張 輝，李慧玲，張應(yīng)根，李良德，王定鋒，王慶森，曾明森，吳光遠

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015)

小飛蓬Conyzacanadensis(L.) Cronq.別名小蓬草、加拿大蓬、小白草，隸屬菊科植物，為越年生或一年生草本植物，是福建[1]、貴州[2]、江蘇[3]、湖南[4]等主要茶區(qū)茶園的具有優(yōu)勢種群的草，是茶園生態(tài)系統(tǒng)的組分之一，人們稱之為茶園雜草。因為人們認為小飛蓬在茶園生態(tài)環(huán)境中與茶樹生長爭奪水肥和光照，與茶樹不利。在相同的茶園生態(tài)系統(tǒng)中，茶小綠葉蟬被認為是目前危害茶樹最嚴重的昆蟲，危害隱蔽，發(fā)生世代多，繁殖快，世代重疊嚴重，防治難度大，以成若蟲刺吸茶樹嫩芽葉，導(dǎo)致芽葉萎縮，葉脈變紅，葉尖、葉緣紅褐焦枯，芽梢生長停滯，嚴重影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。茶小綠葉蟬是雜食性害蟲，本寄生于雜草和小灌木，因為20世紀50～60年代墾荒種茶，這種害蟲才從雜草和小灌木轉(zhuǎn)移到茶樹上并成為優(yōu)勢種。除了茶樹之外，它還有其他的嗜好寄主[6]。除草劑的使用使現(xiàn)代茶園生態(tài)系統(tǒng)比較單一，植物種物種群結(jié)構(gòu)比較單一僅存茶樹。在茶樹與雜草、小灌木和喬木混生的50年代茶園，葉蟬是不需要防治的，說明雜草可影響葉蟬生存行為。茶園周圍的木本雜草迷迭香Rosmarinusofficinalis具有引誘茶小綠葉蟬的功能[7]，茶小綠葉蟬忌避入侵草本植物勝紅薊AgeratumconyzoidesL.精油[8]，而作為茶園的具有優(yōu)勢種群的雜草小飛蓬，在茶園生態(tài)系統(tǒng)中起著怎樣的作用，對茶小綠葉蟬行為影響如何，本文擬開展小飛蓬對該蟲的行為調(diào)控功能，鑒定出活性組分，明確其調(diào)控機制，探明小飛蓬在茶園生態(tài)系統(tǒng)中對茶小綠葉蟬的行為影響，為茶園應(yīng)用“推拉”策略調(diào)控該蟲提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶小綠葉蟬：2016年5月中旬于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所2號山基地采含有茶小綠葉蟬卵的茶梢，室內(nèi)水培飼養(yǎng)，取大小均勻3～4齡若蟲，饑餓1 h，備用。標(biāo)準單體化合物信息如下表1，揮發(fā)物單體以液體石蠟為溶劑，配制10-5mL·mL-1、10-3mL·mL-1和10-1mL·mL-1三種劑量。

表1 標(biāo)準化合物及CAS登錄號、純度和密度

1.2 試驗方法

1.2.1 茶小綠葉蟬高齡若蟲對小飛蓬揮發(fā)物的趨性行為測定 參照鈕羽群等[7]方法，取小飛蓬植物植株為味源材料，用“Y”型嗅覺儀測定茶小綠葉蟬若蟲對小飛蓬植物揮發(fā)物的趨性反應(yīng)?！癥”型管A、B兩臂用直徑為1.0 cm Teflon 管分別連接小飛蓬植物植株和對照(潔凈空氣)后再連接氣泵。開啟氣泵后，調(diào)整流量計使氣流以 100 mL·min-1的平穩(wěn)流速通過每個味源進入“Y”型管兩臂。氣流進入氣味源前需通過活性炭過濾器過濾和洗瓶加濕，嗅覺儀置于暗箱內(nèi)。由釋放管管口將20頭若蟲放至“Y”型管基部觀察。當(dāng)若蟲處于釋放管1/2 處開始計時，當(dāng)蟲越過 A 或 B 臂 1/2 處且停留 1min 以上時，記為作出選擇反應(yīng)；當(dāng)放入 20 min 后無明顯選擇趨向，記為無反應(yīng)。每頭若蟲只測試 1 次，每測試 20 頭，將“Y”型管兩臂互調(diào)方向，以消除位置引起的誤差，每日測定完畢后，用乙醇清洗“Y”型管及連接 Teflon 管并放于 100℃烘箱中烘烤 2 h。設(shè)小飛蓬劑量5，10，15，20，25 g共5個劑量，每個劑量重復(fù)4次。每個劑量測試完后，將“Y”形管、味源瓶、對照瓶和加濕瓶酒精清洗，100℃烘箱烘干，活性炭置于100℃烘箱內(nèi)活化4 h 解吸附，清除吸附的氣體，備用。

