李蘇霞， 何釬鋮， 陳素秀

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科， 浙江 溫州 325000)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率及死亡率；其中非小細胞肺癌是主要的類型，早期診斷并給予有效的治療對提高患者生存率具有重要的臨床意義[1]。隨著生物信息學(xué)及基因測序技術(shù)的快速發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)基因的異常表達是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一；針對這些異常基因的靶向治療可能為肺癌的個體化診療提供新的思路和方向[1-3]。作為臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究，探討肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因，對于尋找有效的診療靶點具有重要的意義。

3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)是一個大小為67 kD 的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于AGC家族上游的主要調(diào)控因子之一，對細胞的生長、分化及凋亡等病理生理過程具有重要的調(diào)節(jié)作用[4-5]。研究顯示在包括乳腺癌、非小細胞肺癌和胰腺癌等惡性腫瘤中，PDK1均呈現(xiàn)高表達，推測其可能作為一種原癌基因參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]。Lian等[9]的研究顯示， PDK1可通過上調(diào)JunB促進膽囊癌細胞的增殖、侵襲及遷移；Hsu等[10]的研究顯示，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)誘導(dǎo)的PDK1可通過上調(diào)纖維連接蛋白促進頭頸鱗癌的轉(zhuǎn)移。但尚未有研究直接以PDK1作為靶點，研究其對肺癌細胞生物學(xué)特性的具體作用及相關(guān)機制。本研究利用RNA干擾技術(shù)敲減人非小細胞肺癌細胞株A549中PDK1的表達，探討PDK1基因?qū)549細胞的活力、周期及凋亡等生物學(xué)特性的影響和潛在的作用機制。

材 料 和 方 法

1材料與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；肺正常上皮細胞BEAS-2B和肺癌細胞(H460、SPCA1和A549)均購自中國科學(xué)院上海細胞庫；抗PDK1、叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1, FoxO1)、p-FoxO1(S256)、p-FoxO1(T24)及p-Akt/Akt單克隆抗體購自CST；抗cyclin D1、CDK4、p-Rb/Rb、P27、Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3及β-actin抗體購自Abcam；CCK-8細胞活力分析試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Akt激動劑胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1， IGF-1)購自大連寶生物公司；細胞周期及凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；Nc-細胞核/漿蛋白抽提試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；PDK1小干擾RNA(PDK1 small interfering RNA，si-PDK1)及其陰性對照(negative，Neg)序列由Genescript公司設(shè)計并合成；相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑和SYBR Green I Real-Time PCR Kit購自Invitrogen；其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 實驗用肺癌細胞株及肺正常上皮細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中(含10% FBS和100 mg/L青霉素及鏈霉素),置于37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱。每2 d換液，3～5 d傳代。siRNA轉(zhuǎn)染：將對數(shù)生長期的細胞接種至6孔板，待細胞生長到80%融合，同步化12 h后進行轉(zhuǎn)染。將siRNA和 Lipofectamine 2000分別溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min后輕柔混勻，靜置反應(yīng)20 min而后將混合物加入相應(yīng)組別的細胞中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為完全細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。組別設(shè)置為空白對照(control)組、Neg組和si-PDK1組。提取細胞總RNA及蛋白測定轉(zhuǎn)染效率并進行后續(xù)實驗分析。

2.2CCK-8法測定細胞活力 取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中(每孔2×103)，各組細胞經(jīng)相應(yīng)處理后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h，向每孔加入10 μL 的CCK-8試劑，放回細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，并計算細胞活力。每組設(shè)置3個復(fù)孔取平均值，同時另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基作空白對照。

2.3流式細胞術(shù)檢測細胞周期 依據(jù)說明書要求進行操作，用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，加PBS漂洗3次后離心收集細胞，而后用70%乙醇避光固定過夜(4 ℃)。次日，1 000×g離心洗去乙醇，并避光加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液，37 ℃孵育30 min，用流式細胞儀檢測Ex=488 nm處的熒光強度，并分析在細胞周期各期中細胞所占的百分比。

