關(guān)健 謝磊 丁羅賓 薛偉 王華軍

1石家莊市第三醫(yī)院關(guān)節(jié)外科（石家莊 050000）；2邯鄲市中心醫(yī)院骨科（河北邯鄲 056000）；3暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科（廣州 510630）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種臨床常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病率僅次于心血管疾病。隨著全球人口老齡化的發(fā)展和肥胖人群的日益增加，OA在中老年人的患病率明顯升高［1-3］。OA主要累及膝、髖等負(fù)重關(guān)節(jié)，病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退行性損傷與破壞，晚期出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、畸形，關(guān)節(jié)活動(dòng)功能障礙而致殘。目前對(duì)于中晚期OA無療效確切的治療方案，不能逆轉(zhuǎn)軟骨的退變，最終只能行關(guān)節(jié)置換治療。研究顯示我國每年行膝關(guān)節(jié)置換的人數(shù)在5～7萬，并逐年迅速上升［4］，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，早期診斷對(duì)OA的預(yù)防及治療具有重要意義，目前生物標(biāo)記物（biomarker）在OA的病理生理過程的作用越發(fā)受到重視［5-6］。其中，YKL?40是哺乳動(dòng)物糖基水解酶家族18中的一種，分布于軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、人骨肉瘤細(xì)胞等。研究表明，YKL?40與關(guān)節(jié)軟骨損傷關(guān)系密切，能反映OA炎癥的嚴(yán)重程度［7］。目前YKL?40的研究主要集中在血清及關(guān)節(jié)液，但對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40的報(bào)道較少，其與OA癥狀嚴(yán)重程度的相關(guān)性有待證實(shí)。本研究選擇膝骨關(guān)節(jié)炎患者作為研究對(duì)象，采用X線K?L分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者膝關(guān)節(jié)病變情況進(jìn)行分級(jí)，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40的表達(dá)水平，探討YKL?40水平與癥狀嚴(yán)重程度、軟骨損傷程度、影像學(xué)分級(jí)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院骨關(guān)節(jié)科住院并行全膝關(guān)節(jié)置換治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者42例（OA組），其中男19例，女23例，年齡51～75歲，并按X線K?L分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為3個(gè)亞組，其中Ⅱ級(jí)組12例、Ⅲ級(jí)組14例、Ⅳ級(jí)組16例。另選取因糖尿病足（3例）、下肢動(dòng)脈硬化栓塞閉塞癥（2例）、外傷（6例）需要截肢手術(shù)且術(shù)前X線K?L分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為正常的患者共11例作為對(duì)照組，男6例，女5例，年齡27～50歲。以西安大略和麥馬斯特大學(xué)骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)（the western ontario and mcmaster universities os?teoarthritis index，WOMAC）作為評(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎臨床病變程度標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合膝骨性關(guān)節(jié)炎、糖尿病足、下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)保守3個(gè)月治療效果不佳，有明確的手術(shù)指征；（2）同意行全膝關(guān)節(jié)置換或因外傷嚴(yán)重需行大腿截肢術(shù)，并簽知情同意書；（3）經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，經(jīng)患者同意進(jìn)入本研究。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）膝關(guān)節(jié)周圍骨折脫位史或手術(shù)史；（2）膝關(guān)節(jié)痛風(fēng)、腫瘤、結(jié)核、感染等病史；（3）合并嚴(yán)重內(nèi)科病情無法完成手術(shù)者。

1.4 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 骨關(guān)節(jié)炎X線Kellgren?Lawrence分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表1）。采用單盲法，遮蓋患者基本信息，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的影像學(xué)專家對(duì)患膝進(jìn)行X線K?L標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)及分組。有不同意見時(shí)，共同討論決定。

表1 X線Kellgren?Lawrence分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The radiographic progression of OA was identified according to the K?L grading scale

