曠 慧，馮建文，范 倩，王 萍，王金玲*

紅樹(shù)莓（Rubus ideaus L.）為薔薇科漿果，因其富含各種基本營(yíng)養(yǎng)成分和功能活性成分，在世界上享有“黃金水果”的聲譽(yù)[1-2]。大量研究表明，紅樹(shù)莓中的多酚類(lèi)化合物如黃酮、酚酸、花色苷、鞣花酸等物質(zhì)與其抗氧化、抗腫瘤、降血脂、預(yù)防心血管疾病等生物學(xué)功能密切相關(guān)[3-5]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅樹(shù)莓酚類(lèi)物質(zhì)中花色苷的結(jié)構(gòu)研究比較多。Patras等[3]研究結(jié)果表明，樹(shù)莓中花色苷主要是由花青素-3-葡萄糖苷、花葵素-3-葡萄糖苷和花葵素-3-蕓香糖苷組成。Kula等[6]研究結(jié)果表明矢車(chē)菊素-3-槐糖苷是紅樹(shù)莓花色苷中的主要組成成分。李蕊等[7]在野生紅樹(shù)莓花色苷中鑒定出了9 種花色苷，包括矢車(chē)菊-3,5-雙葡萄糖苷、矢車(chē)菊-3-雙半乳糖苷、矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷、矢車(chē)菊-3-蕓香糖苷、矢車(chē)菊-3-阿拉伯糖苷等。但對(duì)于其酚類(lèi)物質(zhì)的組成研究較少。

脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是生物體內(nèi)多不飽和脂肪酸常見(jiàn)的氧化反應(yīng)，過(guò)量的氧化產(chǎn)物會(huì)攻擊生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、核酸等，造成分子、細(xì)胞和器官的損傷，從而誘發(fā)心血管病、心臟病、癌癥等疾病[8]。由于天然多酚化合物分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)具有生物活性的基團(tuán)如羥基，使其具有預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝、降血脂等生理功能[9-10]。目前對(duì)紅樹(shù)莓中活性成分的功能性研究主要集中在清除自由基、抗增殖、抑菌等功能上，而對(duì)其抗脂質(zhì)過(guò)氧化功能的研究報(bào)道較少。

本研究主要通過(guò)采用紫外分光光度法、紅外光譜法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，分析了‘菲爾杜德’紅樹(shù)莓多酚粗提液和純化液的組成成分，同時(shí)采用3 個(gè)體外抗脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)研究了其抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性，為開(kāi)發(fā)、應(yīng)用紅樹(shù)莓中的活性物質(zhì)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)Wistar雄性大鼠2 只，周齡8 周，體質(zhì)量分別為162.5 g和167.5 g，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（黑）2015-003，動(dòng)物使用許可證號(hào)：黑動(dòng)字第P00700619。

‘菲爾杜德’紅樹(shù)莓采自黑龍江省尚志市，速凍處理后運(yùn)回東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室凍藏。

標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸、原花青素B2、蘆丁、水楊酸、鞣花酸、茶多酚、沒(méi)食子酸、阿魏酸、表兒茶素、綠原酸、樹(shù)莓酮、兒茶素、槲皮素（色譜級(jí)，純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Thermo Fisher公司；溴化鉀、過(guò)氧化氫、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、抗壞血酸等 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；三氯化鐵、硫酸亞鐵 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-C型水浴恒溫振蕩器 上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ALC-1104電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FW-4粉末壓片機(jī) 天津市拓普儀器有限公司；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）美國(guó)Thermo Fisher公司；1260 HPLC儀 安捷倫科技有限公司；722S可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹(shù)莓多酚粗提液的制備

按照參考文獻(xiàn)[11]中的最佳工藝參數(shù)提取紅樹(shù)莓多酚。提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%（pH 6）、提取溫度45 ℃、料液比1∶6（m/V）、提取時(shí)間3.5 h、提取2 次，在此條件下多酚提取量為（373.78±4.08）mg/100 g。得到的多酚提取液減壓濃縮（0.1 MPa，45 ℃），冷藏備用，多酚純度為（3.94±0.28）%。