2.4Annexin V/PI 雙染色法檢測細胞凋亡 依據(jù)說明書要求進行操作，用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，加PBS漂洗3次后離心收集細胞，而后加Binding Buffer重懸細胞。先后加入Annexin V-FITC(避光孵育10 min)和PI染液(避光孵育5 min)。用流式細胞儀檢測Ex=488 nm和Em=530 nm處的熒光強度，并分析細胞早期及中晚期凋亡率。

2.5Real-time PCR 依據(jù)Trizol一步法說明書的要求提取各組細胞中的總RNA。所提RNA經(jīng)純化及定量后，取2 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用SYBR Green實時熒光PCR的方法檢測PDK1的mRNA表達。PCR反應(yīng)條件為 95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，40個循環(huán)；以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。PDK1的上游引物序列為5’-AAGATGAGTGACCGAGGAGGT-3’，下游引物序列為5’-CCATAACCAAAACCAGCCAGAG-3’；β-actin的上游引物序列為5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’，下游引物序列為5’-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3’。

2.6Western blot測定蛋白表達水平 用含cocktail的RIPA裂解液提取各組細胞蛋白(核蛋白和胞漿蛋白的提取依據(jù)試劑盒說明進行)，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒進行定量分析后調(diào)整各組蛋白上樣總量至80 μg，加入4倍體積的Loading Buffer，而后沸水煮5 min。上樣并進行SDS-PAGE。待藍色的Loading Buffer泳出分離膠后將蛋白經(jīng)200 mA恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加5%脫脂牛奶室溫封閉90 min。依據(jù)說明書要求加入相應(yīng)比例的 I 抗，4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后去掉 I 抗孵育液并用TBST洗滌3次，每次5 min；而后加入對應(yīng)的 II 抗室溫孵育120 min，TBST洗滌3次，每次10 min，暗室中經(jīng)ECL發(fā)光液顯影后定影并沖洗膠片。所得結(jié)果錄入電腦后，用ImageJ行蛋白半定量灰度分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)均錄入SPSS 15.0統(tǒng)計軟件中進行分析。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組計量資料的組間差異采用t檢驗，多組計量資料行單因素方差分析，同時采用Bonferroni校正的t檢驗進行均數(shù)組間的兩兩比較，計數(shù)資料的比較采用2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1PDK1的表達及干擾效率檢測

首先采用real-time PCR和Western blot檢測肺正常上皮細胞BEAS-2B及幾種肺癌細胞(H460、SPCA1和A549)中PDK1的表達情況。結(jié)果顯示，相較于肺正常細胞BEAS-2B，肺癌細胞中PDK1表達均明顯增加，且A549中PDK1的表達最高(P<0.05)，故而后續(xù)實驗選用A549細胞進行，見圖1A、B。

將si-PDK1轉(zhuǎn)染至A549細胞中，分別采用real-time PCR和Western blot檢測干擾效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了si-PDK1之后，A549細胞PDK1的mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，效果較好，可繼續(xù)用于后續(xù)實驗分析，見圖1C、D。

Figure 1. The expression of PDK1 in lung cancer cells. A: the mRNA expression of PDK1 in the normal lung epithelial cell line BEAS-2B and lung cancer cell lines; B: the protein expression of PDK1 in normal lung epithelial cell line BEAS-2B and lung cancer cell lines; C: the mRNA expression of PDK1 in A549 cells after transfection with si-PDK1; D: the protein expression of PDK1 in A549 cells after transfection with si-PDK1. Mean±SD.n=6.△P<0.05vsBEAS-2B group;*P<0.05vscontrol group.