1.5 主要試劑 （1）鼠抗人YKL?40多克隆抗體（美國R&D公司）；（2）即用型免疫組化EliVisionTMplus試劑盒：試劑A為反應(yīng)增強(qiáng)液及試劑，試劑B為酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.6 關(guān)節(jié)軟骨YKL?40的檢測(cè)方法 手術(shù)后留取患膝，由本院經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面軟骨。所獲得軟骨標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片至3 μm，用二甲苯脫蠟和酒精脫水。不銹鋼高壓鍋高壓高溫抗原修復(fù)。用3%過氧化氫溶液浸泡切片，阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶。分別滴加鼠抗人YKL?40多克隆抗體、反應(yīng)增強(qiáng)液及酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物。用AEC顯色，出現(xiàn)紅色或棕色提示陽性顯色，再用改良Carazzi蘇木素液復(fù)染后，滴加水性封片劑封片，烤干后再用中性樹脂膠加蓋玻片二次封片。顯微圖像分析系統(tǒng)（Sample PCI）測(cè)定軟骨內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物吸光度值，取均值為測(cè)定結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40表達(dá)水平比較采用采用方差分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)的方式表示。兩個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 表2顯示的是研究對(duì)象的一般資料，全部膝骨關(guān)節(jié)炎患者按X線K?L分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為3組，3組患者在年齡、性別、病程及BMI指數(shù)方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40水平的表達(dá) 把OA組共42例患者關(guān)節(jié)軟骨YKL?40表達(dá)水平與正常組相比較，獨(dú)立t檢驗(yàn)分析顯示，OA組總的YKL?40的表達(dá)水平高于對(duì)照組（0.221 6±0.012 7vs.0.131 5±0.017 5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。單因素方差分析顯示，隨著OA的X線K?L分級(jí)遞增，OA患者關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40表達(dá)水平依次升高，Ⅳ級(jí)組高于Ⅲ、Ⅱ級(jí)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

2.3 OA組關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40的表達(dá)水平與WOMAC評(píng)分的相關(guān)性

2.3.1 關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40的表達(dá)水平與WOMAC疼痛評(píng)分呈正相關(guān)r=0.639，P=0.001。見圖1。

2.3.2 關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40的表達(dá)水平與WOMAC關(guān)節(jié)僵硬評(píng)分呈正相關(guān)r=0.565，P=0.001。見圖2。

2.3.3 關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40的表達(dá)水平與WOMAC肢體功能評(píng)分呈正相關(guān)r=0.785，P=0.001。見圖3。

2.3.4 關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40的表達(dá)水平與WOMAC總評(píng)分呈正相關(guān)r=0.863，P=0.001。見圖4。

表2 一般資料Tab.2 Baseline data ±s

表2 一般資料Tab.2 Baseline data ±s

項(xiàng)目年齡（年）性別（女/男）患肢（左/右）病程（年）BMI（kg/m2）WOMAC疼痛評(píng)分WOMAC僵硬評(píng)分WOMAC功能評(píng)分WOMAC總分0級(jí)（n=11）39.71±17.82 5/6 4/7-23.05±2.06----Ⅱ級(jí)（n=12）56.53±6.15 7/5 4/8 7.28±2.18 22.97±2.38 11（8 ～ 16）4（3 ～ 6）29（25 ～ 35）42（35 ～ 60）Ⅲ級(jí)（n=14）58.14±6.51 8/6 5/9 7.57±3.01 23.56±2.71 14（9 ～ 18）6（5 ～ 8）42（37 ～ 55）58（48 ～ 70）Ⅳ級(jí)（n=16）57.35±7.14 8/8 7/9 8.04±3.29 23.36±2.08 16（12 ～ 20）＃7（7 ～ 8）＃55（45 ～ 60）＃80（65 ～ 95）＃

表3 正常組與OA組軟骨YKL?40的水平表達(dá)（吸光度值）Tab.3 YKL?40 levels（μg/L）in normal group and OA group（absorbance value）±s

表3 正常組與OA組軟骨YKL?40的水平表達(dá)（吸光度值）Tab.3 YKL?40 levels（μg/L）in normal group and OA group（absorbance value）±s

K?L分級(jí)正常組OA組例數(shù)11 42 YKL?40 0.131 5±0.221 6±t值-12.506 P值0.001

表4 OA組中3個(gè)亞組軟骨YKL?40的水平表達(dá)（吸光度值）Tab.4 YKL?40 levels（μg/L）in 3 subgroups of OA group（absorbance value）±s

表4 OA組中3個(gè)亞組軟骨YKL?40的水平表達(dá)（吸光度值）Tab.4 YKL?40 levels（μg/L）in 3 subgroups of OA group（absorbance value）±s