1.2.2 小飛蓬揮發(fā)物的提取鑒定 ①固相微萃取法(SPM)提取揮發(fā)物。剪取50 g小飛蓬嫩莖放入1000 mL的廣口瓶中，橡膠塞封口。橡膠塞上端插入SPME，推出纖維頭，不要使萃取頭碰到植物葉片，收集植物揮發(fā)物，分別收集1 h，每個試驗重復(fù)8次。試驗完畢后，抽回纖維頭，拔出萃取頭，于230℃解析10 min，同時啟動氣質(zhì)儀器采集數(shù)據(jù)，微萃取頭為PDM和DVB。②揮發(fā)物組分鑒定(GC-MS)。應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對提取的揮發(fā)物質(zhì)進行成分和含量分析，采用保留指數(shù)定性法和質(zhì)譜圖庫對照法進行定性，面積歸一化法進行各成分的相對定量。待選植物揮發(fā)物的氣相色譜-質(zhì)譜條件：50℃ 用于5 min然后 3.5 ℃·min-1到141 ℃然后2℃·min-1到 170℃，然后 3.5 ℃·min-1到230 ℃保持 5 min。

1.2.3 茶小綠葉蟬若蟲對小飛蓬揮發(fā)物單體的選擇行為 方法同1.1，揮發(fā)物單體以液體石蠟為溶劑，配制10-5mL·mL-1、10-3mL·mL-1和10-1mL·mL-1三種劑量。吸取100 μL每種劑量的溶液作為味源，再吸取液體石蠟100 μL作為CK，于室內(nèi)做行為測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Microsoft excel和 DPS軟件進行統(tǒng)計分析，茶小綠葉蟬趨性反應(yīng)應(yīng)用卡方檢驗進行顯著性差異檢測，無選擇行為的成蟲不計入統(tǒng)計分析。趨避=[(對照邊蟲數(shù)-處理邊蟲數(shù))/對照邊蟲數(shù)]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 茶小綠葉蟬若蟲對小飛蓬揮發(fā)物的趨性行為測定

小飛蓬嫩莖揮發(fā)物在5 g至25 g范圍內(nèi)對茶小葉蟬的若蟲的趨性選擇具有一定規(guī)律性，相對小飛蓬揮發(fā)物氣味，茶小綠葉蟬顯著趨向空氣對照，茶小綠葉蟬選擇率總體不超過31.82%，葉蟬的選擇率伴隨小飛蓬質(zhì)量的增加而呈現(xiàn)先降低后升高狀態(tài)，在小飛蓬15 g，選擇率最低為17.39%，其趨避作用隨著劑量的增加呈現(xiàn)先升高后降低，在小飛蓬15 g時，對茶小綠葉蟬趨避作用最大，為78.95%，以小飛蓬劑量為自變量，以對葉蟬趨避率為因變量，兩者作用的拋物線關(guān)系，即y=-0.1662x2+5.2914x+33.704，R2=0.7434(P<0.05)。

表2 不同劑量的小飛蓬植物揮發(fā)物對葉蟬的趨避活性

2.2 小飛蓬揮發(fā)物的提取鑒定

小飛蓬揮發(fā)物中鑒定出47種揮發(fā)物質(zhì)，其中DVB萃取45種，PDM柱萃取揮發(fā)物33種，其物質(zhì)為醇類，酮類，醛類和烯類，其中醇類物質(zhì)為葉醇，相對含量為0.07%，醛類相對含量為0.20%，分別是葵醛和椰子醛，酮類物質(zhì)僅鑒定出樟腦(0.04%)，小飛蓬主要揮發(fā)物為烯類，相對含量約為99.69%，相對含量前4的物質(zhì)分別D-檸檬烯，(E)-β-金合歡烯、β-蓽澄茄油烯和β-石竹烯，在DVB萃取中分別含31.45%、13.16%、7.64%和7.3%，在PDM柱萃取揮發(fā)物中分別16.5%、12.57%、20.45%和11.16%。僅出現(xiàn)在在DVB萃取的揮發(fā)物15種，而PDM萃取中僅出現(xiàn)兩種白菖油萜和順式-α-紅沒藥烯。

表3 小飛蓬揮發(fā)物各組分

(續(xù)表3)

