標(biāo)的動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)造模后1周即出現(xiàn)心腎功能的減退，提示大鼠在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)心腎功能的共損和互損，因而該模型能高度模擬臨床CRS的病變特點(diǎn)，可為CRS 的病理生理機(jī)制與藥物研究提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法。部分腎切除術(shù)后腎功能已有損傷的大鼠，其心肌更容易缺血損傷，尿毒癥大鼠的心肌梗死面積明顯增加，這與臨床上腎臟疾病患者并發(fā)心梗死亡率更高的特點(diǎn)一致。由于部分腎切除，腎分泌的紅細(xì)胞生成素減少，血氧容量下降，心臟射血加劇，心臟及各組織器官回血量增加，血管收縮，加重心肌肥厚，并引發(fā)血壓升高，內(nèi)皮損傷導(dǎo)致冠脈營(yíng)養(yǎng)功能下降，加重心肌缺血。同時(shí)，心臟功能障礙反過(guò)來(lái)會(huì)加速腎臟固有損傷[8]。

CRS的發(fā)生會(huì)伴有不同的生物學(xué)標(biāo)志物的相應(yīng)改變，對(duì)其早期診斷、危險(xiǎn)評(píng)估、判斷預(yù)后有重要意義。因容量負(fù)荷及鈉潴留，心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)、AVP)原和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的不適當(dāng)激活，CRS導(dǎo)致機(jī)體水代謝紊亂更為突出。其中AVP系統(tǒng)可能是除RAS和交感神經(jīng)系統(tǒng)以外，另一個(gè)與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)或心力衰竭預(yù)后不良密切相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)[9]。CPP檢測(cè)方便易行，結(jié)果穩(wěn)定，可在各級(jí)醫(yī)院開(kāi)展，可取代對(duì)AVP的直接測(cè)量。本項(xiàng)目在造模后1～5周動(dòng)態(tài)檢測(cè)血清和尿液中CPP濃度的變化，發(fā)現(xiàn)CRS組在造模后1 周和3周血清和尿液中CPP顯著升高，造模后5周僅血清中升高，ROC曲線分析顯示造模后1周血清CPP預(yù)測(cè)CRS具有較高的特異性(87.5%)和敏感性(80%)，提示CPP在心腎損傷早期有變化，晚期趨于平穩(wěn)，有望為CRS早期診斷提供一種新的較好的生物標(biāo)志物，具有廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)際上，新近CPP已被證明在多種臨床疾病預(yù)測(cè)的價(jià)值，主要包括心血管疾病，如心臟衰竭、心肌梗死等[4, 10-11]。而腎臟疾病的相關(guān)報(bào)道甚少，僅見(jiàn)Kim等[12]證實(shí)CPP可以作為血液透析患者左心室功能障礙診斷的有用指標(biāo)，ROC分析顯示，AUC為0.737，臨界值為125.48 ng/L，敏感性和特異性分別為0.7和0.8；但也有相反的結(jié)論，認(rèn)為CPP對(duì)慢性腎臟病患者血管外科圍手術(shù)期心血管并發(fā)事件的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)潛力不足[13]，或者新生兒與圍產(chǎn)期窒息動(dòng)物模型中，CPP不能作為診斷急性腎損傷的特異標(biāo)志物[14]。本文進(jìn)一步的相關(guān)分析顯示，血清與尿液中的CPP與BNP和BUN均不具備相關(guān)性，可能與CRS的復(fù)雜病理生理機(jī)制有關(guān)，BNP在臨床上公認(rèn)是心力衰竭臨床診斷性標(biāo)志，盡管有報(bào)道認(rèn)為在CRS的早期診斷中有一定的應(yīng)用價(jià)值[2, 15]，但在CRS患者體內(nèi)是否會(huì)因?yàn)樾乃セ蚰I小球?yàn)V過(guò)率下降而在體內(nèi)蓄積引起，以及對(duì)腎功能不全的診斷價(jià)值等方面，有待進(jìn)一步研究[16]。

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