王幫國(guó)，余振宇，林 琳，潘麗軍，姜紹通,*

我國(guó)是世界淡水漁業(yè)第一大國(guó)，2014年我國(guó)淡水魚(yú)類(lèi)產(chǎn)量2 770.32萬(wàn) t，占我國(guó)魚(yú)類(lèi)總產(chǎn)量的68.4%、占淡水水產(chǎn)品總產(chǎn)量的87.5%。白鰱因其肉質(zhì)鮮嫩，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸以及多不飽和脂肪酸等人體必需營(yíng)養(yǎng)成分，并且具有生長(zhǎng)周期短、抗病能力強(qiáng)、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，是著名的四大家魚(yú)之一[1-3]。

土腥味是制約鰱魚(yú)工業(yè)化發(fā)展的重要因素，土腥味增強(qiáng)原因主要有兩個(gè)方面，一是由于白鰱魚(yú)體內(nèi)豐富的多不飽和脂肪酸嚴(yán)重氧化生成的小分子醛、酮、醇揮發(fā)性成分；二是來(lái)源于白鰱魚(yú)養(yǎng)殖環(huán)境中物質(zhì)在體內(nèi)的堆積，導(dǎo)致白鰱魚(yú)腥味加重主要源于白鰱魚(yú)體內(nèi)的脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）催化降解不飽和脂肪酸產(chǎn)生的各種揮發(fā)性物質(zhì)引起的[4-6]。LOX是種氧化還原酶，能專(zhuān)一催化含順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸，生成具有共軛雙鍵的不飽和脂酸的氫過(guò)氧化物，再經(jīng)過(guò)催化氧化，裂解成揮發(fā)性醛、酮、醇類(lèi)小分子化合物，對(duì)食品風(fēng)味形成起到關(guān)鍵作用[7-9]。

白鰱魚(yú)肌肉LOX氧化會(huì)造成不飽和脂肪酸含量下降，魚(yú)腥味加重，同時(shí)傳統(tǒng)的化學(xué)和熱處理脫腥方法也會(huì)嚴(yán)重破壞魚(yú)肉品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10-11]。而非熱物理加工方法近年來(lái)在食品加工過(guò)程中逐漸占居主導(dǎo)地位，其中超聲波（ultrasonic wave，UW）和超高壓（ultra high pressure，UHP）逐漸受到廣大研究者的關(guān)注[12]。超聲波具有獨(dú)特的聲化學(xué)效應(yīng)，作用于液體時(shí)，強(qiáng)大的拉應(yīng)力把液體“撕開(kāi)”成空洞，隨周?chē)橘|(zhì)的振動(dòng)而破滅，破滅時(shí)周?chē)后w突然沖入氣泡而產(chǎn)生高溫、高壓，同時(shí)產(chǎn)生激波，使分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，可廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)[13-15]。超高壓能夠鈍化食品內(nèi)源酶是因?yàn)楦邏籂顟B(tài)下，生物體高分子立體結(jié)構(gòu)中的氫鍵結(jié)合、疏水結(jié)合、離子結(jié)合等非共有結(jié)合發(fā)生變化，內(nèi)源酶的生物大分子構(gòu)象會(huì)改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變與變形，使酶失活[16-19]。為研發(fā)新型脫腥工藝，保持白鰱魚(yú)貯藏、加工過(guò)程中的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，本研究以白鰱魚(yú)肉為原料，從中提取LOX，初步探究超聲波、超高壓新型非熱物理加工方法對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX構(gòu)象、活力的影響，為白鰱的土腥味控制和精深加工提供新型技術(shù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活白鰱魚(yú)購(gòu)于合肥市馬鞍山路家樂(lè)福超市，每條質(zhì)量（1 100±200）g。

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、硫酸銨、亞油酸、硼酸、硼砂、吐溫20等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2型組織搗碎機(jī) 江蘇省金壇市城西崢嶸實(shí)驗(yàn)儀器廠；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器上海杰理科技有限公司；YCB630/2.5 1L超高壓設(shè)備兵器工業(yè)第五二研究所；810 CD圓二色譜（circular dichroism，CD）儀 日本JASCO公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 白鰱魚(yú)肌肉LOX提取