圖1正常肺上皮細胞BEAS-2B和肺癌細胞的PDK1表達水平及轉(zhuǎn)染si-PDK1的影響

2干擾PDK1抑制細胞活力并影響細胞周期分布

用CCK-8實驗檢測敲低PDK1表達對A549細胞活力的影響，結(jié)果顯示，si-PDK1組的細胞活力明顯低于對照組(P<0.05)，見圖2A。

進一步采用流式細胞術(shù)檢測細胞的周期分布，結(jié)果顯示，與對照組相比，si-PDK1組處于G0/G1期的細胞所占百分比增加(P<0.05)，S期細胞所占百分比減少(P<0.05)，說明干擾PDK1表達可抑制A549細胞的細胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，見圖2B。

3干擾PDK1促進細胞凋亡

用流式細胞術(shù)Annexin V/PI雙染法檢測A549細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，si-PDK1組的早期凋亡率增加(P<0.05)，表明干擾PDK1表達可明顯促進肺癌細胞A549的凋亡，見圖3。

Figure 2. The effect ofPDK1 knockdown on on the viability and cell cycle distribution of A549 cells. A: the cell viability measured by CCK-8 assay; B: the cell cycle distribution measured by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2干擾PDK1對A549細胞活力和細胞周期分布的影響

Figure 3. The effect ofPDK1 knockdown on the apoptosis of A549 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3干擾PDK1對A549細胞凋亡的影響

4細胞周期及凋亡相關(guān)調(diào)控因子的蛋白表達水平

采用Western blot檢測干擾PDK1表達對A549細胞的周期及凋亡相關(guān)調(diào)控因子表達的影響，結(jié)果顯示，干擾PDK1后，與對照組相比，A549細胞中cyclin D1、CDK4、p-Rb及Bcl-2的蛋白水平顯著下降(P<0.05), P27及cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The effect ofPDK1 knockdown on the protein levels of cell cycle- and apoptosis-related molecules in the A549 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖4干擾PDK1對A549細胞周期及凋亡相關(guān)因子蛋白水平的影響

5干擾PDK1對Akt/FoxO1信號通路活性的影響

進一步采用Western blot檢測干擾PDK1表達對A549細胞Akt/FoxO1信號通路活性的影響，結(jié)果示，干擾PDK1后，A549細胞胞漿中p-FoxO1(S256)和p-FoxO1(T24)的含量及p-Akt/Akt的水平顯著降低，而細胞核內(nèi)FoxO1的含量顯著增加(P<0.05)；而預(yù)先給予Akt激動劑IGF-1可部分逆轉(zhuǎn)PDK1的表達及對Akt/FoxO1信號通路的抑制，并增加A549細胞的活力，見圖5。

討 論

隨著人們對肺癌的認識逐漸加深，以某一基因為靶點開展的診療成為肺癌個性化治療的新方向，研究提示，PDK1可能發(fā)揮抑癌基因的作用，但其是否可作為肺癌診療的直接靶點還須大量的研究驗證。眾所周知，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞的惡性增殖和凋亡抵抗密不可分；而PDK1作為細胞內(nèi)重要的激酶對細胞增殖及凋亡具有顯著的調(diào)控作用[9, 11]。本實驗的檢測結(jié)果顯示，PDK1在肺癌細胞中高表達，且A549細胞中PDK1的表達水平最高，然后我們通過外源性干擾人肺癌細胞系A(chǔ)549中的PDK1表達，探討PDK1對肺癌細胞的活力及凋亡等生物學(xué)特性的影響。CCK-8實驗和流式細胞術(shù)細胞周期檢測顯示，干擾PDK1后，A549細胞的活力顯著降低，并呈現(xiàn)G1/S細胞周期阻滯；同時細胞凋亡檢測顯示，A549細胞的早期凋亡率明顯增加。這一結(jié)果提示在肺癌中，PDK1可能是通過調(diào)控腫瘤細胞的活力及凋亡促進腫瘤的發(fā)展。

