黃文瀚，任飛鳳，羅 蕾，周 俊，潘珠瑪，郭 暉，唐 琳△（.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，重慶40000；.重慶市第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌、腎病科400054；.重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所，重慶40006）

高脂血癥是導(dǎo)致肝臟疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-2]，脂質(zhì)沉積與肝臟損傷密切相關(guān)[3-4]。人體對(duì)于低密度脂蛋白（LDL）的吸收主要受到低密度脂蛋白受體（LDLr）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）和SREBP分解活性蛋白（SCAP）的調(diào)控[5]，因此，三者組成負(fù)反饋系統(tǒng)，起到調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)的作用。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）-血管緊張素1-7[Ang-（1-7）]-Mas受體軸是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的一個(gè)新的分支，有大量研究報(bào)道了該軸參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)[6-7]，但是，其機(jī)制目前尚未明確。作者推測(cè)，Ang-（1-7）能夠調(diào)節(jié)肝臟中LDLr-SREBP2-SREBP分解活性蛋白系統(tǒng)，進(jìn)而減輕肝臟對(duì)脂質(zhì)的吸收，起到保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康6周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠40只，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 動(dòng)物模型制備 將40只健康C57BL/6小鼠隨機(jī)平均分為正常組、高脂組、高脂+Ang-（1-7）組、Ang-（1-7）組。正常組進(jìn)食普通飼料；高脂組進(jìn)食高脂飼料（熱量組成：脂肪60%，蛋白質(zhì)20%，碳水化合物20%）；高脂+Ang-（1-7）組小鼠在高脂飲食的基礎(chǔ)上給予Ang-（1-7），以濃度144 μg/（kg·d）連續(xù)滲透泵（型號(hào)2002，Alzet）皮下泵入；Ang-（1-7）組小鼠在給予普通飼料飲食基礎(chǔ)上，以同樣Ang-（1-7）濃度連續(xù)皮下泵入。實(shí)驗(yàn)小鼠按上述實(shí)驗(yàn)方法飼養(yǎng)12周，環(huán)境溫度控制在（20±2）℃，正常光照。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 所有實(shí)驗(yàn)小鼠于采樣前一晚20：00禁食不禁飲，12 h后采眼眶血，剖取肝臟。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 小鼠血脂水平檢測(cè) 采集小鼠眼眶血后以2 000 r/min、離心15 min分離血清，并送檢生化檢測(cè)總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、LDL水平。

1.2.2.2 小鼠肝臟油紅O染色 小鼠肝臟行冰凍切片后用10%甲醛鹽溶液固定30 min，用雙蒸水洗2次，向切片加1，2-丙二醇孵育2 min后，加油紅O工作液對(duì)切片進(jìn)行染色30 min，清洗后用Carazzi′s蘇木素對(duì)切片染色2 min，清洗后使玻片充分干燥，用甘油乙烯醇（GVA）水溶性封片劑固定，在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察并照相保存。

1.2.2.3 小鼠肝臟SREBP2蛋白測(cè)定 取小鼠肝臟按試劑盒說(shuō)明提取總蛋白，并行蛋白濃度測(cè)定，等量取各組蛋白30 μg予以上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加SREBP2和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗孵育過(guò)夜，Tris堿吐溫緩沖液沖洗后放入羊抗兔二抗中孵育1 h。洗膜后行電化學(xué)發(fā)光曝光采集圖像，分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析（one-wayANOVA），多重檢驗(yàn)校正采用Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠血清血脂水平檢測(cè)結(jié)果 高脂組小鼠血清TC、TG、LDL水平均明顯高于正常組和高脂+Ang-（1-7）組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ang-（1-7）組單獨(dú)處理C57BL/6小鼠，其血清TC、TG、LDL水平與正常組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清血脂水平檢測(cè)結(jié)果比較（±s，mmol/L）

