宋志明， 余舒杰， 楊建濤， 劉定輝， 寇 威， 鞏貴宏， 錢(qián)孝賢, 6△

(1河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 河南 開(kāi)封 475001； 2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科， 廣東 廣州 510630； 3河南大學(xué)衰老與疾病研究所， 河南 開(kāi)封 475001； 4洛寧縣人民醫(yī)院心內(nèi)科， 河南 洛陽(yáng) 471700； 5河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 河南 開(kāi)封 475001； 6中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所， 廣東 廣州 510630)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)是全世界致殘致死率最主要的一種疾病。最新發(fā)布的《中國(guó)心血管病報(bào)告2016》顯示，心血管病仍是我國(guó)城鄉(xiāng)居民死亡原因的首位因素，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腫瘤等其它疾病[1]。而血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的障礙是冠心病發(fā)生的始動(dòng)因素，更是其發(fā)展的主要促動(dòng)因素[2]。糖尿病患者合并冠心病以及冠脈血管病變嚴(yán)重程度往往比其他人群更加明顯，這些已經(jīng)得到大多數(shù)臨床研究證實(shí)；同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)與增齡相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老促進(jìn)了血管事件，而高血糖環(huán)境明顯加速內(nèi)皮細(xì)胞的衰老[3]。因此，預(yù)防高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老有望成為治療糖尿病相關(guān)性動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)新靶點(diǎn)。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化碳(carbon monoxide，CO)和一氧化氮(nitric oxide，NO)后在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)氣體信號(hào)分子，新近的大量研究也已證實(shí)了它在維持心血管系統(tǒng)功能中發(fā)揮了重要作用[4]。H2S的含量在糖尿病患者以及糖尿病大鼠血液中顯著降低，而血管內(nèi)皮功能受損后，給予外源性硫化氫，內(nèi)皮功能有所恢復(fù)[5]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，Sirt1)與生物體的壽命具有密切的關(guān)系，被稱(chēng)為長(zhǎng)壽基因。沉默Sirt1基因可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老形態(tài)的出現(xiàn)，而過(guò)表達(dá)Sirt1或者增強(qiáng)它的活性可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性、增加NO產(chǎn)量而發(fā)揮抗衰老的作用。本研究擬進(jìn)一步探討Sirt1/eNOS信號(hào)通路在硫化氫抗高糖(high glucose，HG)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

葡萄糖、甘露糖醇(mannitol，M)、MTT、硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)和DMSO購(gòu)自Sigma-Aldrich；Ⅰ型膠原酶購(gòu)自Invitrogen；無(wú)血清培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(endothelial cell growth factor，ECGF)購(gòu)自BD；Sirt1干擾序列及相應(yīng)陰性序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成；Lipofectamine?RNAiMAX和Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基購(gòu)自于Life Technologies；預(yù)染蛋白條帶標(biāo)志購(gòu)自Fermentas；抗Sirt1抗體和抗eNOS抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗纖溶酶原激活物抑制劑1(plosminogen activator inhibitor 1，PAI-1)抗體購(gòu)自Santa Cruz；抗GAPDH抗體購(gòu)自Proteintech；Ⅱ抗購(gòu)自武漢博士德； NO測(cè)試盒購(gòu)自南京建成；細(xì)胞裂解液和蛋白定量試劑盒(BCA法)購(gòu)自南京凱基。

2方法

2.1細(xì)胞分離培養(yǎng) 原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)分離培養(yǎng)詳見(jiàn)既往文獻(xiàn)報(bào)道[6]，大致過(guò)程如下：用0.1% Ⅰ型膠原酶消化健康無(wú)菌新生兒臍帶15 min，收集膠原酶細(xì)胞混合液，1 200 r/min 離心5 min，棄上清，加完全培養(yǎng)基(20% FBS、20% SFM 和 60 mg/L ECGF)混勻種于培養(yǎng)瓶里培養(yǎng)。本研究中所用細(xì)胞若無(wú)特殊交代均為1～3代。

