張?zhí)N哲，楊倩，馬曉燕，楊瀾，張偉，，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學理工學院，河北滄州061100）

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica，Y.enterocolitica）作為一種食源性的病原菌，是革蘭氏陰性菌，不產(chǎn)芽孢，菌體外無莢膜，菌體周圍有周鞭毛生長[1]。該菌廣泛存在于各種動物的體內(nèi)，動物可長期攜帶該菌并通過糞便排出，進而引起食品的污染[2]。Y.enterocolitica是一種嗜冷菌，在0℃也可存活并緩慢生長。在冷藏過程中可能被Y.enterocolitica污染的肉制品，會增加家中兒童與該菌直接接觸的概率[2-3]。由肉制品感染給兒童的過程是亞洲人群感染耶氏菌的主要途徑[4]。因此，建立一種高效、快速的檢測食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法，對于保障人類健康和食品安全顯得尤為迫切。

目前國內(nèi)檢測Y.enterocolitica的方法以傳統(tǒng)生化培養(yǎng)方法為主，該種方法操作復雜、耗時長，不能滿足快速檢測的需求[5]?？焖贆z測Y.enterocolitica的方法有免疫學檢測方法和分子生物學檢測方法等。其中，分子生物學檢測方法包括聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）[6]、實時熒光 PCR[7-8]、環(huán)介導等溫擴增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）[5]、滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification，RCA）[9]等方法。PCR方法快速、靈敏，但結(jié)果的判定需要進行繁瑣的電泳，不利于在基層檢測機構(gòu)普及。

LAMP反應在具有鏈置換活性的DNA聚合酶催化下[10]，于恒溫條件中短時間即可完成靶基因的高效擴增，在微生物檢測領(lǐng)域有廣泛的應用。本研究在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，將熒光染料SYBR GreenⅠ加入反應體系。通過實時熒光監(jiān)測儀對熒光信號強度的搜集，實現(xiàn)實時定性檢測，建立實時熒光環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification，RF-LAMP）檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本試驗所用菌株見表1。

表1 試驗用菌種Table 1 Bacterial strains used in this study

1.1.2 樣品

雞肉：保定市某超市。

1.1.3 主要培養(yǎng)基和試劑

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。Bst DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶TaqⅠ、MgCl2和dNTPs：大連寶生物工程有限公司；甜菜堿和熒光試劑：Sigma公司；實時熒光LAMP內(nèi)、外引物合成于大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA大量提取試劑盒：北京華大基因科技股份有限公司。

1.1.4 主要儀器

數(shù)顯超級恒溫水浴鍋:金壇市杰瑞爾電器有限公司；DH6000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；實時熒光監(jiān)測儀：德國ESE Gmbh公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠；UVI pro凝膠成像系統(tǒng)：英國UVITEC公司；QYC-200全溫搖床：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；TGL-16G離心機：上海安亭科學儀器廠；Whatman T Gradient PCR擴增儀：德國Biometra公司。

1.2 方法

1.2.1 純菌的培養(yǎng)

取保藏的 Y.enterocolitica（CMCC 52302）接種于滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.2 DNA模板的制備

采用熱裂解法進行DNA模板的提取。

1）取過夜培養(yǎng)的菌懸液1.5 mL于滅菌離心管中，11 000 r/m離心1 min，將上清液棄去。

2）用100 μL滅菌水將菌體沉淀洗滌2次，然后再加入滅菌水100 μL，振蕩使菌體充分懸浮。

3）在沸水浴中將菌懸液煮沸10 min，取出離心，11 000 r/min離心1 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一新的滅菌離心管中，保存在-20℃，備用。

1.2.3 引物設(shè)計

引物設(shè)計的好壞直接影響反應的特異性和擴增效率[11]。對Genebank中已經(jīng)公布的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ail基因的序列進行同源性對比分析（基因號為AY004311.1）。針對Y.enterocolitica的保守序列利用在線設(shè)計軟件（http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）設(shè)計引物，最終確定的引物包括2條外引物（F3和B3）和2條內(nèi)引物（FIP和BIP），引物信息如表2所示。