參照Gata等[20]方法稍加修改，將鮮活白鰱魚(yú)宰殺，置于冰袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，然后置于裝滿冰的冰盒中去頭、尾和內(nèi)臟，用冷水洗凈，去脊骨和魚(yú)皮，手工采集背部白色肌肉；將新鮮肌肉置于組織搗碎機(jī)中，添加4 倍體積的50 mmol/L、pH 7.8磷酸鹽緩沖液（含2 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA，4 ℃），12 000 r/min勻漿1.5 min；勻漿后緩沖液進(jìn)行冷凍離心（10 000×g，60 min），上清液按質(zhì)量體積比13.4∶100加入研碎無(wú)水硫酸銨，溶解后離心（10 000×g，30 min），收集上清液并按質(zhì)量體積比13.4∶100加入研碎無(wú)水硫酸銨，充分溶解后離心（10 000×g，30 min），收集20%～40%飽和組分，沉淀等量溶于磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.4）中，即粗酶液。

1.3.2 白鰱魚(yú)肌肉LOX活力、質(zhì)量濃度測(cè)定

參照付湘晉[21]的方法采用紫外分光光度法測(cè)定酶活力：用吐溫20（最終添加量0.1 mL/100 mL）作為乳化劑，將亞油酸（終濃度10 mmol/L）分散在10 mmol/L硼酸緩沖液（pH 9.0）中，置于4 ℃冰箱中備用。250 μL上述底物和50 μL LOX粗酶液添加到1.7 mL磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）中，立刻計(jì)時(shí)，測(cè)定其在234 nm波長(zhǎng)處吸光度的增加量。吸光度每分鐘增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位。

酶液質(zhì)量濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)品選用牛血清白蛋白。

1.3.3 白鰱魚(yú)肌肉LOX的CD檢測(cè)

CD光譜法可以有效分析蛋白質(zhì)肽鍵中α-螺旋和β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，顯示蛋白質(zhì)在不同條件下二級(jí)結(jié)構(gòu)的整體變化，是分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最常用的方法[22]。本研究采用Feng Liping等[15]方法稍加修改：以磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）作為空白對(duì)照，先將LOX粗酶液稀釋至0.1～0.2 mg/mL，CD光譜掃描范圍190～250 nm，樣品池光程1 mm，掃描速率100 nm/min，常溫（25 ℃）下重復(fù)掃描4 次，得到LOX粗酶液CD光譜，用平均摩爾橢圓率[θ]表示圓二色性，單位deg·cm2/mol。

1.3.4 白鰱魚(yú)肌肉LOX熒光光譜檢測(cè)

蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸基團(tuán)具有內(nèi)源熒光性，在外加光源激發(fā)情況下會(huì)發(fā)射內(nèi)源熒光，并且熒光光譜會(huì)隨著芳香族氨基酸基團(tuán)位置和微環(huán)境的變化而發(fā)生改變，通過(guò)熒光光譜的變化可以用來(lái)分析蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)[23]。

以磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）作為空白對(duì)照，先將LOX粗酶液稀釋至0.01～0.05 mg/mL，用熒光光譜儀進(jìn)行掃描，激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，掃描波長(zhǎng)為220～700 nm，速率240 nm/min，常溫（25 ℃）條件下重復(fù)掃描3 次。

1.3.5 白鰱魚(yú)肌肉LOX超聲波處理

量取1.5 mL白鰱魚(yú)肌肉LOX粗酶液在2 mL離心管中，分別在180、210、240、270、300 W超聲波條件下處理3 h；在300 W超聲波下分別處理1、2、3、4、5 h，溫度（20±5）℃，測(cè)定其酶活力、CD光譜、熒光光譜，研究白鰱魚(yú)肌肉LOX在不同超聲波條件下酶活力、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。

1.3.6 白鰱魚(yú)肌肉LOX超高壓處理

量取10 mL白鰱魚(yú)肌肉LOX粗酶液在聚乙烯袋中密封，分別在150、200、250、300、350、400 MPa超高壓條件下處理15 min；在300 MPa超高壓條件下分別處理5、10、15、20、25、30 min，溫度4 ℃，測(cè)定其酶活力、CD光譜、熒光光譜，研究白鰱魚(yú)肌肉LOX在不同超高壓條件下酶活力、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理分析，測(cè)定結(jié)果以表示，采用SPSS軟件的單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析，CD圖和熒光光譜圖采用Origin 9.0作圖軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX的影響