K?L分級(jí)Ⅱ級(jí)組Ⅲ級(jí)組Ⅳ級(jí)組例數(shù)12 14 16 YKL?40 0.172 6±0.016 4 0.218 7±0.018 8 0.274 2±0.025 1 F值P值134.1870.001

圖2 軟骨中YKL?40水平與WOMAC關(guān)節(jié)僵硬評(píng)分的相關(guān)性Fig.2 Association of AC YKL?40 levels（μg/L）with WOMAC stiffness scores

圖3 軟骨中YKL?40水平與WOMAC肢體功能評(píng)分的相關(guān)性Fig.3 Association of AC YKL?40 levels（μg/L）with WOMAC physical function scores

圖4 軟骨中YKL?40水平與WOMAC總評(píng)分的相關(guān)性Fig.4 Association of AC YKL?40 levels（μg/L）with WOMAC total scores

2.4 YKL?40與X線K?L分級(jí)的相關(guān)性 膝骨關(guān)節(jié)炎患者其關(guān)節(jié)軟骨YKL?40表達(dá)水平與K?L分級(jí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40水平越高，K?L分級(jí)顯示其OA越嚴(yán)重（r=0.372，P＜0.001）（圖5）。

3 討論

OA是一種慢性進(jìn)展性關(guān)節(jié)疾病，多見于中老年人群，女性多于男性。流行病學(xué)調(diào)查顯示，OA的總患病率約為15%，40歲人群的患病率為10%～17%，60歲以上為50%，75歲以上可達(dá)80%。在美國OA患者高達(dá)2 700萬，到2030年預(yù)計(jì)將達(dá)到6 700萬［8］。由于目前仍缺乏敏感性和特異性的方法用于OA的早期診斷與預(yù)防。核磁共振等影像學(xué)檢查對(duì)于早期而尚未出現(xiàn)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變的OA不具有敏感性和特異性，且費(fèi)用較高［9-10］。當(dāng)患者出現(xiàn)癥狀或影像學(xué)征象的時(shí)往往已經(jīng)是OA的中晚期。而現(xiàn)在還沒有能夠逆轉(zhuǎn)軟骨的退變的治療方案，很多患者最終只能行關(guān)節(jié)置換來改善功能，緩解疼痛。2012年美國AAOS的研究顯示：約450萬患者行TKR，即超過50歲的人群中20個(gè)人中就有1個(gè)行TKR，每年僅行TKR的費(fèi)用就超過130億。OA已成為嚴(yán)重影響人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。監(jiān)測(cè)早期OA關(guān)節(jié)軟骨的病理變化是骨科領(lǐng)域目前研究的熱點(diǎn)之一［11-12］。尋找能直接反映關(guān)節(jié)軟骨早期病理變化的BM，對(duì)OA的早期診斷及預(yù)防具有重要的臨床意義［13］。

關(guān)節(jié)軟骨在病理狀態(tài)下，生化改變要早于形態(tài)學(xué)改變。關(guān)節(jié)軟骨的BM能夠直接反映患病關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)骨、軟骨及滑膜的代謝變化，揭示病情活動(dòng)或預(yù)后，且關(guān)節(jié)軟骨便于臨床收集和檢測(cè)，故研究關(guān)節(jié)軟骨中的生物標(biāo)記物以反映關(guān)節(jié)炎的病變有重要的臨床意義。YKL?40是屬于殼質(zhì)酶蛋白家族的一種糖蛋白，可以反映細(xì)胞黏附、遷移和重組等內(nèi)皮損傷的情況。已有研究證實(shí)：YKL?40在正常人體中的含量很低，但在OA患者軟骨細(xì)胞中卻大量存在，其著色主要存在于關(guān)節(jié)軟骨的表層和中層的軟骨細(xì)胞中。既往通過對(duì)血清及關(guān)節(jié)液中YKL?40的研究，學(xué)者們認(rèn)為其可作為反映OA炎癥程度與關(guān)節(jié)病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)［14-15］。V??N?NEN等［16］通過對(duì)100例患者關(guān)節(jié)液的檢測(cè)證明關(guān)節(jié)液YKL?40與金屬蛋白酶MMP?1、MMP?3和IL?6、IL?17呈相關(guān)性。VOLCK等［17］認(rèn)為YKL?40源于關(guān)節(jié)中的軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，血清中的YKL?40水平受關(guān)節(jié)液中的濃度影響，后兩者中的YKL?40水平反映軟骨破壞情況及滑膜炎癥程度，提示YKL?40與OA的發(fā)生相關(guān)。而目前研究主要集中在血清及關(guān)節(jié)液，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40的報(bào)道較少。在本研究中首次采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40的表達(dá)水平。結(jié)果顯示膝關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨YKL?40表達(dá)水平高于非膝關(guān)節(jié)炎患者，各組膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨YKL?40表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅳ級(jí)患者高于Ⅲ級(jí)、Ⅱ級(jí)患者。進(jìn)一步證明了YKL?40與OA的發(fā)生關(guān)系密切。