1.2.4 實時熒光LAMP反應體系

外引物F3和B3為0.5 μmol/L、內(nèi)引物FIP和BIP為 3 μmol/L、dNTPs添加量為 2.5 μL、甜菜堿 1 mmol/L、MgSO4為 0.5 mmol/L、Bst DNA 聚合酶添加量為 1 μL、10×Bst DNA聚合酶緩沖液添加量為2.0 μL、模板DNA 1 μL、熒光染料 0.5 μL，無菌雙蒸水補足體積至 25 μL。擴增反應條件：62℃、60 min。

表2 實時熒光LAMP所用引物Table 2 Primers used in RF-LAMP

1.2.5 酶切分析實時熒光LAMP反應產(chǎn)物

對實時熒光LAMP產(chǎn)物進行酶切分析，用于驗證其產(chǎn)物的特異性[12]。具體反應體系如下：LAMP擴增產(chǎn)物為5 μL，Taq I buffer（10×）為2 μL，Taq I限制性內(nèi)切酶為2 μL，無菌雙蒸水補足體積至20 μL，輕輕混勻然后離心，37℃下保存1 h～16 h。酶切產(chǎn)物進行3.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并分析結(jié)果。

1.2.6 實時熒光LAMP的特異性

對表1所列特異性試驗菌株采用熱裂解法進行基因組DNA的提取，陰性對照以無菌雙蒸水作為模板。按照前述建立的實時熒光LAMP反應體系及程序進行反應，擴增后取5 μL擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，以驗證實時熒光LAMP引物的特異性。

1.2.7 實時熒光LAMP檢測純菌的靈敏度

用滅菌的生理鹽水對過夜培養(yǎng)的Y.enterocolitica菌液進行10倍系列梯度稀釋。將稀釋的菌液涂板計數(shù)，以確定其純培養(yǎng)物的活菌數(shù)。此外，每個稀釋度的菌液分別吸取1 mL，12 000 r/min離心1 min，棄去上清液，用1 mL生理鹽水將菌體沉淀懸浮，采用熱裂解法提取基因組DNA，進行實時熒光LAMP反應，以確定實時熒光LAMP反應的靈敏度。

1.2.8 實時熒光LAMP檢測人工污染雞肉的檢出限

在對雞肉進行Y.enterocolitica的人工污染前，按照國標法GB/T 4789.8-2016《食品微生物學檢驗——小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗》對雞肉進行檢測，確定雞肉中是沒有Y.enterocolitica存在的。取25 g均質(zhì)的雞肉，加入225 mL滅菌生理鹽水，制成雞肉勻漿液。用滅菌的生理鹽水對勻漿液進行10倍系列梯度稀釋，采用熱裂解法對每個稀釋度進行Y.enterocolitica基因組DNA的提取，用于實時熒光LAMP檢出限的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶切分析實時熒光LAMP反應產(chǎn)物

實時熒光LAMP反應產(chǎn)物是按照一定的方式生成的，通過酶切反應將反應產(chǎn)物的大小單一化，進而可以確定擴增是否準確[13]。本研究利用TaqⅠ限制性內(nèi)切酶，主要產(chǎn)生143 bp和197 bp的DNA片段。酶切結(jié)果如圖1所示，片段大小與理論值相符。

圖1 實時熒光LAMP擴增產(chǎn)物酶切分析Fig.1 Restriction analysis of the RF-LAMP products

2.2 實時熒光LAMP的特異性

實時熒光LAMP的特異性試驗見圖2。

圖2 實時熒光LAMP的特異性試驗Fig.2 The specificity test of RF-LAMP

從圖2中可以看出，用于實時熒光LAMP特異性試驗的13株試驗菌株中，1株Y.enterocolitica有明顯的擴增峰出現(xiàn)，儀器自動判定為陽性；其他12株非Y.enterocolitica菌檢測均未出現(xiàn)擴增峰，判定為陰性。表明本研究建立的方法特異性強。