2.1.1 超聲波功率對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX的影響

分別用180、210、240、270、300 W超聲波處理白鰱魚(yú)肌肉LOX 3 h后，LOX活力、CD光譜圖、熒光光譜圖分別如圖1～3所示。

圖1 超聲功率對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX活力的影響Fig. 1 Effect of ultrasonic power on LOX activity in silver carp muscle

由圖1可知，隨著超聲波功率增加，LOX活力逐漸下降，功率大于210 W時(shí)，酶活力下降較為顯著；當(dāng)LOX經(jīng)180、210、240、270、300 W超聲波處理3 h后，酶活力分別下降5.36%、16.07%、26.79%、50.00%、62.50%。

圖2 超聲功率對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on the secondary conformation of LOX in silver carp muscle

光學(xué)活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)對(duì)組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)（ε）是不相等的，吸收率不同，圓偏振光變成橢圓偏振光，其光吸收的差值ΔA稱(chēng)為該物質(zhì)的圓二色性[24]。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要的光活性基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵，其吸收峰分布在蛋白質(zhì)CD色譜的遠(yuǎn)紫外區(qū)段（190～240 nm），一般認(rèn)為α-螺旋特征吸收峰在208 nm和222 nm左右，有兩處負(fù)峰，在208 nm波長(zhǎng)處橢圓率能夠反映蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)變化，估計(jì)蛋白質(zhì)α-螺旋含量；典型β-折疊在214 nm左右有一特征吸收負(fù)峰；無(wú)規(guī)卷曲在220 nm左右有一小而寬的正峰[25-26]。圖2為白鰱魚(yú)肌肉LOX經(jīng)不同功率超聲波處理后CD光譜圖。隨著超聲波功率增加，LOX在208、214 nm和222 nm波長(zhǎng)處特征吸收峰強(qiáng)度逐漸下降，說(shuō)明超聲波對(duì)LOX內(nèi)α-螺旋、β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響，使LOX二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功率越大，二級(jí)結(jié)構(gòu)改變?cè)矫黠@。

圖3 超聲功率對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic power on the tertiary conformation of LOX in silver carp muscle

含有芳香族氨基酸殘基如色氨酸（tryptophan，Tr p）、酪氨酸（t y r o s i n e，Ty r）和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）殘基的蛋白質(zhì)在一定激發(fā)波長(zhǎng)照射下會(huì)產(chǎn)生熒光，稱(chēng)為內(nèi)源熒光[27]。Trp、Tyr和Phe的熒光峰位波長(zhǎng)分別是344、303、282 nm，蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是由Trp和Tyr殘基形成的，其中Trp的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)；在同時(shí)含有Trp和Tyr的蛋白質(zhì)中，由于其分子發(fā)生了從Tyr殘基到Trp殘基的能量轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致Tyr殘基的熒光猝滅和Trp殘基的熒光強(qiáng)度增加，因而內(nèi)源熒光分析的主要對(duì)象為T(mén)rp，常被用來(lái)研究蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化[28-29]。

圖3為白鰱魚(yú)肌肉LOX經(jīng)不同功率超聲波處理后熒光光譜圖。超聲波功率小于210 W時(shí)，LOX在344 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度變化較小，LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定；當(dāng)超聲波功率大于210 W時(shí)，說(shuō)明隨著超聲波功率增加，LOX在344 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明LOX分子中Trp不斷由分子內(nèi)非極性環(huán)境中暴露在外部極性環(huán)境中，LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且超聲波功率越大，三級(jí)結(jié)構(gòu)變化越顯著。因此，白鰱魚(yú)肌肉LOX活性與LOX分子結(jié)構(gòu)有著極為密切的聯(lián)系，增加超聲波功率、延長(zhǎng)超聲時(shí)間能夠使白鰱魚(yú)肌肉LOX分子內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而使LOX活性降低。