1.3.2 紅樹(shù)莓多酚純化液的制備

[12]方法，先用無(wú)水乙醇將1.3.1節(jié)中得到紅樹(shù)莓多酚粗提液進(jìn)行除雜實(shí)驗(yàn)（無(wú)水乙醇-多酚粗提液體積比1∶1，4 ℃條件下靜置24 h，離心，上清液于45 ℃、0.1 MPa減壓濃縮，冷藏后備用），再通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定較佳的優(yōu)化工藝為：選擇X-5大孔樹(shù)脂用來(lái)純化紅樹(shù)莓多酚粗提液；采用徑高比1∶14、上樣質(zhì)量濃度1.4 mg/mL、上樣量100 mL、樣液pH 3、流速0.5 BV/h的條件進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附24 h；吸附飽和平衡后，先用500 mL蒸餾水洗雜，再用200 mL pH 6的70%乙醇溶液以1.0 BV/h的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫。收集第30～50 mL的多酚洗脫液，45 ℃、0.1 MPa減壓濃縮，冷藏備用，多酚純度為（35.79±2.17）%。

1.3.3 多酚含量的測(cè)定

參考Pantelidis等[13]方法，采用福林-酚法，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，溶液吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝9.917 7x＋0.036 0（R2＝0.998 7）。

1.3.4 紅樹(shù)莓多酚的紫外光譜分析

分別將紅樹(shù)莓多酚的粗提液、純化液用甲醇稀釋成多酚質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL（以沒(méi)食子酸計(jì)）溶液，在190～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光掃描，得到紅樹(shù)莓多酚的紫外光譜圖。

1.3.5 紅樹(shù)莓多酚的FT-IR分析

分別將紅樹(shù)莓多酚的粗提液、純化液放入烘箱中干燥8 h（65 ℃）。取1～2 mg多酚樣品與200 mg烘干后的溴化鉀混合均勻，研磨至粒度小于2 μm的混合粉末。將粉末放入壓片機(jī)內(nèi)壓制成均勻透明的薄片，再將壓片放入樣品槽中，用紅外光譜儀于波長(zhǎng)400 0～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，得到FT-IR圖[14]。

1.3.6 紅樹(shù)莓多酚的HPLC分析

將紅樹(shù)莓多酚粗提液和純化液分別用甲醇稀釋成多酚質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL（以沒(méi)食子酸計(jì)）溶液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后用于HPLC分析[15]。將原花青素B2、蘆丁、鞣花酸、水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇稀釋成0.1 mg/mL溶液。

色譜條件[15]：5TC-C18柱：250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相采用甲醇（A）-純水（B）進(jìn)行梯度洗脫：0～10 min：26% A、74% B；10.1～25.0 min：50% A、50% B；流速為1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；每次進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.7 紅樹(shù)莓多酚的抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性分析

1.3.7.1 對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

以Fe2＋誘發(fā)卵黃磷脂C2位上的極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、過(guò)不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的過(guò)氧化模型，參考文獻(xiàn)[16]方法并略作改進(jìn)，用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法測(cè)定樣品中丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量（代表脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度）。卵黃懸液：新鮮雞蛋去除蛋清，卵黃用等體積pH 7.45，0.l mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配成1∶1（m/m）懸液，磁力攪拌10 min，再用PBS稀釋成1∶25（m/m）的懸液，冷藏備用。

測(cè)定方法：在離心管中依次加入0.4 mL卵黃懸液，0.1 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液，0.4 mL 25 mmol/L FeSO4，3.1 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.45），混勻于37 ℃恒溫振蕩15 min，取出后加入l mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液和l mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的TBA溶液，沸水浴15 min，冷卻后，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定MDA-TBA復(fù)合物吸光度，按照式（1）計(jì)算抑制率。