峰號保留時間(min)化合物相對含量(%)DVBPDM1226.17γ-芹子烯 gamma.-Selinene 0.26ND1326.32α-蓽澄茄油烯 alpha.-Cubebene 0.400.121426.89椰子醛2(3H)-Furanone, dihydro-5-pentyl-0.050.081527.12依蘭烯Ylangene 0.21ND1627.31α-可巴烯 (-)-Copaene0.850.141727.64α-波旁烯 alpha.-Bourbonene2.561.391827.83大根香葉烯Germacrene D0.070.741927.96β-欖香烯beta.-Elemene0.852.022028.48(Z)-石竹烯 (Z)-Caryophyllene0.16ND2128.57(-)-α-古蕓烯(-)-.alpha.-Gurjunene0.05ND2229.10β-石竹烯 β-Caryophyllene7.3011.162329.23甘香烯Elixene0.470.192429.38(+) -表二環(huán)倍半水芹烯(+)-Epi-bicyclosesquiphellandrene1.241.612529.51反式-α-香檸檬烯Trans-.alpha.-Bergamotene2.092.512629.5910s,11s-Himachala-3(12),4-diene5.442.532729.94(-)-β-檀香烯(-)-.beta.-Santalene0.571.132830.15葎草烯.alpha.-Caryophyllene1.591.502930.34香樹烯(-)-Alloaromadendrene1.28ND3030.40(E)-β-金合歡烯(E)-.beta.-Farnesene13.1612.573131.08β-蓽澄茄油烯.beta.-Cubebene0.67ND3231.55γ-摩勒烯gamma.-Muurolene7.6420.453331.62白菖油萜(+)-Calarene ND0.533431.16α-雪松烯.alpha.-Himachalene0.62ND3531.66雙環(huán)大牻牛兒烯Bicyclogermacrene2.548.413631.78α-衣蘭油烯.alpha.-Muurolene0.570.623732.00愈創(chuàng)木烯 beta.-Guaiene0.87ND3832.09α-法尼烯.alpha.-Farnesene0.301.223932.264,9-己二烯4,9-Cadinadiene1.250.204032.35β-雪松烯.beta.-Himachalene0.050.214132.63d-杜松萜烯.delta.-Cadinene2.901.864232.921,4-己二烯1,4-Cadinadiene0.290.11

注：ND表示未檢測出此物。

2.3 茶小綠葉蟬高齡若蟲對小飛蓬揮發(fā)物單體的選擇行為

通過“Y”型嗅覺儀，測定小飛蓬10種主要揮發(fā)物對茶小綠葉蟬的行為影響，X2檢驗結(jié)果表明，在10-3和10-5mL·mL-1，β-蒎烯對茶小綠葉蟬具有顯著趨避作用，β-石竹烯在10-3mL·mL-1濃度下對茶小綠葉蟬具有顯著趨避作用，而紅沒藥烯在10-1mL·mL-1下對茶小綠葉蟬具有顯著引誘作用。

3 討論

小飛蓬為茶園主要雜草，隸屬菊科植物，具有特殊氣味，通過Y型嗅覺儀測定茶小綠葉蟬對小飛蓬植物揮發(fā)物的趨性反應(yīng)，結(jié)果表明，相對于空氣，茶小葉蟬高齡若蟲對小飛蓬具明顯的趨避作用，初次探討茶園雜草小飛蓬植物揮發(fā)物對茶小綠葉蟬行為影響，而非茶園植物萬壽菊植物揮發(fā)物對葉蟬高齡若蟲具有類似的趨避效果[9]，同時茶園菊科雜草精油勝紅薊AgeratumconyzoidesL、金腰箭rellanodiflora和假臭草Praxelisclematidea(Griseb.) R. M. King et H. Rob.3種揮發(fā)油對茶小綠葉蟬成蟲具較強的趨避作用[10]。雖葉蟬類的成若蟲感受器基本一致，但還要進步證明茶小葉蟬成蟲對小飛蓬揮發(fā)物的選擇行為。

圖1 DVB提取小飛蓬揮發(fā)物離子流量圖Fig.1 Total ion flow chromatography of volatiles extracted by DVB from C. Canadensis

圖2 PDM提取小飛蓬揮發(fā)物離子流量圖Fig.2 Total ion flow chromatography of volatiles extracted by PDM from C. Canadensis

表4 茶小綠葉蟬對10種揮發(fā)物組分的選擇行為

注：*表示卡方檢驗顯著，**表示卡方檢驗極顯著；*P< 0.05 (χ2-test),**P<0.01(χ2-test)

通過“Y”型嗅覺儀確定了小飛蓬揮發(fā)物10種的主要成分對茶小綠葉蟬若蟲的行為影響，10-3和10-5mL·mL-1的β-蒎烯，對茶小綠葉蟬具有極顯著趨避作用，而鈕羽群以類似的方法測定在10-10g·mL-1呈現(xiàn)顯著趨避性，表明β-蒎烯作為茶小綠葉蟬的趨避物質(zhì)，趨避性與濃度相關(guān)，β-石竹烯在10-3mL·mL-1濃度下對茶小綠葉蟬具有顯著趨避作用而在1 g·mL-1時趨避作用不顯著[11]，紅沒藥烯在10-1mL·mL-1下對茶小綠葉蟬具有顯著引誘作用。昆蟲是利用視覺與嗅覺搜尋，并發(fā)現(xiàn)寄主的，而嗅覺信號的氣味在空氣中的傳播受到風(fēng)速、溫濕度等非生物因素的影響，而室內(nèi)試驗中氣味受空氣的傳播影響的生物因素較少，所以需要對葉蟬若蟲具有趨避作用的物質(zhì)β-蒎烯和β-石竹烯和引誘物質(zhì)紅沒藥烯進一步的田間試驗驗證。

由于產(chǎn)地、時間、品種和提取方法的不同，獲得某種植物揮發(fā)物(香精油)的質(zhì)和量會有差異。但本文使用的是固相微萃取提取法，吸附的小飛蓬鮮葉揮發(fā)物同時擁有兩種水蒸餾法提取的小飛蓬精油主要成分[12-13]，說明了本方法具有可行性。