2.1.2 超聲處理時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX的影響

用300 W超聲波分別處理白鰱魚(yú)肌肉LOX 1、2、3、4、5 h后，LOX活力、CD光譜圖、熒光光譜圖分別如圖4～6所示。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX活力的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic irradiation time on LOX activity in silver carp muscle

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，LOX活力呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明LOX逐漸失活；時(shí)間短于3 h時(shí)，隨著超聲時(shí)間酶活力下降較為明顯，大于3 h后趨于平緩。用300 W超聲波分別處理白鰱魚(yú)肌肉LOX 1、2、3、4、5 h后，酶活力分別下降26.79%、51.79%、66.07%、69.64%、76.79%。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic irradiation time on the secondary conformation of LOX in silver carp muscle

圖5為白鰱魚(yú)肌肉LOX經(jīng)300 W超聲波處理不同時(shí)間后CD光譜圖。隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，LOX在208、214 nm和222 nm波長(zhǎng)處特征吸收峰強(qiáng)度逐漸下降，說(shuō)明LOX內(nèi)α-螺旋、β-折疊含量降低，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)變化越明顯。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響Fig. 6 The effect of ultrasonic irradiation time on the tertiary conformation of LOX in silver carp muscle

圖6為白鰱魚(yú)肌肉LOX經(jīng)300 W超聲波處理不同時(shí)間后熒光光譜圖。隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，LOX在344 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，超聲時(shí)間短于3 h時(shí)，LOX在344 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)相對(duì)平緩，大于3 h時(shí)，LOX在344 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明LOX分子中Trp不斷由分子內(nèi)非極性環(huán)境中暴露在外部極性環(huán)境中，LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且超聲時(shí)間越長(zhǎng)，三級(jí)結(jié)構(gòu)變化越明顯。因此隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，白鰱魚(yú)LOX的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)不斷改變，進(jìn)而使LOX活力不斷降低。

2.2 超高壓處理對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX的影響

2.2.1 超高壓壓力對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX的影響

分別用150、200、250、300、350、400 MPa超高壓處理白鰱魚(yú)肌肉LOX 15 min后，LOX活力、CD光譜圖、熒光光譜圖分別如圖7～9所示。

圖7 超高壓壓力對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX活力的影響Fig. 7 Effect of UHP pressure on LOX activity in silver carp muscle

如7圖所示，隨著超高壓壓力增加，LOX活力整體呈下降趨勢(shì)，在0～300 MPa之間，隨著壓力增加，酶活力下降顯著，壓力大于300 MPa時(shí)，酶活力趨于穩(wěn)定，此時(shí)LOX已基本失活；用150、200、250、300、350、400 MPa超高壓處理白鰱魚(yú)肌肉LOX 15 min后，LOX活力分別下降46.55%、65.52%、75.86%、93.10%、96.55%、93.10%。

圖8 超高壓壓力對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響Fig. 8 Effect of UHP pressure on the secondary conformation of LOX in silver carp muscle

圖8為白鰱魚(yú)肌肉LOX經(jīng)不同壓力超高壓處理15 min后CD圖。隨著超高壓壓力增大，LOX在208、214 nm和222 nm波長(zhǎng)處特征吸收峰強(qiáng)度明顯下降，說(shuō)明LOX內(nèi)α-螺旋、β-折疊含量明顯下降，且隨著超高壓壓力增大，二級(jí)結(jié)構(gòu)變化越顯著。

圖9 超高壓壓力對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響Fig. 9 Effect of UHP pressure on the tertiary conformation of LOX in silver carp muscle

從圖9可以看出，隨著超高壓壓力增大，LOX在344 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度顯著減弱，這與大多數(shù)文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果并不相同。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)含有芳香族殘基的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，一般情況下Trp不斷由分子內(nèi)非極性環(huán)境中暴露在外部極性環(huán)境中，造成蛋白質(zhì)在344 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)[24,30]。但是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)相反的情況，熒光強(qiáng)度沒(méi)有出現(xiàn)增強(qiáng)反而顯著減弱，經(jīng)查閱文獻(xiàn)并結(jié)合超高壓作用原理分析，主要原因可能是LOX分子內(nèi)部的Trp殘基在超高壓作用下被進(jìn)一步包埋在蛋白質(zhì)側(cè)鏈中，肽鏈沒(méi)有展開(kāi)，熒光基團(tuán)沒(méi)有暴露，因此不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源熒光，而且壓力越高，包埋作用越明顯，造成LOX在344 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度顯著減弱的現(xiàn)象[31]。這種現(xiàn)象并不是因?yàn)長(zhǎng)OX三級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，而是由于超高壓的壓力作用導(dǎo)致Trp殘基的包埋所致。氨基酸殘基的包埋和暴露均會(huì)使帶有芳香族殘基的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而使酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變。因此，隨著超高壓壓力的增加，LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)也在不斷變化，且壓力越大，變化越明顯。

