黃 曄， 廖 陽， 沈楊炳， 馮依力

(1浙江省皮膚病防治研究所藥劑科， 浙江 湖州 313200； 2浙江中醫(yī)藥大學， 浙江 杭州 310053； 3浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院， 浙江 杭州 310016)

胃癌是發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤，手術(shù)是治療胃癌最有效的治療手段。然而由于胃癌的早期癥狀不明顯，而且腫瘤轉(zhuǎn)移能力較強，因此不少胃癌患者在確診時腫瘤發(fā)展已經(jīng)處于中晚期，嚴重影響手術(shù)的治療效果[1-2]。對于這些中晚期胃癌患者而言，化療是不可替代的重要治療方法。然而大劑量的化療藥物對患者有很大的副作用，患者順應性較差，而且大劑量化療藥物的使用容易造成腫瘤細胞對化療的抵抗[3-4]。因此聯(lián)合應用一些輔助治療藥物降低化療藥物的劑量并提高化療藥物的抗腫瘤活性具有十分重要的意義。

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)是目前治療胃癌的一線化療藥物，具有廣譜的抗腫瘤活性。5-氟尿嘧啶是一種DNA致?lián)p藥物，能干擾腫瘤細胞DNA的合成，從而阻斷腫瘤細胞DNA的復制和修復，并誘導腫瘤細胞進入凋亡程序。盡管5-氟尿嘧啶對胃癌有較好的治療效果，然而它的副作用也較大，病人的順應性較低[5-7]，因此降低5-氟尿嘧啶的使用劑量并提高胃癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性是提高化療效果并改善患者順應性的有效方法。

槲皮素(quercetin)是一種天然黃酮類化合物，具有很好的抗氧化和抗炎作用，近幾年的研究表明，槲皮素還有一定的抗腫瘤效應，能增強腫瘤細胞對凋亡信號通路的敏感性[8]。然而，槲皮素是否對胃癌的化療有輔助治療作用至今還未有充分報道。本研究的目的在于探討槲皮素是否能增強5-氟尿嘧啶對胃癌細胞的凋亡誘導活性并研究其機制。

材 料 和 方 法

1細胞培養(yǎng)

人胃癌細胞系BGC-823購于美國模式培養(yǎng)物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5% CO2。

2實驗試劑

5-氟尿嘧啶、槲皮素、MTT和凋亡檢測試劑盒購于Sigma-Aldrich； RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco；蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠及抗c-Jun、p-c-Jun、活化轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor，ATF)2、Bcl-xL、細胞色素C(cytochrome C)、caspase-9、caspase-3和GAPDH抗體購于Santa Cruz；ECL試劑盒購于Pierce； pcDNA3.1和Lipofectamine 2000購于Invitrogen。

3方法

3.1c-Jun重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 人類c-jun基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接，構(gòu)建成c-Jun重組過表達質(zhì)粒，分別將2 mg/L空質(zhì)粒和c-Jun重組過表達質(zhì)粒用Lipofectamine 2000進行包裹，后將其加入到無血清培養(yǎng)基混合。將BGC-823細胞接種在6孔板上孵育過夜，后于培養(yǎng)板中加入上述含質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的無血清培養(yǎng)基中孵育6 h，之后棄去該無血清培養(yǎng)基并加入新鮮的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

3.2細胞活力的檢測 前期預實驗結(jié)果顯示，槲皮素單獨處理對BGC-823細胞的殺傷活性較弱，其半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)需達到225 μmol/L，臨床上很難實現(xiàn)，因此將槲皮素作為輔助治療藥物，測試10 μmol/L槲皮素對5-氟尿嘧啶的協(xié)同作用。另外，預實驗結(jié)果顯示，將BGC-823細胞暴露于槲皮素48 h能充分發(fā)揮其對5-氟尿嘧啶的協(xié)同殺傷活性，因此，本實驗選擇48 h作為5-氟尿嘧啶聯(lián)合槲皮素對BGC-823細胞的作用時間。在進行5-氟尿嘧啶和槲皮素的聯(lián)合治療前，分別將轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒和c-Jun重組過表達質(zhì)粒的BGC-823細胞按每孔5×103的密度接種在96孔板上孵育過夜，之后用0～5 μmol/L 5-氟尿嘧啶及10 μmol/L的槲皮素處理腫瘤細胞48 h。藥物處理完畢后在培養(yǎng)基中加入20 mL MTT (5 g/L)，37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，570 nm波長下測定吸光度(A)值。細胞活力結(jié)果用藥物處理組與對照(control)組的A值比值表示。根據(jù)MTT實驗結(jié)果繪制細胞活力隨5-氟尿嘧啶濃度變化的曲線，根據(jù)曲線計算5-氟尿嘧啶對BGC-823細胞的IC50。