式中：A1為0.1 mL PBS緩沖液的吸光度；A樣為樣品的吸光度。以VC和茶多酚做陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.7.2 對(duì)H2O2誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響

H2O2會(huì)引起紅細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用而導(dǎo)致溶血。參考文獻(xiàn)[17]方法并略作改進(jìn)，測(cè)定MDA含量來(lái)研究其脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度。紅細(xì)胞懸浮液：大鼠禁食（自由飲水）12 h后眼眶取血，肝素抗凝，4 ℃、3 000 r/min離心得到紅細(xì)胞，冷生理鹽水洗3 次，用生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的紅細(xì)胞懸浮液。

測(cè)定方法：在試管中依次加入0.5%紅細(xì)胞懸浮液1 mL，不同質(zhì)量濃度樣品溶液0.2 mL，100 mmol/L的H2O20.1 mL混勻啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴中反應(yīng)l h后，用生理鹽水稀釋6 倍，3 000 r/min離心5 min，取上清液于415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按照式（2）計(jì)算抑制率。

式中：A2為生理鹽水的吸光度；A樣為樣品的吸光度。以VC和茶多酚為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.7.3 對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

通過(guò)測(cè)定MDA含量高低直接反映肝細(xì)胞受自由基攻擊的程度，參考文獻(xiàn)[18]方法并略作改進(jìn)。大鼠肝臟勻漿：大鼠禁食（自由飲水）12 h后頸椎脫臼法處死，迅速取出肝臟，置于4 ℃生理鹽水中反復(fù)漂洗去除血液，剔除脂肪及結(jié)締組織，用濾紙吸干水分，稱(chēng)質(zhì)量。然后剪碎，在冰浴條件下將已剝離處理好的臟器定量置于勻漿器中，用生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿。以3 000 r/min在4 ℃離心5 min，取上清液備用（用時(shí)以生理鹽水稀釋?zhuān)?/p>

測(cè)定方法：分別取1 mL 5%新鮮肝組織勻漿液，加入1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，置于37 ℃水浴1 h，取出后加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的TCA終止反應(yīng)，再加入 l mL 0.5% TBA，搖勻。加塞放入沸水浴中煮沸30 min，迅速冷卻后，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定MDA-TBA復(fù)合物的吸光度，按照式（3）計(jì)算抑制率。

式中：A3為以生理鹽水代替樣品的吸光度；A樣為樣品的吸光度。以VC和茶多酚為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹(shù)莓多酚的紫外-可見(jiàn)光譜

由圖1可知，紅樹(shù)莓多酚粗提液和純化液的紫外-可見(jiàn)光譜圖均有2 個(gè)吸收峰：一個(gè)在200～300 nm波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)（分別為244、242 nm），為黃酮、花色苷物質(zhì)的特征吸收峰；另一個(gè)在500～600 nm波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的吸收峰，為花色苷的特征吸收峰[19]，但在此處的吸收峰較弱。初步判斷紅樹(shù)莓多酚提取液中含有黃酮、花色苷物質(zhì)。在多酚濃度相同時(shí)，紅樹(shù)莓多酚粗提液比純化液在200～300 nm波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的吸收峰更強(qiáng)，而在500～600 nm波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)吸收峰相對(duì)較弱，說(shuō)明在相同濃度下，粗提液中含有較多的黃酮類(lèi)物質(zhì)，而純化液中含有更多的花色苷物質(zhì)。

2.2 紅樹(shù)莓多酚的FT-IR譜圖

圖2 紅樹(shù)莓多酚粗提液和純化液的FT-IR譜圖Fig. 2 FT-IR spectra of crude and puriベed polyphenols from red raspberry