2.2.2 超高壓時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX的影響

用300 MPa超高壓分別處理白鰱魚(yú)肌肉LOX 5、10、15、20、25、30 min后，LOX活力、CD光譜圖、熒光光譜圖分別如圖10～12所示。

圖10 超高壓時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX活力的影響Fig. 10 Effect of UHP processing time on LOX activity in silver carp muscle

如圖10所示，隨著超高壓時(shí)間延長(zhǎng)，LOX活力整體呈下降趨勢(shì)，在0～20 min之間，酶活力下降顯著，壓力大于20 min時(shí)，酶活力趨于穩(wěn)定，此時(shí)LOX已基本失活；用300 MPa超高壓分別處理白鰱魚(yú)肌肉LOX 5、10、15、20、25、30 min后，LOX活力分別下降60.34%、77.59%、87.93%、93.10%、93.10%、94.83%。

圖11 超高壓時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響Fig. 11 Effect of UHP processing time on the secondary conformation of LOX in silver carp muscle

圖11為白鰱魚(yú)肌肉LOX經(jīng)300 MPa超高壓處理不同時(shí)間后CD圖。隨著超高壓時(shí)間延長(zhǎng)，LOX在208、214 nm和222 nm波長(zhǎng)處特征吸收峰強(qiáng)度顯著下降，說(shuō)明LOX內(nèi)α-螺旋、β-折疊含量明顯下降，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大變化。而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，LOX在208、214 nm和222 nm波長(zhǎng)處特征吸收峰強(qiáng)度在5 min時(shí)極為顯著顯的變化，5～30 min時(shí)，LOX的特征吸收峰強(qiáng)度呈逐漸降低的趨勢(shì)，結(jié)合超高壓作用機(jī)理，可以得出主要原因是超高壓作用使LOX分子構(gòu)象改變主要發(fā)生在超高壓加壓和泄壓過(guò)程中，延長(zhǎng)超高壓時(shí)間時(shí)，加壓和泄壓時(shí)間不變，只是維持穩(wěn)壓的時(shí)間延長(zhǎng)，因此變化趨勢(shì)相較于0～5 min明顯降低。

圖12為白鰱魚(yú)肌肉LOX經(jīng)300 MPa超高壓處理不同時(shí)間后熒光光譜圖。隨著超高壓時(shí)間延長(zhǎng)，LOX分子內(nèi)部暴露出來(lái)的Trp在超高壓作用下又被包埋在蛋白質(zhì)側(cè)鏈中，不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源熒光，使LOX在344 nm波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度顯著減弱，說(shuō)明LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，包埋作用越明顯，LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)變化越顯著。因此，結(jié)合白鰱魚(yú)肌肉LOX活力與分子結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)可以明顯得出，LOX活性與其分子結(jié)構(gòu)有著極為密切的聯(lián)系，增加超高壓壓力、延長(zhǎng)超聲時(shí)間能夠使白鰱魚(yú)肌肉LOX分子內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生極為顯著的變化，進(jìn)而使LOX活力大大降低。

圖12 超高壓時(shí)間對(duì)白鰱魚(yú)肌肉LOX三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的影響Fig. 12 Effect of UHP processing time on the tertiary conformation of LOX in silver carp muscle