3.3無線粒體的細胞質(zhì)分離 分別將空質(zhì)粒和c-Jun重組過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BGC-823細胞用2 μmol/L的5-氟尿嘧啶及10 μmol/L的槲皮素處理48 h。藥物處理完畢后用線粒體分離試劑盒按試劑說明書步驟將BGC-823細胞中的線粒體從細胞質(zhì)中分離出來，取無線粒體的細胞質(zhì)進行后續(xù)的Western blot實驗。

3.4Western blot實驗 分別將空質(zhì)粒和c-Jun重組過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BGC-823細胞用2 μmol/L的5-氟尿嘧啶及10 μmol/L的槲皮素處理48 h。藥物處理完畢后提取BGC-823細胞中的總蛋白質(zhì)。將等量的總蛋白質(zhì)用12.5% SDS-PAGE進行分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用抗c-Jun、p-c-Jun、ATF2、Bcl-xL、cytochrome C、caspase-9、caspase-3和GAPDH抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的Ⅱ抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。目的蛋白的相對表達用目標蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示，蛋白灰度值分析用ImageJ軟件處理。

3.5免疫共沉淀實驗 分別將空質(zhì)粒和c-Jun重組過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BGC-823細胞用2 μmol/L的5-氟尿嘧啶及10 μmol/L的槲皮素處理48 h。藥物處理完畢后裂解細胞，12 000 r/min離心10 min，收取上清液分成等量2份，1份直接進行Western blot實驗檢測ATF2和c-Jun的蛋白表達水平作為對照(input)，另外 1 份加入抗ATF2抗體孵育過夜。孵育完畢后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2 h，之后12 000 r/min離心10 min收集沉淀的蛋白G瓊脂糖珠，加入上樣緩沖液進行Western blot實驗，檢測與ATF2結(jié)合的c-Jun蛋白。

3.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 分別將空質(zhì)粒和c-Jun重組過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BGC-823細胞用2 μmol/L的5-氟尿嘧啶及10 μmol/L的槲皮素處理48 h。藥物處理完畢后按照凋亡試劑盒說明書將BGC-823細胞用碘化丙啶(propidium iodide，PI)和Annexin V進行染色孵育20 min。孵育完成后用生理鹽水洗滌3次，采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞的凋亡，Annexin V陽性細胞即為凋亡細胞。

4統(tǒng)計學處理

用SPSS 15.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析。所有實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)的比較采用 Student’st檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA )，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1槲皮素通過下調(diào)c-Jun的表達增強5-氟尿嘧啶對BGC-823細胞的殺傷活性

MTT實驗結(jié)果顯示，槲皮素聯(lián)合處理能明顯提高BGC-823細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性，降低5-氟尿嘧啶對BGC-823細胞的IC50，表明槲皮素輔助治療能明顯增強5-氟尿嘧啶的抗胃癌活性，見圖1A。Western blot實驗結(jié)果顯示，5-氟尿嘧啶單獨處理BGC-823細胞能顯著誘導c-Jun蛋白磷酸化；然而槲皮素聯(lián)合處理能顯著抑制BGC-823細胞中c-Jun蛋白的表達，并抑制5-氟尿嘧啶誘導的c-Jun磷酸化，見圖1B。MTT實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染c-Jun重組過表達質(zhì)粒后，槲皮素聯(lián)合5-氟尿嘧啶對BGC-823細胞的殺傷活性明顯降低，見圖1C。這些結(jié)果提示槲皮素下調(diào)c-Jun的表達且抑制5-氟尿嘧啶誘導的c-Jun磷酸化，從而增強胃癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。

Figure 1. Quercetin enhanced 5-fluorouracil-induced death of BGC-823 cells by down-regulating the expression of c-Jun. A: quercetin decreased the IC50of 5-fluorouracil to BGC-823 cells; B: quercetin down-regulated the expression of c-Jun, and suppressed phosphorylation of c-Jun induced by 5-fluorouracil in BGC-823 cells; C: transfection with c-Jun plasmid inhibited the death of BGC-823 cells co-treated with 5-fluorouracil and quercetin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vs5-fluorouracil group；&P<0.05vs5-fluorouracil+quercetin group.