由圖2可知，紅樹(shù)莓多酚粗提液在1 720 cm-1處有明顯的吸收峰，為羰基C═O伸縮振動(dòng)吸收峰，其吸收峰可能歸屬于黃酮類(lèi)物質(zhì)[20]；粗提物和純化液分別在1 622、1 620 cm-1處有吸收峰，可能同時(shí)包含共軛羰基C═O的伸縮振動(dòng)、C-H的彎曲振動(dòng)、C-N的伸縮振動(dòng)吸收峰以及芳香族環(huán)的骨架振動(dòng)吸收，其吸收峰可能主要?dú)w屬于黃酮類(lèi)[21]。多酚粗提物和純化液在1 450～1 400 cm-1附近都有明顯的吸收峰，可能主要?dú)w屬于糖苷類(lèi)物質(zhì)，且經(jīng)過(guò)X-5大孔樹(shù)脂純化后，能除去部分糖苷類(lèi)物質(zhì)；而在900～650 cm-1附近的多個(gè)吸收峰表明其可能含有苯環(huán)，且苯環(huán)上可能含有多個(gè)取代結(jié)構(gòu)[21]。

2.3 紅樹(shù)莓多酚的HPLC分析

圖3 多酚標(biāo)準(zhǔn)品（A）、紅樹(shù)莓多酚粗提液（B）和紅樹(shù)莓多酚純化液（C）的HPLC色譜圖Fig. 3 HPLC proベles of four phenolic standards (A), crude polyphenols (B)and puriベed polyphenols (C) from red raspberry

如圖3所示，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖對(duì)比，紅樹(shù)莓多酚粗提物和純化物中主要含有原花青素B2（峰1）、蘆丁（峰2）、水楊酸（峰3）和鞣花酸（峰4），其中蘆丁和鞣花酸的含量相對(duì)較高，水楊酸的含量相對(duì)較少（圖3B和圖3C）。與粗提物相比，紅樹(shù)莓多酚純化液中原花青素B2的吸收峰明顯增大，其他3 種物質(zhì)的吸收峰變化不大。在紅樹(shù)莓多酚粗提液HPLC圖中，當(dāng)保留時(shí)間為5.045 min時(shí)，出現(xiàn)一個(gè)峰面積為188.779 mAU?s的未知峰；經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后，其保留時(shí)間為5.051 min，峰面積下降至7.663 mAU?s。在紅樹(shù)莓多酚粗提液的HPLC圖中，當(dāng)保留時(shí)間分別為22.499 min和23.503 min時(shí)，均有一個(gè)未知物質(zhì)，吸收峰明顯；且經(jīng)過(guò)純化后，該2 處吸收峰的保留時(shí)間略提前，峰面積均變小。通過(guò)與其他標(biāo)準(zhǔn)品（沒(méi)食子酸、阿魏酸、表兒茶素、綠原酸、樹(shù)莓酮、兒茶素和槲皮素）在此條件下的出峰時(shí)間對(duì)比，均未與這3 個(gè)未知物質(zhì)峰匹配成功，仍需改變梯度洗脫條件、優(yōu)化提取和純化方法、采用靈敏度更高的方法進(jìn)一步鑒定分析紅樹(shù)莓多酚的未知組成成分。紅樹(shù)莓多酚的HPLC分析結(jié)果表明紅樹(shù)莓多酚的液相色譜圖出峰較多，說(shuō)明其組成成分復(fù)雜。

2.4 紅樹(shù)莓多酚的抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性

2.4.1 對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

圖4 紅樹(shù)莓多酚對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effects of red raspberry polyphenols on Fe2+-induced lipid peroxidation in yolk lipoprotein

由圖4可知，紅樹(shù)莓多酚對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率與多酚質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)成正比，超過(guò)一定質(zhì)量濃度后，成反比關(guān)系。在相同條件下，紅樹(shù)莓多酚粗提液對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率大于純化液，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，粗提液對(duì)其抑制率已達(dá)到（54.87±1.95）%；當(dāng)質(zhì)量濃度增大到300 μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到最大值（78.83±1.35）%，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。當(dāng)紅樹(shù)莓多酚純化液質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，其對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率也達(dá)到最大值，為（53.33±1.17）%。VC對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用與純化液相似，當(dāng)質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)，抑制率最大值為（52.48±1.58）%，超過(guò)此質(zhì)量濃度時(shí)，抑制率隨著質(zhì)量濃度的增大而下降。而茶多酚對(duì)其抑制作用相對(duì)較弱，當(dāng)質(zhì)量濃度高達(dá)400 μg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到最大值，僅為（39.10±1.40）%。