表1 各組小鼠血清血脂水平檢測(cè)結(jié)果比較（±s，mmol/L）

注：與高脂組比較，aP＜0.05

指標(biāo)TC TG LDL正常組2.31±0.28a 0.44±0.04a 0.28±0.03a高脂組4.17±0.34 0.78±0.09 0.61±0.07高脂+Ang-（1-7）組3.11±0.21a 0.61±0.11a 0.47±0.05a Ang-（1-7）組2.26±0.32 0.47±0.06 0.31±0.05

2.2 小鼠肝臟組織油紅O染色結(jié)果 正常組小鼠肝臟中脂質(zhì)分布均勻（圖1A）；而高脂組小鼠肝臟組織中可見(jiàn)大量紅染脂質(zhì)沉積（圖1B）；Ang-（1-7）能顯著抑制小鼠肝臟對(duì)脂質(zhì)的吸收（圖 1C）。Ang-（1-7）單獨(dú)處理C57BL/6小鼠，其肝臟脂質(zhì)分布與正常組無(wú)差異（圖1D）。

圖1 C57BL/6小鼠肝臟組織油紅O染色（200×）

2.3 小鼠肝臟SREBP2蛋白表達(dá)水平 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，高脂組小鼠肝臟中SREBP2蛋白表達(dá)水平較正常組降低，高脂+Ang-（1-7）組小鼠肝臟中SREBP2蛋白表達(dá)水平較高脂組更為抑制，而Ang-（1-7）組小鼠肝臟中SREBP2蛋白表達(dá)水平與正常組無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。

圖2 C57BL/6小鼠肝臟SREBP2蛋白表達(dá)水平

3 討 論

ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的發(fā)現(xiàn)使得該軸成為一項(xiàng)新的研究熱點(diǎn)。SANTOS等[8]發(fā)現(xiàn)，在高脂誘導(dǎo)的大鼠模型中，Ang-（1-7）能夠明顯減輕大鼠的體重和皮下脂肪的含量，并且降低血漿TC和TG水平。此外，SINGH等[9]研究小組報(bào)道，在糖尿病大鼠研究模型中，Ang-（1-7）能夠顯著緩解大鼠血脂異常，進(jìn)一步證實(shí)Ang-（1-7）對(duì)血脂的調(diào)節(jié)作用。

然而，ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸的脂質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)制仍然不清。OH 等[10]認(rèn)為，Ang-（1-7）在大鼠體內(nèi)通過(guò)增加甘油的釋放起到分解脂肪的作用，而這一作用能夠被磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑削弱，提示Ang-（1-7）是通過(guò)PI3K信號(hào)通路發(fā)揮作用。SANTOS等[11]則認(rèn)為，脂肪脂質(zhì)結(jié)合蛋白參與了脂肪酸的酯化過(guò)程，而Ang-（1-7）可增加體內(nèi)該蛋白的表達(dá)，從而起到調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用。

本動(dòng)物研究結(jié)果表明了另一種脂質(zhì)調(diào)節(jié)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在高脂飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠中，Ang-（1-7）能夠顯著降低小鼠血清TC、TG、LDL水平，抑制肝臟對(duì)脂質(zhì)的吸收，并且證實(shí)ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸參與脂質(zhì)代謝調(diào)控是通過(guò)調(diào)節(jié)C57BL/6小鼠肝臟中LDLr-SREBP2-SCAP負(fù)反饋軸而實(shí)現(xiàn)。首先，本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可引起小鼠肝臟LDLr-SREBP2-SCAP軸正常的負(fù)反饋效應(yīng)，使 SREBP2 蛋白的表達(dá)降低；其次，Ang-（1-7）在小鼠皮下微量泵入能夠使這一負(fù)反饋效應(yīng)放大，導(dǎo)致小鼠肝臟SREBP2蛋白表達(dá)進(jìn)一步下降，而SREBP2的低表達(dá)可抑制LDLr基因轉(zhuǎn)錄，因此，LDLr的合成相應(yīng)減少，從而阻止C57BL/6小鼠肝臟細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的吸收，起到對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

本研究進(jìn)一步從機(jī)制層面闡明了ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，豐富了對(duì)Ang-（1-7）的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為后續(xù)的研究打下了理論基礎(chǔ)。

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