圖1槲皮素通過下調(diào)c-Jun的表達而增強5-氟尿嘧啶對BGC-823細胞的殺傷活性

2槲皮素抑制5-氟尿嘧啶誘導的c-Jun/ATF2異二聚體的形成

免疫共沉淀和Western blot實驗結(jié)果顯示，5-氟尿嘧啶能顯著誘導c-Jun和ATF2的相互作用；然而聯(lián)用槲皮素后，5-氟尿嘧啶誘導的c-Jun/ATF2異二聚體的形成受到明顯抑制；轉(zhuǎn)染c-Jun過表達質(zhì)粒后，槲皮素對5-氟尿嘧啶誘導的c-Jun/ATF2異二聚體的抑制作用明顯減弱，表明槲皮素通過下調(diào)c-Jun表達抑制5-氟尿嘧啶誘導的c-Jun/ATF2異二聚體的形成，見圖2A。c-Jun/ATF2異二聚體能誘導腫瘤細胞Bcl-xL蛋白的過表達[9]。Western blot實驗結(jié)果顯示，5-氟尿嘧啶單獨處理能明顯誘導BGC-823細胞Bcl-xL的表達，然而聯(lián)用槲皮素后，5-氟尿嘧啶誘導的Bcl-xL的過表達受到明顯抑制，見圖2B。上述結(jié)果表明槲皮素通過下調(diào)c-Jun的表達而抑制5-氟尿嘧啶誘導的c-Jun/ATF2異二聚體的形成，從而抑制Bcl-xL蛋白的過表達。

Figure 2. Quercetin inhibited 5-fluorouracil-induced formation of c-Jun/ATF2 heterodimer in BGC-823 cells. A: quercetin inhibited 5-fluorouracil-induced interaction between c-Jun and ATF2 in BGC-823 cells; B: quercetin inhibited 5-fluorouracil-induced overexpression of Bcl-xL in BGC-823 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs5-fluorouracil group;&P<0.05vs5-fluorouracil+quercetin group.

圖2槲皮素抑制5-氟尿嘧啶誘導的c-Jun/ATF2異二聚體的形成

3槲皮素促進5-氟尿嘧啶誘導的線粒體途徑凋亡

Western blot實驗結(jié)果顯示，槲皮素能明顯促進BGC-823細胞中5-氟尿嘧啶誘導的細胞色素C從線粒體中釋放到細胞質(zhì)中；同時，槲皮素能明顯促進5-氟尿嘧啶對caspase-9和caspase-3的活化，進而促進BGC-823細胞中5-氟尿嘧啶誘導凋亡的發(fā)生；然而，轉(zhuǎn)染c-Jun過表達質(zhì)粒后，槲皮素對5-氟尿嘧啶誘導的線粒體途徑凋亡的促進作用受到明顯抑制，見圖3。這些結(jié)果表明槲皮素通過下調(diào)c-Jun的表達而促進5-氟尿嘧啶對BGC-823細胞凋亡的誘導活性。

討 論

槲皮素是一種具有很強藥理學活性的天然黃酮類化合物，有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素還具有一定的抗腫瘤作用，如槲皮素能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移[10]；又如槲皮素還能通過損傷肺癌細胞的細胞骨架而發(fā)揮抗腫瘤活性[11]。然而，槲皮素是否對胃癌的化療有輔助治療作用，至今還未充分報道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)將胃癌細胞BGC-823用槲皮素進行輔助治療能明顯提高其對5-氟尿嘧啶的敏感性，降低5-氟尿嘧啶的IC50，表明槲皮素對胃癌細胞的5-氟尿嘧啶化療有顯著的協(xié)同作用。

c-Jun是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白，屬于核轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(activator protein, AP-1)家族成員，受上游分子JNK的調(diào)節(jié)。研究表明，當腫瘤細胞的DNA受5-氟尿嘧啶等藥物損傷時，JNK蛋白會發(fā)生活化從而激活c-Jun，使之磷酸化。磷酸化的c-Jun 能促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并抑制腫瘤細胞發(fā)生凋亡。更為重要的，文獻報道c-Jun的過度磷酸化是導致腫瘤細胞發(fā)生化療抵抗的重要機制[12-16]。在本研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當胃癌細胞用5-氟尿嘧啶進行治療時，胃癌細胞中的c-Jun蛋白會發(fā)生高度磷酸化以抵抗5-氟尿嘧啶對胃癌細胞的殺傷作用。然而當用槲皮素進行聯(lián)合治療時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細胞中的c-Jun蛋白表達水平受到明顯抑制，并由此抑制了5-氟尿嘧啶依賴的c-Jun蛋白磷酸化，證明了c-Jun的下調(diào)是槲皮素發(fā)揮協(xié)同作用的重要機制。

Figure 3. Quercetin promoted 5-fluorouracil-induced mitochondrial apoptosis in BGC-823 cells. A: quercetin promoted 5-fluorouracil-induced release of cytochrome C from mitochondria into cytoplasm in BGC-823 cells; B: quercetin promoted 5-fluorouracil-induced activation of caspase-9 and caspase-3 in BGC-823 cells; C: quercetin promoted 5-fluorouracil-induced apoptosis in BGC-823 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vs5-fluorouracil group；&P<0.05vs5-fluorouracil+quercetin group.