2.4.2 對(duì)H2O2誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用

圖5 紅樹(shù)莓多酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用Fig. 5 Inhibitory effects of red raspberry polyphenols on H2O2-induced hemolysis of rat red blood cells

由圖5可知，紅樹(shù)莓多酚粗提液對(duì)H2O2誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用最顯著，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，其抑制率已達(dá)到（44.98±2.24）%，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，其抑制率隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，但當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到75 μg/mL時(shí)，其抑制率保持平穩(wěn)，高達(dá)（61.49±1.13）%。多酚純化液對(duì)H2O2誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用較弱，當(dāng)質(zhì)量濃度為7 5 μg/m L時(shí)，其抑制率達(dá)到最大值，僅為（28.32±1.68）%，而后隨著質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，其抑制率反而下降。VC對(duì)H2O2誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用在高質(zhì)量濃度時(shí)較明顯，當(dāng)VC質(zhì)量濃度在150～500 μg/mL時(shí)，其抑制率隨著質(zhì)量濃度的增大而平緩增大；當(dāng)質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到最大值（35.22±1.46）%。而茶多酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用相對(duì)最弱。

2.4.3 對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

由圖6可知，紅樹(shù)莓多酚對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率與多酚質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)成正比；超過(guò)一定質(zhì)量濃度后，成反比關(guān)系。在所有實(shí)驗(yàn)組中，茶多酚對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用最為明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到最大值（83.63±0.66）%，明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組。紅樹(shù)莓多酚粗提液對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用略強(qiáng)于純化液，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，其抑制率都達(dá)到最大值，分別為（65.48±1.46）%、（59.68±0.22）%。VC對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用相對(duì)較弱，當(dāng)質(zhì)量濃度高達(dá)1 500 μg/mL時(shí)，其抑制率最高，僅為（48.67±1.09）%（相關(guān)數(shù)據(jù)未在圖中體現(xiàn)）。當(dāng)紅樹(shù)莓多酚粗提液和純化液質(zhì)量濃度從50 μg/mL升高到100 μg/mL時(shí)，兩者對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率均隨著質(zhì)量濃度的增大而增大；紅樹(shù)莓多酚對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用在低質(zhì)量濃度時(shí)（＜100 μg/mL）效果明顯，且呈現(xiàn)一定劑量依賴(lài)關(guān)系，國(guó)內(nèi)有類(lèi)似的報(bào)道。孫靜[22]研究表明木犀草素具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，當(dāng)質(zhì)量濃度在10～30 μg/mL時(shí)，其對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞溶血的抑制作用與質(zhì)量濃度成正比；同時(shí)，當(dāng)質(zhì)量濃度在10～45 μg/mL時(shí)，其對(duì)腦勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制作用與質(zhì)量濃度也成正比。尹學(xué)哲等[23]研究發(fā)現(xiàn)大豆皂醇在低質(zhì)量濃度時(shí)（0.17～1.00 mg/L）與H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化抑制作用成正比，并呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。

圖6 紅樹(shù)莓多酚對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig. 6 Inhibitory effects of red raspberry polyphenols on spontaneous lipid peroxidation in hepatic tissue homogenate of rats