圖5 軟骨YKL?40表達(dá)水平與X線K?L分級(jí)的相關(guān)性Fig.5 Association of AC YKL?40 levels（μg/L）with K?L grading scale

在本研究中，還發(fā)現(xiàn)隨著膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者的X線K?L分級(jí)遞增，Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組、Ⅳ級(jí)組患者關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40表達(dá)水平依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著患者病情加重，X線K?L分級(jí)越高，膝關(guān)節(jié)退變?cè)絿?yán)重，YKL?40表達(dá)水平越高。這些結(jié)果顯示YKL?40不僅與骨關(guān)節(jié)炎影像學(xué)嚴(yán)重程度相關(guān)，與患膝炎癥程度、關(guān)節(jié)軟骨退變程度等也有一定相關(guān)性。這可能與軟骨組織在受到生物力學(xué)或者生物化學(xué)的刺激后反應(yīng)產(chǎn)生更多的 YKL?40 有關(guān)［18-19］。CONNOR 等［20］研究也顯示YKL?40表達(dá)的升高與關(guān)節(jié)軟骨退變和骨贅生成的增加相關(guān)。進(jìn)一步的研究顯示YKL?40的表達(dá)水平與骨贅的長(zhǎng)度呈正相關(guān)。國內(nèi)研究人員［21-22］通過SD大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，觀察OA早中期關(guān)節(jié)軟骨YKL?40表達(dá)與軟骨細(xì)胞凋亡率（apop?tosisindex，AI）的關(guān)系，結(jié)果也證實(shí)隨著軟骨退變加重，YKL?40的表達(dá)與軟骨細(xì)胞AI呈正相關(guān)，提示YKL?40能反映出關(guān)節(jié)軟骨降解破壞和滑膜炎癥的程度［23-24］，可能為OA早中期病理過程中軟骨細(xì)胞凋亡的重要影響因子。

同時(shí)本研究進(jìn)一步探討了關(guān)節(jié)軟骨YKL?40水平與WOMAC評(píng)分間的關(guān)系，相關(guān)性分析顯示，其表達(dá)水平與WOMAC疼痛、僵硬、肢體功能以及總分呈正相關(guān)。這結(jié)果表明YKL?40水平在一定程度上反映了OA患者關(guān)節(jié)WOMAC評(píng)分情況，尤其是在剔除了相應(yīng)混雜因素如年齡、性別、BMI指數(shù)后，關(guān)節(jié)軟骨YKL?40水平與上述評(píng)分仍顯示二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，說明關(guān)節(jié)軟骨損傷退變與OA患者的疼痛、僵硬、關(guān)節(jié)功能等臨床癥狀有密切的關(guān)系，前者可作為一種反映OA嚴(yán)重程度的生物標(biāo)記物。

綜上所述，本研究顯示OA中關(guān)節(jié)軟骨的YKL?40表達(dá)水平與X線K?L分級(jí)、WOMAC疼痛、僵硬、肢體功能以及總分呈正相關(guān)。隨著OA的病情加重，關(guān)節(jié)軟骨破壞增加，YKL?40表達(dá)水平越高，對(duì)OA的早期診斷、治療或預(yù)測(cè)預(yù)后具有重要的意義，也為OA的早期診斷提供新的思路和依據(jù)。關(guān)節(jié)軟骨中YKL?40參與了膝骨關(guān)節(jié)炎基本病理改變過程，可能成為一種新穎的預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的生物標(biāo)記物。

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