3 結(jié) 論

本研究以白鰱魚(yú)肌肉LOX為原料，研究了其在不同超聲波和超高壓條件下酶活力、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著超聲波功率的增加、時(shí)間延長(zhǎng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生變化，使LOX活力不斷降低，3 h后隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)酶活力下降不明顯且能耗增加，所以選取最適超聲條件為300 W、3 h，但從酶活力變化趨勢(shì)可知，超聲波作用較為緩慢，時(shí)間較長(zhǎng)，并且引起的熱效應(yīng)明顯，因此超聲波可作為改變LOX構(gòu)象，抑制LOX活力，改變白鰱魚(yú)肌肉多不飽和脂肪酸氧化調(diào)控的輔助條件；隨著超高壓壓力的增加、時(shí)間的延長(zhǎng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，LOX活力迅速降低，綜合考慮處理?xiàng)l件對(duì)酶活性的影響和能耗，選取最適超高壓條件為300 MPa、20 min。超高壓作用迅速、時(shí)間短，熱效應(yīng)可忽略不計(jì)，因此超高壓可作為破壞LOX構(gòu)象、抑制LOX活力、調(diào)控白鰱魚(yú)肌肉多不飽和脂肪酸氧化的重要條件；但其對(duì)設(shè)備要求較高，所以其用于工業(yè)化還有一段距離。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可為白鰱魚(yú)的土腥味控制和精深加工提供參考。

[1] 葉川, 閆虹, 范選嬌, 等. 富鈣白鰱魚(yú)糜凝膠的制備及其營(yíng)養(yǎng)分析[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2016, 32(2): 227-234. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.2.034.

[2] URESTI R M, TELLEZ-LUIS S J, RAMIREZ J A, et al. Use of dairy proteinsand microbial transglutaminase to obtain low-salt fish products from filleting waste from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)[J]. Food Chemistry, 2004, 86(2): 257-262. DOI:10.1016/j.foodchem.2003.09.033.

[3] 任麗娜. 白鰱魚(yú)肉肌原纖維蛋白冷凍變性的研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2014: 1-2.

[4] 楊玉平. 鰱魚(yú)體內(nèi)土腥味物質(zhì)鑒定及分析方法與脫腥技術(shù)研究[D].武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010: 2-3.

[5] FU X J, XU S Y, WANG Z. Kinetics of lipid oxidation and offodor formation in silver carp mince: the effect of lipoxygenase and hemoglobin[J]. Food Research International, 2009, 42(1): 85-90.DOI:10.1016/j.foodres.2008.09.004.

[6] FU X J, LI Q L, XU S Y, et al. Effect of drying methods and antioxidants on the flavor and lipid oxidation of silver carp slices[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 61(1): 251-257. DOI:10.1016/j.lwt.2014.10.035.

[7] LU W Q, ZHAO X, XU Z Y, et al. Development of a new colorimetric assay for lipoxygenase activity[J]. Analytical Biochemistry, 2013, 441(2):162-168. DOI:10.1016/j.ab.2013.06.007.

[8] 楊文鴿, 薛長(zhǎng)湖, 何雄, 等. 南美白對(duì)蝦血淋巴脂肪氧合酶的分離純化及其生化特性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2006, 6(3): 31-37.DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2006.03.006.

[9] SAE-LEAW T, BENJAKUL S. Fatty acid composition, lipid oxidation,and ベshy odour development in seabass (Lates calcarifer) skin during iced storage[J]. European Journal of Lipid Science and Technology, 2014,116(7): 885-894. DOI:10.1002/ejlt.201300381.

[10] 劉奇. 鱘魚(yú)腥味物質(zhì)特征及其與脂肪酸氧化的關(guān)系研究[D]. 青島:中國(guó)海洋大學(xué), 2013: 8-9.

[11] GAO R C, YUAN L, YU M S, et al. Effects of heat pump drying parameters on the volatile ぼavor compounds in silver carp[J]. Journal of Aquatic Food Product Technology, 2016, 25(5): 735-744. DOI:10.1080/10498850.2014.923082.

[12] 謝秀玲, 李欣, 高金燕, 等. 非熱加工對(duì)食物過(guò)敏原影響的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(17): 344-349. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201317072.

[13] 王薇薇, 孟廷廷, 郭丹釗, 等. 食品加工中超聲波生物學(xué)效應(yīng)的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(2): 379-383. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.074.

[14] 劉平, 胡志和, 吳子健, 等. 超高壓對(duì)木瓜蛋白酶構(gòu)象及酶活力的影響[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(23): 23-27. DOI:10.7506/spkxl002-6630-201523005.

