李召君， 李榮耀， 王 茹， 費洪榮， 王鳳澤△

(泰山醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院， 2生命科學(xué)學(xué)院， 山東 泰安 271016)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，其死亡率較高，手術(shù)治療后易復(fù)發(fā)。目前臨床上膠質(zhì)瘤以手術(shù)治療為主，輔以放化療等綜合治療，但是由于其惡性程度高，且呈浸潤性生長，手術(shù)難以根除。因此，尋求控制或治愈膠質(zhì)瘤的有效手段仍是其臨床治療的主要任務(wù)。當(dāng)前，更多的科研工作者致力于探討膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在分子機制，以期尋找膠質(zhì)瘤診斷和治療的新途徑[1]。SCH900776是一種新型的細(xì)胞周期檢測點激酶1(checkpoint kinase 1，CHK1)抑制劑，對肺癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤均表現(xiàn)出較好的抑制作用[2-3]。本研究以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為實驗對象，觀察SCH900776對U251細(xì)胞增殖和遷移的影響，同時初步探索其分子機制，為SCH900776未來的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1實驗材料

SCH900776購自Selleck Chemicals；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自 Gibco；MTT和抗β-actin抗體購自Sigma Aldrich；ECL 試劑盒購自Merck Millipore；抗細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)、細(xì)胞分裂周期蛋白2(cell division cycle protein 2，Cdc2)、p38、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2、p-ERK1/2和Akt抗體購自Santa Cruz；抗p-Cdc2和p-p38抗體購自Cell Signaling Technology；抗p-Akt抗體購自Abcam；抗p27抗體購自BD Biosciences；II 抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2實驗方法

2.1細(xì)胞株 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日于各孔內(nèi)加入含不同濃度(0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20 μmol/L)SCH900776的培養(yǎng)基各100 μL，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng)前4 h每孔中加入MTT 溶液 20 μL(5 g/L)，然后吸去各孔中的溶液，加入150 μL DMSO充分溶解混勻，于490 nm 處檢測各孔的吸光度(A)值，分析計算實驗結(jié)果。

2.3細(xì)胞集落形成實驗 接種U251細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中，然后加入不同濃度(0、0.5、1和5 μmol/L)的SCH900776進行干預(yù)12 d。終止培養(yǎng)后用PBS洗滌2次，接著加入無水甲醇固定細(xì)胞20 min。PBS洗滌細(xì)胞后，加入結(jié)晶紫室溫染色10 min。最后于倒置顯微鏡下對細(xì)胞集落進行計數(shù)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 接種U251細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中，然后用不同劑量(0、0.5、1和5 μmol/L)的SCH900776處理細(xì)胞24 h。胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞2次后，加入預(yù)冷的75%乙醇于4 ℃固定過夜。離心去除乙醇，加入RNase A，于37 ℃作用30 min，接著加入碘化丙啶，4 ℃避光處理 20 min。用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2.5劃痕愈合實驗檢測U251細(xì)胞的遷移能力 接種U251細(xì)胞于24孔板中，然后用槍頭行“十”字劃痕，PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入不同濃度(0、0.5、1和5 μmol/L)的含藥新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，于劃痕后的0 h和48 h在相同位置觀察并拍照記錄劃痕寬度。

2.6Western blot實驗 U251細(xì)胞用不同濃度SCH900776(0.1、5和10 μmol/L)處理24 h，再用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解 20 min后，4 ℃離心20 min，取上清，進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并用5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，TBST 洗膜1次，加入相應(yīng) I 抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入 II 抗室溫孵育2 h，ECL顯色試劑盒曝光顯影。實驗重復(fù)3次。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1SCH900776對U251細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT 實驗結(jié)果表明，U251細(xì)胞經(jīng)1 μmol/L以上濃度的SCH900776處理24 h后，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞活力抑制率顯著升高(P<0.05)，見圖1；細(xì)胞經(jīng)SCH900776作用12 d后，細(xì)胞集落形成能力明顯受到抑制(P<0.05)，表明SCH900776能夠明顯抑制U251細(xì)胞的增殖，見圖2。

Figure 1. The inhibitory effect of SCH900776 on the viability of U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1SCH900776抑制U251細(xì)胞活力

Figure 2. SCH900776 inhibited the colony formation ability of U251 cells. The histogram represents the mean colony numbers. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2SCH900776抑制U251細(xì)胞集落形成

2SCH900776對U251細(xì)胞周期的影響

從流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果可以看出，U251細(xì)胞經(jīng)SCH900776作用24 h，在1 μmol/L SCH900776作用的細(xì)胞中，S期細(xì)胞比例明顯增多，而G1期細(xì)胞比例則減少(P<0.05)；當(dāng)分別用5 μmol/L和10 μmol/L的SCH900776處理細(xì)胞后，G2/M期細(xì)胞比例則顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，較低濃度的SCH900776誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，而較高濃度的SCH900776阻滯細(xì)胞于G2/M期，見圖3、表1。

互動混合式教學(xué)借助互聯(lián)網(wǎng)平臺和信息通信技術(shù)，將MOOC、微課、翻轉(zhuǎn)課堂等熱議的網(wǎng)絡(luò)教學(xué)模式與傳統(tǒng)課堂面對面教學(xué)的優(yōu)勢相結(jié)合，彌補傳統(tǒng)教學(xué)中存在的不足[3]。現(xiàn)代職教課程可概括為“線上、線下、職場化”?；咀龇ㄊ菍⒃诰€教學(xué)與面對面課堂教學(xué)進行一體化設(shè)計，教師提前錄制教學(xué)微視頻等課程資源上傳到教學(xué)平臺，學(xué)生課前登錄教學(xué)平臺觀看課件、視頻，在線測試、討論或作業(yè)。教師根據(jù)學(xué)生在線學(xué)習(xí)情況，完善課堂教學(xué)設(shè)計。課堂教學(xué)以學(xué)生為主，開展分組討論、項目實戰(zhàn)、任務(wù)學(xué)習(xí)、展示交流、作業(yè)及評價等活動，教師主要負(fù)責(zé)解疑答惑、組織活動。

Figure 3. The effect of SCH900776 on the cell cycle distribution of U251 cells.