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用紫外-可見(jiàn)光譜、FT-IR光譜、HPLC法分析紅樹(shù)莓多酚的組成，目前只鑒定出紅樹(shù)莓多酚中含有原花青素B2、蘆丁、水楊酸和鞣花酸這4 種酚類(lèi)物質(zhì)，國(guó)內(nèi)外有類(lèi)似的報(bào)道，但本研究中鑒定出來(lái)的多酚組分相對(duì)較少。孟實(shí)等[24]以遼寧沈陽(yáng)產(chǎn)地的紅樹(shù)莓果實(shí)凍干粉和河南封丘縣產(chǎn)地的黑樹(shù)莓凍干粉為研究對(duì)象，采用95 %乙醇超聲波方法提取其多酚物質(zhì)，采用HPLC法（用Kromasil C18色譜柱分析，流動(dòng)相采用色譜純乙腈（A）-含0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm）分析其多酚物質(zhì)并對(duì)紅樹(shù)莓和黑樹(shù)莓中的活性成分進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在紅樹(shù)莓中檢測(cè)到了沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、矢車(chē)菊素、鞣花酸、樹(shù)莓酮、白藜蘆醇及水楊酸，其中兒茶素高達(dá)4.81 μg/g（以干質(zhì)量計(jì)，下同）、原花青素B2為1.94 μg/g，但白藜蘆醇和水楊酸含量很少，僅分別為0.02 μg/g、0.07 μg/g；而黑樹(shù)莓中除了不含有白藜蘆醇和水楊酸外，其余8 種酚類(lèi)物質(zhì)均存在，且兒茶素高達(dá)11.76 μg/g、沒(méi)食子酸1.02 μg/g，但表兒茶素含量?jī)H為0.05 μg/g。張成濤等[1]以遼寧新大地種植的紅樹(shù)莓果實(shí)為研究對(duì)象，紅樹(shù)莓中樹(shù)莓酮采用氯仿加熱回流提取3 次，采用HPLC法（用CAPCELL PAK C18色譜柱分析，流動(dòng)相采用甲醇-水（體積比30∶70）洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm）檢測(cè)其樹(shù)莓酮含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其樹(shù)莓酮平均含量分別為3.32 μg/g（以鮮質(zhì)量計(jì)）。Kula等[6]以波蘭Brzezna地區(qū)產(chǎn)地的11 種紅樹(shù)莓凍干粉為研究對(duì)象，采用甲醇為溶劑，超聲波法提取其多酚物質(zhì)，采用HPLC-二極管陣列檢測(cè)器連用電噴霧電離質(zhì)譜檢測(cè)法（用Discovery HS C18色譜柱分析，流動(dòng)相乙腈（A）（0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈為50∶50，V∶V）-含0.1% TFA水溶液（B）梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm）測(cè)定其多酚物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種紅樹(shù)莓中花色苷含量存在顯著差異，且矢車(chē)菊素-3-槐糖苷是其花色苷的主要組成成分；黑樹(shù)莓中花色苷含量是紅樹(shù)莓的4～11 倍，且主要由矢車(chē)菊素-3-蕓香糖苷和矢車(chē)菊素-3-O-木糖鼠李糖苷組成；且兩者中鞣花酸主要由單寧Sanguiin H-6組成，同時(shí)首次在黑樹(shù)莓中檢測(cè)到了原花青素B1和原花青素B2。在這些研究中可能由于所采用的紅樹(shù)莓品種、檢測(cè)方法、洗脫條件、樣品處理方法、儀器設(shè)備等條件的差異而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異。通過(guò)改變檢測(cè)設(shè)備和洗脫條件、優(yōu)化提取純化條件、提高樣品純度等方法可能會(huì)在本研究中鑒定出更多的多酚物質(zhì)組成成分。