[15] FENG Liping, CAO Yanping, XU Duoxia, et al. Inぼuence of sodium alginate pretreated by ultrasound on papain properties: activity,structure, conformation and molecular weight and distribution[J].Ultrasonics Sonochemistry, 2016, 32: 224-230. DOI:10.1016/j.ultsonch.2016.03.015.

[16] HUANG Y C, WANG Y R, WU Z M, et al. Combined eあects of highpressure and thermal treatments on lipid oxidation and enzymes in pork[J]. Food Science and Biotechnology, 2016, 25(1): 261-266.DOI:10.1007/s10068-016-0038-2.

[17] YI J Y, JIANG B, ZHANG Z, et al. Effect of ultrahigh hydrostatic pressure on the activity and structure of mushroom (Agaricus bisporus)polyphenoloxidase[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012, 60(2): 593-599. DOI:10.1021/jf203405u.

[18] LU Y J, LIU C C, ZHAO M M, et al. Structure and activity changes of phytohemagglutinin from red kidney bean (Phaseolus vulgaris)affected by ultrahigh-pressure treatments[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(43): 9513-9519. DOI:10.1021/acs.jafc.5b03337.

[19] 劉平, 胡志和, 吳子健, 等. 超高壓處理菠蘿蛋白酶引發(fā)構(gòu)象變化與酶活力的關(guān)系[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(21): 138-142. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201421027.

[20] GATA J L, PINTO M C, MACIAS P. Lipoxygenase activity in pig muscle: purification and partial characterization[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44(9): 2573-2577.DOI:10.1021/jf960149n.

[21] 付湘晉. 白鰱魚(yú)脫腥及其低鹽魚(yú)糜制備的研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué),2009: 39-40.

[22] KOUASSI G K, ANANTHESWARAN R C, KNABEL S J, et al.Eあect of high-pressure processing on activity and structure of alkaline phosphatase and lactate dehydrogenase in buあer and milk[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(23): 9520-9529.DOI:10.1021/jf071518q.

[23] ZHONG K, HU X S, WU J H, et al. Effects of high pulsed electric field on the secondary and tertiary structure of lipoxygenase[J].Spectroscopy and Spectral Analysis, 2009, 29(3): 765-768.DOI:10.3964/j.issn.1000-0593(2009)03-0765-04.

[24] 邱春江. 超高壓對(duì)鰱魚(yú)中關(guān)鍵酶與結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)影響的研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2014: 49-50.

[25] LI Y X, WANG J P, JIAO, A Q, et al. A study on the potential interaction between cyclodextrin and lipoxygenase[J]. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2013, 76(1): 107-111. DOI:10.1007/s10847-012-0178-9.

[26] BONAVITA A, CARRATORE V, CIARDIELLO M A, et al. Inぼuence of pH on the structure and function of kiwi pectin methylesterase inhibitor[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64(29):5866-5876. DOI:10.1021/acs.jafc.6b01718.

[27] 王靜, 金征宇, 江波, 等. Aspergillus ficuum菊粉酶的熒光光譜研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(23): 237-241. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.23.053.

[28] PINTO M D, DUQUE A L, MACIAS P. Fluorescence quenching study on the interaction between quercetin and lipoxygenase[J]. Journal of Fluorescence, 2011, 21(3): 1311-1318. DOI:10.1007/s10895-010-0816-9.

[29] PINTO M D, DUQUE A L, MACIAS P. Fluorescence spectroscopic study on the interaction of resveratrol with lipoxygenase[J]. Journal of Molecular Structure, 2010, 980(1/2/3): 143-148. DOI:10.1016/j.molstruc.2010.07.006.

[30] HUANG Y C, GAN Y, LI F. Eあects of high pressure in combination with thermal treatment on lipid hydrolysis and oxidation in pork[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 63(1): 136-143.DOI:10.1016/j.lwt.2015.03.103.

[31] 黃群, 金永國(guó), 馬美湖, 等. 超高壓處理對(duì)S-卵白蛋白構(gòu)象與功能特性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2013, 44(3): 161-166. DOI:10.6041/j.issn.1000-1298.2013.03.030.