關(guān)于PDK1調(diào)控腫瘤細胞增殖及凋亡的潛在機制，先前報道的實驗結(jié)果觀察到干擾PDK1后，A549細胞周期出現(xiàn)G1/S阻滯，而細胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換受到一系列周期相關(guān)因子的調(diào)控。其中細胞周期素(cyclins)可與細胞周期素依賴蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)結(jié)合形成復(fù)合物，而CDK抑制劑(CDK inhibitor, CDKI)如P21和P27等則可抑制CDK的激活； Rb具有閘門的作用，其磷酸化可促使細胞越過G1/S調(diào)控點進入S期[12-14]。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)干擾PDK1后，A549細胞中cyclin D1、CDK4和p-Rb的蛋白水平顯著降低，而P27的蛋白表達水平顯著升高。細胞凋亡是一個涉及多個因素及多條通路的復(fù)雜病理生理過程，其中Bcl-2是最具代表性的凋亡抑制因子，caspase-3則是重要凋亡效應(yīng)蛋白，也是多條凋亡信號的共同通路[15-16]。Western blot檢測結(jié)果顯示，干擾PDK1可下調(diào)A549細胞中Bcl-2的表達，同時細胞中cleaved caspase-3的表達顯著升高。考慮到細胞周期及凋亡相關(guān)調(diào)控因子的表達通常與復(fù)雜的信號通路相關(guān)，本實驗進一步分析了該過程中涉及的信號通路。

從結(jié)構(gòu)上分析，PDK1包括N端的絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和C端的血小板-白細胞C激酶底物同源性(pleckstrin homology，PH)結(jié)構(gòu)域2個重要的功能結(jié)構(gòu)域，其中PH域可與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的刺激產(chǎn)物PIP3結(jié)合，并調(diào)控AGC家族下游激酶的磷酸化，而Akt則是其中重要的中介因子[17-19]。本實驗中干擾A549細胞中的PDK1可抑制Akt的磷酸化。眾所周知，Akt信號通路是調(diào)控細胞生長增殖的重要通路[19]，說明PDK1對A549細胞生長和凋亡的調(diào)控作用與Akt信號通路密切相關(guān)。此外，F(xiàn)oxO1是一類抑癌的轉(zhuǎn)錄因子，核內(nèi)的FoxO1可行使轉(zhuǎn)錄因子的功能，調(diào)控細胞周期及凋亡相關(guān)基因的表達；但Akt可致FoxO1磷酸化，使其由胞核轉(zhuǎn)至胞漿，失去轉(zhuǎn)錄活性[20-21]。在此基礎(chǔ)上，本實驗進一步檢測了Akt通路下游重要的調(diào)控因子FoxO1的表達情況。結(jié)果顯示，干擾PDK1后，A549細胞中胞漿p-FoxO1(S256)和p-FoxO1(T24)的含量顯著降低，而細胞核內(nèi)FoxO1的含量顯著增加。為進一步驗證PDK1與Akt信號通路的相互作用，本實驗通過預(yù)孵Akt激動劑IGF-1觀察PDK1的表達及Akt/ FoxO1信號通路的活性。結(jié)果顯示，相較于PDK1干擾組，預(yù)孵IGF-1可部分上調(diào)PDK1的蛋白表達，同時增加了FoxO1的磷酸化出核；此外還可部分上調(diào)A549的細胞活力。以上結(jié)果表明干擾PDK1可抑制Akt的磷酸化進而減少FoxO1的磷酸化出核，上調(diào)核內(nèi)活性的FoxO1，從而降低A549細胞的活性發(fā)揮抑癌作用?；虻恼{(diào)控往往是多條信號通路共同作用的結(jié)果，本實驗檢測了常見的Akt/FoxO1通路，而這其中是否涉及其它信號通路還需要進一步的實驗來驗證。

Figure 5. The interaction between PDK1 and Akt/FoxO1 pathway in A549 cells. A: the activation of Akt/FoxO1 pathway in A549 cells; B: the changes of the viability of A549 cells with different treatments. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssi-PDK1 group.

圖5A549細胞中PDK1與Akt/FoxO1信號通路的相互作用

綜上所述，在人非小細胞肺癌細胞株A549中，干擾PDK1可通過Akt/FoxO1信號通路調(diào)控細胞周期及凋亡相關(guān)因子的表達，進而抑制腫瘤細胞活力并促進細胞凋亡。

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