2.2內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型的建立 內(nèi)皮細(xì)胞在6孔板內(nèi)生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，加入33 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)48 h[6]。通過(guò)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色、PAI-1表達(dá)以及細(xì)胞活性鑒定模型是否成功。SA-β-Gal染色參照既往方法進(jìn)行[7]；PAI-1蛋白表達(dá)檢測(cè)方法參見(jiàn)Western blot部分；細(xì)胞活力檢測(cè)參見(jiàn)細(xì)胞活力測(cè)定部分。

2.3細(xì)胞活力的測(cè)定 選取第2代細(xì)胞接種于96孔板中，每孔種植約4×103個(gè)細(xì)胞，24 h后給予相應(yīng)處理，每個(gè)處理因素設(shè)5個(gè)復(fù)孔。處理后培養(yǎng)24 h，加入MTT培養(yǎng)4 h；每孔加入150 μL 的DMSO，避光遮蓋后放于搖床上15 min充分搖勻，利用酶標(biāo)儀讀取490 nm處各孔的吸光度(A)。

2.4RNA干擾Sirt1 siRNA序列：正義鏈為5’-GGUCAAGGGAUGGUAUUUATT-3’，反義鏈為5’-UAAAUACCAUCCCUUGACCTT-3’；陰性對(duì)照(negative control，NC)序列：正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。 RNA干擾參照既往方法進(jìn)行[7]，并根據(jù)情況作出適當(dāng)調(diào)整。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 吸去培養(yǎng)基收集細(xì)胞，用1×PBS沖洗2～3遍，加50～60 μL 細(xì)胞裂解液，低溫孵育10 min，刮下細(xì)胞，將細(xì)胞裂解物吸至1.5 mL離心管中，4 ℃、13 200 r/min離心15 min；吸取上清，分裝保存以備后用。按照南京凱基BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到NC膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)抗體，4 ℃搖床過(guò)夜孵育；棄去Ⅰ抗，1×TBST洗3次，每次5 min，加入小鼠或兔Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后ECL顯影，最后用Quantity One 軟件掃描并分析。

2.6NO含量測(cè)定 采用試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO含量，操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過(guò)SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1衰老模型的建立

內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，加入33 mmol/L的葡萄糖(HG組)或甘露糖醇(M組，即高滲組)，培養(yǎng)48 h。HG組細(xì)胞數(shù)量偏少，PAI-1蛋白表達(dá)增加，SA-β-Gal+細(xì)胞比例增加，與正常對(duì)照(control，Con)組(5 mmol/L 葡萄糖處理)及高滲組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而高滲組與正常組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖1A、B。與正常對(duì)照組及高滲對(duì)照組相比，高糖組的細(xì)胞活力明顯減低(P<0.05)，見(jiàn)圖1C。

Figure 1. The effects of high glucose (HG) on cell senescence and viability. A: Western blot for determining the protein le-vel of PAI-1; B: the proportion of SA-β-Gal positive cells was calculated from 400 cells per group; C: the cell viability detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHG group.

圖1高糖對(duì)細(xì)胞衰老及細(xì)胞活力的影響

2NaHS減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老

依據(jù)我們既往研究結(jié)果，本次研究中NaHS濃度仍為100 μmol/L[6]。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)給予100 μmol/L 的NaHS，共同孵育6 h后，相應(yīng)加入葡萄糖或甘露糖醇后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。通過(guò)對(duì)PAI-1蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與單純高糖組比較，NaHS(100 μmol/L)能顯著減少PAI-1蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖2A。SA-β-Gal染色結(jié)果也證實(shí)了100 μmol/L NaHS能明顯減少SA-β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，見(jiàn)圖2B。同時(shí)，細(xì)胞活力檢測(cè)顯示NaHS預(yù)處理后能提高細(xì)胞活力，見(jiàn)圖2C。