2.3 實時熒光LAMP檢測純菌的靈敏度

實時熒光LAMP反應的靈敏度試驗見圖3。

圖3 實時熒光LAMP反應的靈敏度試驗Fig.3 Sensitivity test using RF-LAMP

如圖3所示，當Y.enterocolitica純培養(yǎng)物濃度為6.1×105CFU/mL~6.1×101CFU/mL 時，熒光曲線出現(xiàn)明顯的擴增峰，儀器自動判定為陽性；當濃度為6.1×100CFU/mL時，熒光曲線平緩，未出現(xiàn)擴增峰，判定為陰性。因此，本研究所建立實時熒光LAMP檢測Y.enterocolitica的靈敏度為61 CFU/mL。

2.4 實時熒光LAMP檢測人工污染雞肉的檢出限

由平板菌落計數(shù)可知人為污染的雞肉樣品中Y.enterocolitica的初始濃度為4.6×107CFU/g。本研究采用熱裂解法對人工污染的雞肉進行Y.enterocolitica基因組DNA的提取，采用實時熒光LAMP檢測人工污染雞肉中的Y.enterocolitica見圖4。

從圖4中可以看出，當Y.enterocolitica純培養(yǎng)物濃度為4.6×105CFU/g~4.6×101CFU/g時，熒光曲線出現(xiàn)明顯的擴增峰，儀器自動判定為陽性；當濃度為4.6×100CFU/g時，熒光曲線平緩，未出現(xiàn)擴增峰，判定為陰性。因此，本研究所建立實時熒光LAMP檢測人工污染雞肉的檢出限為46 CFU/g。

3 討論

Y.enterocolitica致病性比較強，人感染后可引起腸胃炎、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等疾病，甚至引起急性闌尾炎、敗血癥[14-15]，因此，建立靈敏、快速檢測Y.enterocolitica的方法對于該菌的溯源和控制具有重要的現(xiàn)實意義。目前，Y.enterocolitica的傳統(tǒng)檢測方法主要以國家標準為依據(jù)，該方法的檢測周期在5 d~7 d左右，存在著檢驗周期長，工作量大，靈敏度低等缺點[16]，不能滿足日益增長的檢測需求。近年來，隨著分子生物學的不斷發(fā)展，人們建立了多種快速檢測方法，如PCR法、實時定量PCR法、LAMP方法、RCA方法等檢測方法，此外還有免疫學檢測方法等。姜英輝等[9]建立了RCA技術(shù)檢測Y.enterocolitica的方法，靈敏度為1.7×102CFU/mL。其中LAMP技術(shù)因具有特異性高、靈敏度高等優(yōu)點，而被普遍應用于微生物的檢測領(lǐng)域。

本研究中所建立的實時熒光LAMP方法在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上，向體系中添加熒光染料，通過觀察是否有峰圖出現(xiàn)就可知道反應是否發(fā)生，比普通的LAMP方法省時省力。該方法在結(jié)果出現(xiàn)后可直接終止反應，既節(jié)省時間又降低了試驗成本，同時避免了繁瑣的電泳。LAMP引物的設(shè)計是針對靶基因上6個特定區(qū)域而設(shè)計的4條引物，確保了擴增產(chǎn)物的特異性。但在實際操作時需要注意預防污染，避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

研究結(jié)果表明，實時熒光LAMP檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的靈敏度為61 CFU/mL，人工污染雞肉的檢出限為46 CFU/g，實現(xiàn)了對Y.enterocolitica高效快速的檢測，因此，本研究探索了一種特異性強、靈敏度高的檢測Y.enterocolitica的方法，為Y.enterocolitica的快速檢測開辟了新途徑，適合在基層檢測機構(gòu)推廣應用。

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