在研究紅樹(shù)莓多酚的抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性中發(fā)現(xiàn)紅樹(shù)莓多酚抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力與多酚質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)成正比；超過(guò)一定質(zhì)量濃度后，其抑制率呈反比例關(guān)系，國(guó)內(nèi)外也有類(lèi)似的報(bào)道。孫靜[22]研究發(fā)現(xiàn)金合歡苷對(duì)紅細(xì)胞溶血的抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)其濃度為0.67 mmol/L時(shí)抑制率為38.31%，但繼續(xù)加大濃度抑制率反而下降。代斌[25]研究表明五倍子提取物能抑制線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)大鼠肝線粒體膜有較好的保護(hù)作用；在0.01～0.10 mg/mL范圍內(nèi)，其對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率為在（56.62±2.4）%～（71.37±3.7）%之間，呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)關(guān)系；當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，抑制作用基本無(wú)變化，同時(shí)在更高質(zhì)量濃度（＞1 mg/mL）和更低質(zhì)量濃度（＜0.005 mg/mL）時(shí)無(wú)法測(cè)定出結(jié)果。Costa等[26]研究了薰衣草提取物抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，結(jié)果表明其對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)的白鼠大腦勻漿脂質(zhì)氧化具有抑制作用，在提取物質(zhì)量濃度為0.0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，抑制率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系；但當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時(shí)，其抑制率隨著質(zhì)量濃度的增大而保持平緩。天然活性成分提取物的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能與樣液質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)引起反應(yīng)體系不穩(wěn)定、副反應(yīng)增多、雜質(zhì)干擾、底物濃度有限等因素有關(guān)[27]，但具體原因仍需進(jìn)一步研究。

酚類(lèi)成分與紅樹(shù)莓果實(shí)的生物活性密切相關(guān)，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)氧化作用的機(jī)制體現(xiàn)[28]。前期體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究證明，紅樹(shù)莓提取物中的活性成分，如酚酸、黃酮類(lèi)化合物、花色苷、鞣花酸等酚類(lèi)物質(zhì)具有良好的抗氧化活性、抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性[29-30]。本研究表明，紅樹(shù)莓多酚提取物對(duì)氧化活性基團(tuán)誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化均有抑制作用，這可能與其含有的多酚物質(zhì)密切相關(guān)，但其作用機(jī)制和途徑仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

組分分析結(jié)果表明紅樹(shù)莓多酚中可能含有黃酮類(lèi)、花色苷、糖苷類(lèi)物質(zhì)，HPLC法初步鑒定出紅樹(shù)莓多酚中含有原花青素B2、蘆丁、水楊酸和鞣花酸4 種酚類(lèi)物質(zhì)，且紅樹(shù)莓多酚粗提液和純化液中多酚組成具有差異性，但其他多酚組成如沒(méi)食子酸、阿魏酸、表兒茶素、綠原酸、樹(shù)莓酮、兒茶素和槲皮素等仍需進(jìn)一步定性、定量分析。抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性結(jié)果表明在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紅樹(shù)莓多酚具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性。紅樹(shù)莓多酚對(duì)Fe2＋誘導(dǎo)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化具有抑制作用，當(dāng)多酚粗提液質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到最大值（78.83±1.35）%；VC對(duì)其抑制作用與多酚純化液接近。紅樹(shù)莓多酚粗提液對(duì)H2O2誘導(dǎo)大鼠紅細(xì)胞氧化溶血作用強(qiáng)于VC和茶多酚，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度達(dá)到75 μg/mL時(shí)，抑制率最大（61.49±1.13）%，在此質(zhì)量濃度條件下多酚純化液對(duì)其抑制率也達(dá)到最大值，但僅為（28.32±1.68）%。茶多酚對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用最為明顯，其抑制率最高可達(dá)（83.63±0.66）%（質(zhì)量濃度為300 μg/mL）；紅樹(shù)莓多酚粗提液和純化液對(duì)大鼠肝組織勻漿自發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化具有抑制作用，且強(qiáng)于VC，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1 0 0 μg/m L時(shí)，其抑制率均最高，分別為（65.48±1.46）%、（59.68±0.22）%。結(jié)果表明紅樹(shù)莓多酚粗提液的抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性強(qiáng)于純化液，但紅樹(shù)莓多酚的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用機(jī)制和途徑仍需進(jìn)一步研究。

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