3NaHS對(duì)Sirt1和eNOS蛋白表達(dá)的影響

既往研究證實(shí)Sirt1和eNOS的表達(dá)及活性與內(nèi)皮細(xì)胞衰老存在密切的聯(lián)系[8]。為進(jìn)一步探索NaHS抗衰老的機(jī)制，我們對(duì)Sirt1及eNOS的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的衰老內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Sirt1蛋白表達(dá)水平下降，eNOS呈現(xiàn)出同樣的現(xiàn)象，而經(jīng)過(guò)NaHS預(yù)處理能夠部分逆轉(zhuǎn)Sirt1和eNOS蛋白的表達(dá)的減低，見(jiàn)圖3。

4NaHS對(duì)NO含量的影響

eNOS表達(dá)減少，直接影響到NO的產(chǎn)生。與正常對(duì)照組相比，衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中NO的含量明顯減低(P<0.01)，而NaHS預(yù)處理則部分逆轉(zhuǎn)了NO含量的減少(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 2. The effect of NaHS on high glucose (HG)-induced senescence in HUVECs. A: Western blot for determining the protein le-vel of PAI-1; B: the proportion of SA-β-Gal positive cells was calculated from 400 cells per group; C: the cell viability detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHG group.

圖2NaHS對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響

Figure 3. The effect of NaHS on the protein expression of Sirt1 and eNOS in senescent HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHG group.

圖3NaHS對(duì)衰老細(xì)胞內(nèi)Sirt1和eNOS蛋白表達(dá)的影響

5Sirt1siRNA對(duì)eNOS蛋白表達(dá)的影響

內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至40%～60%，進(jìn)行Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染6 h，然后換液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取蛋白檢測(cè)Sirt1及eNOS。與轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(mock組)相比，陰性序列對(duì)照組(NC組)Sirt1和eNOS表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。而與NC組比較，Sirt1 siRNA組Sirt1蛋白表達(dá)明顯減低，同時(shí)eNOS表達(dá)也顯著減少，見(jiàn)圖5。

Figure 4. The effect of NaHS on NO concentration in senescent HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsHG group.

圖4NaHS對(duì)衰老細(xì)胞內(nèi)NO濃度的影響

Figure 5. The effect ofSirt1 siRNA on eNOS expression in the HUVECs determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsNC group.

圖5抑制Sirt1表達(dá)對(duì)eNOS蛋白表達(dá)的影響

6Sirt1siRNA顯著抵消NaHS改善內(nèi)皮細(xì)胞衰老作用

從以上結(jié)果提示NaHS可能通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt1/eNOS信號(hào)通路而改善內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。為了驗(yàn)證這個(gè)問(wèn)題，我們?cè)赟irt1基因沉默的基礎(chǔ)上對(duì)HUVECs進(jìn)行NaHS預(yù)處理，然后建立高糖誘導(dǎo)的衰老模型，通過(guò)衰老指標(biāo)的檢測(cè)研究Sirt1在硫化氫抗衰老中的作用。結(jié)果提示HG+NaHS+siRNA組eNOS蛋白表達(dá)較HG組及HG+NaHS組都明顯減低，且PAI-1表達(dá)及SA-β-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞比例與HG+NaHS組比較顯著升高，NO含量明顯降低(P<0.05)，但與HG組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖6。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明轉(zhuǎn)染Sirt1 siRNA后的衰老HUVECs不再受到NaHS的保護(hù)。

Figure 6. The effects ofSirt1 siRNA and NaHS on high glucose (HG)-induced protein expression of eNOS and PAI-1 (A), production of NO (B), and SA-β-Gal+cells (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group；#P<0.05vsHG group；△P<0.05vsHG+NaHS group.