圖3SCH900776對U251細(xì)胞周期的影響

表1SCH900776對U251細(xì)胞周期的影響

Table 1. Upon exposure to SCH900776 (SCH) for 24 h, the cell cycle distribution of U251 cell was determined by flow cytometry analysis (%. Mean±SD.n=3)

SCH(μmol/L)G0/G1G2/MS063．22±3．7712．79±1．4824．00±2．53131．65±2．39?13．36±1．6054．98±3．05?543．74±2．52?19．60±1．98?36．68±2．74?1046．48±3．31?29．61±2．96?23．91±2．89

*P<0.05vs0 μmol/L group.

接著，我們應(yīng)用Western blot實驗檢測了SCH900776對細(xì)胞周期調(diào)控蛋白水平的影響。從結(jié)果可以看出，5和10 μmol/L SCH900776處理U251細(xì)胞24 h后，Cdc2和p-Cdc2的蛋白水平均明顯下凋，而cyclin B1的蛋白水平則顯著上調(diào)(P<0.05)，p27的表達未見明顯變化，見圖4。

3SCH900776抑制U251細(xì)胞的遷移

劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，在SCH900776作用的U251細(xì)胞中，細(xì)胞遷移能力均明顯下降(P<0.05)，見圖5。

4SCH900776對絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

為進一步探討SCH900776抑制U251細(xì)胞增殖與遷移的分子機制，本研究檢測了SCH900776對MAPK信號通路關(guān)鍵因子p38和ERK活性的影響。從結(jié)果可以看出，在SCH900776作用的U251細(xì)胞中，p38的磷酸化水平明顯升高，表明SCH900776能夠激活p38 MAPK；ERK的磷酸化水平未見明顯變化，見圖6。

Figure 4. SCH900776 down-regulated the protein levels of p-Cdc2 and Cdc2， amd up-regulated cyclin B1 expression in U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4SCH900776對U251細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達水平的影響

Figure 5. The effect of SCH900776 on the migration ability of U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖5劃痕愈合實驗檢測SCH900776對U251細(xì)胞遷移的影響

5SCH900776抑制U251細(xì)胞中Akt的磷酸化

最后，本研究檢測了SCH900776對U251細(xì)胞中Akt活性的影響。Western blot結(jié)果表明，5和10 μmol/L SCH900776能夠顯著抑制Akt的磷酸化水平，見圖7。

Figure 6. SCH900776 increased the phosphorylation of p38 in U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖6SCH900776上調(diào)U251細(xì)胞中p38的磷酸化水平

Figure 7. SCH900776 suppressed the phosphorylation of Akt in U251 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖7SCH900776抑制U251細(xì)胞中Akt的磷酸化水平

討 論

SCH900776(MK-8776)是一種選擇性CHK1抑制劑，能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞等發(fā)生DNA損傷，并促進腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，SCH900776能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期進而抑制U251細(xì)胞的增殖和遷移。SCH900776的抗腫瘤活性可能與其激活p38 MAPK信號通路和抑制Akt磷酸化相關(guān)。

細(xì)胞周期進程決定著腫瘤細(xì)胞的增殖與生長。本實驗表明，SCH900776對U251細(xì)胞增殖表現(xiàn)出明顯的阻抑作用，較低濃度的SCH900776誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于S期；而較高濃度的SCH900776作用細(xì)胞后，U251細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。同時，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cdc2和p-Cdc2的表達量降低，cyclin B1表達水平增加，表明SCH900776對U251細(xì)胞周期阻滯行為與其調(diào)控上述細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達密切相關(guān)。

MAPK家族參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及凋亡等生理病理過程[6-7]。p38是細(xì)胞感受外屆應(yīng)激信號并引起應(yīng)答的一個關(guān)鍵分子[8]。當(dāng)細(xì)胞受紫外線或細(xì)胞因子等刺激時，非磷酸化的p38與ATP結(jié)合并發(fā)生磷酸化激活，進而激活相關(guān)下游底物，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和遷移等過程。有文獻報道，小分子化合物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控與p38 MAPK相關(guān)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，SCH900776促進p38的磷酸化，表明SCH900776的抗腫瘤活性可能與其激活p38 MAPK信號通路密切相關(guān)。

PI3K/Akt信號通路調(diào)控眾多與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物學(xué)過程，如細(xì)胞凋亡、增殖及細(xì)胞周期調(diào)控等[11]。該信號通路活化能夠加快細(xì)胞周期進程而促進細(xì)胞增殖，同時促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。Akt是PI3K信號途徑的一個重要下游靶激酶，具有絲/蘇氨酸激酶活性。拮抗Akt活性抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移等過程[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，SCH900776下調(diào)Akt的磷酸化水平，且抑制了U251細(xì)胞的增殖和遷移，預(yù)示著PI3K/Akt信號通路可能與SCH900776抑制U251細(xì)胞增殖與遷移過程相關(guān)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)CHK1抑制劑SCH900776能明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖與遷移，SCH900776的抑癌作用可能與其激活p38 MAPK和抑制Akt的磷酸化相關(guān)。SCH900776對p38 MAPK和Akt活性調(diào)控的詳細(xì)分子機理還需進一步深入探討。本研究對SCH900776未來的臨床應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)和實驗基礎(chǔ)。

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