圖3槲皮素促進BGC-823細胞中5-氟尿嘧啶誘導的線粒體途徑凋亡

c-Jun在發(fā)生磷酸化后，能與ATF2等轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體，該二聚體能誘導Bcl-xL抗凋亡蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[9, 17]。在本研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶單獨處理能顯著誘導胃癌細胞中c-Jun/ATF2復合物的形成，同時誘導胃癌細胞中Bcl-xL抗凋亡蛋白的過表達；然而槲皮素聯(lián)合治療能通過下調(diào)c-Jun蛋白的表達抑制胃癌細胞中c-Jun/ATF2復合物的形成，從而抑制5-氟尿嘧啶誘導的Bcl-xL過表達。因此，槲皮素促進5-氟尿嘧啶對線粒體的損傷作用，使之釋放細胞色素C等凋亡活性物質(zhì)到細胞質(zhì)中，誘導caspase-9和caspase-3發(fā)生活化，最終導致凋亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究證明了槲皮素能通過c-Jun/ATF2/Bcl-xL途徑顯著增強5-氟尿嘧啶對胃癌的凋亡誘導活性。這些研究為降低5-氟尿嘧啶的使用劑量、增加其對胃癌的治療效果提供了新的策略和思路。

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2013[J]. CA Cancer J Clin, 2013, 63(1):11-30.

[2] Zhang J, Zhao J, Gao N, et al. MECP2 expression in gastric cancer and its correlation with clinical pathological parameters[J]. Medicine (Baltimore), 2017, 96(31):e7691.

[3] Bao J, Xu Y, Wang Q, et al. miR-101 alleviates chemoresistance of gastric cancer cells by targeting ANXA2[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 92:1030-1037.

[4] Li L, Wu C, Zhao Y. miRNA-34a enhances the sensitivity of gastric cancer cells to treatment with paclitaxel by targeting E2F5[J]. Oncol Lett, 2017, 13(6):4837-4842.

[5] 李 強， 曹明溶， 劉志龍， 等. 去氫駱駝蓬堿誘導HepG2細胞凋亡并增強其對5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(2):284-289.

[6] Sistonen J, Büchel B, Froehlich TK, et al. Predicting 5-fluorouracil toxicity: DPD genotype and 5,6-dihydrouracil:uracil ratio[J]. Pharmacogenomics, 2014, 15(13):1653-1666.

[7] Xu GY, Tang XJ. Troxerutin (TXN) potentiated 5-fluorouracil (5-FU) treatment of human gastric cancer through suppressing STAT3/NF-κB and Bcl-2 signaling pathways[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 92:95-107.

[8] Xiang T, Fang Y, Wang SX. Quercetin suppresses HeLa cells by blocking PI3K/Akt pathway[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2014, 34(5):740-744.

[9] Salameh A, Galvagni F, Anselmi F, et al. Growth factor stimulation induces cell survival by c-Jun. ATF2-depen-dent activation of Bcl-xL[J]. J Biol Chem, 2010, 285(30):23096-23104.

[10] Liu Y, Tang ZG, Lin Y, et al. Effects of quercetin on proliferation and migration of human glioblastoma U251 cells[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 92:33-38.

[12] Liu S, Guo C, Wang J, et al. ANXA11 regulates the tumorigenesis, lymph node metastasis and 5-fluorouracil sensitivity of murine hepatocarcinoma Hca-P cells by targeting c-Jun[J]. Oncotarget, 2016, 7(13):16297-16310.

[13] Shao J, Teng Y, Padia R, et al. COP1 and GSK3-β co-operate to promote c-Jun degradation and inhibit breast cancer cell tumorigenesis[J]. Neoplasia, 2013, 15(9):1075-1085.

[14] Yang Z, Zhang Y, Wang L. A feedback inhibition between miRNA-127 and TGF-β/c-Jun cascade in HCC cell migration via MMP13[J]. PLoS One, 2013, 8(6):e65256.

[15] Watanabe T, Hiasa Y, Tokumoto Y, et al. Protein kinase R modulates c-Fos and c-Jun signaling to promote prolife-ration of hepatocellular carcinoma with hepatitis C virus infection[J]. PLoS One, 2013, 8(7):e67750.

[16] Chen L, Bourguignon LY. Hyaluronan-CD44 interaction promotes c-Jun signaling and miRNA21 expression lea-ding to Bcl-2 expression and chemoresistance in breast cancer cells[J]. Mol Cancer, 2014, 13:52.

[17] Yu S, Huang H, Deng G, et al. miR-326 targets antiapoptotic Bcl-xL and mediates apoptosis in human platelets[J]. PLoS One, 2015, 10(4):e0122784.