圖6抑制Sirt1表達(dá)和NaHS處理對(duì)eNOS蛋白表達(dá)及細(xì)胞衰老的影響

討 論

綜合以上研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)33 mmol/L的葡萄糖能成功誘導(dǎo)原代HUVECs衰老，而100 μmol/L NaHS通過(guò)調(diào)控Sirt1/eNOS/NO信號(hào)通路很大程度上延緩高糖誘導(dǎo)的衰老。

細(xì)胞衰老分為復(fù)制性衰老和早熟型衰老；氧化性低密度脂蛋白、過(guò)氧化氫和高糖等很多刺激因子均被報(bào)道用于誘導(dǎo)細(xì)胞衰老模型[3, 7]。大量研究已證實(shí)，無(wú)論1型糖尿病還是2型糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病心臟病等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中均起到了重要作用；反過(guò)來(lái)，長(zhǎng)期的高血糖環(huán)境促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷[5,8]。因此，利用高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老可以體外模擬糖尿病患者內(nèi)皮損傷，探討相應(yīng)機(jī)制，并尋求防治手段，對(duì)于研究糖尿病疾病狀態(tài)下細(xì)胞功能具有重要的生理病理意義。

Sirt1是一種去乙?；?，因?yàn)樵谡{(diào)節(jié)生物體壽命中起到重要作用，其基因又被稱(chēng)為長(zhǎng)壽基因。隨著年齡的增加，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Sirt1的mRNA表達(dá)逐漸下降[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中的表達(dá)也是減少的，而且斑塊處的血管細(xì)胞呈現(xiàn)出衰老表型[10]。在高糖刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中，Sirt1的表達(dá)明顯下降[11]。阻斷Sirt1的表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的發(fā)生，而過(guò)度表達(dá)Sirt1則可以抑制細(xì)胞衰老[12]。關(guān)于Sirt1調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的理論，除了其抗炎和抗氧化作用之外，主要是通過(guò)Sirt1/eNOS/NO軸發(fā)揮作用。一方面，Sirt1通過(guò)調(diào)節(jié)eNOS基因的啟動(dòng)子而影響eNOS蛋白的表達(dá)[13]；另一方面，Sirt1通過(guò)去乙?；饔谜{(diào)控eNOS的活性，從而促進(jìn)NO的生成[14]。

眾所周知，NO是一個(gè)廣泛存在于心血管系統(tǒng)內(nèi)的氣體信號(hào)分子，它在調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能及衰老方面具有重要作用。在衰老細(xì)胞中，eNOS的活性降低，NO合成減少，而給予外源性的NO或者提高eNOS的活性均可以減緩和減少內(nèi)皮細(xì)胞的衰老[15]。

H2S是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，它在人體心血管及神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的保護(hù)作用。然而糖尿病患者血漿中的H2S含量明顯低于正常人[4]。在糖尿病動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，給予外源性H2S能夠減輕糖尿病機(jī)體的損傷[16-17]。同時(shí)，我們既往研究證實(shí)外源性H2S可以通過(guò)抑制NF-κB p65 的活性而延緩高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老[6]。本研究證實(shí)了H2S可以上調(diào)Sirt1的表達(dá)，促進(jìn)eNOS蛋白的合成，增加NO含量從而在一定程度上改善了高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老。若對(duì)Sirt1進(jìn)行RNA干擾，則eNOS表達(dá)下降，同時(shí)硫化氫不能發(fā)揮抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用，這些數(shù)據(jù)顯示了Sirt1與eNOS在硫化氫抗細(xì)胞衰老中具有重要地位。

本研究結(jié)果提示，H2S能通過(guò)調(diào)控Sirt1/eNOS/NO信號(hào)通路，部分抵抗高糖誘導(dǎo)的HUVECs衰老。本研究進(jìn)一步拓展了我們對(duì)于H2S抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的認(rèn)識(shí)，同時(shí)對(duì)于其延緩高血糖所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制仍需更多的體外研究和臨床試驗(yàn)去論證，最終用于指導(dǎo)糖尿病性內(nèi)皮功能損傷的防治，造福廣大患者。

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