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2018-02-28 01:36:44蔡艷青齊顯尼齊奇藺玉萍王正祥王欽宏
生物工程學(xué)報(bào) 2018年1期
蔡艷青，齊顯尼，齊奇,3，藺玉萍，王正祥，王欽宏
1 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457
2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308
3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049
利用可再生的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料和生物基化學(xué)品是解決全球可持續(xù)發(fā)展所面臨的資源和環(huán)境問(wèn)題的重要途徑之一。木質(zhì)纖維素主要由纖維素 (38%–50%)、半纖維素 (23%–32%) 和木質(zhì)素 (15%–30%) 組成[1]。當(dāng)前工業(yè)條件下，木質(zhì)纖維素經(jīng)過(guò)預(yù)處理技術(shù)解離出纖維素和半纖維素，隨后被纖維素酶等水解成微生物可發(fā)酵的糖類[2]，水解液中木糖的含量?jī)H次于葡萄糖。目前，如何實(shí)現(xiàn)木糖的高效轉(zhuǎn)化以及與葡萄糖的共利用依然是阻礙木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)經(jīng)濟(jì)性利用的主要關(guān)鍵因素。
自然界中有許多微生物包括細(xì)菌、真菌和酵母菌可以利用木糖，而酵母菌由于具有較強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用屬性，引起人們的廣泛關(guān)注。利用木糖的酵母菌主要可以分為兩大類：一類是以樹(shù)干畢赤酵母Pichia stipitis為代表的天然利用木糖的酵母菌，另一類是攜帶外源木糖代謝途徑的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae工程菌。然而，葡萄糖阻遏效應(yīng) (Glucose repression) 在酵母菌糖代謝調(diào)控中普遍存在。無(wú)論是天然菌[3]還是工程菌[4–5]，在利用葡萄糖和木糖的混合糖時(shí)都表現(xiàn)出葡萄糖的優(yōu)先利用現(xiàn)象，也就是說(shuō)，木糖只有在葡萄糖耗盡后才開(kāi)始被利用，從而導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程的總糖轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度降低。在混合糖條件下釀酒酵母工程菌不能速效利用木糖的原因之一可能是由于葡萄糖抑制木糖代謝所需基因的表達(dá)，葡萄糖對(duì)這些基因表達(dá)抑制作用的解除或緩解有利于促進(jìn)混合糖條件下木糖的利用效率。有研究表明，釀酒酵母工程菌的一些糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以非特異地轉(zhuǎn)運(yùn)木糖，例如Hxt7，但在葡萄糖存在條件下HXT7的表達(dá)受抑制，從而限制混合糖條件下木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用[6]。Wahlbom 等[7]通過(guò)研究化學(xué)誘變獲得的木糖代謝能力提高的突變工程菌中基因表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)該突變株中一些參與糖轉(zhuǎn)運(yùn)、初始木糖代謝和磷酸戊糖途徑的基因表達(dá)加強(qiáng)，而且突變株在木糖唯一碳源條件下葡萄糖阻遏效應(yīng)關(guān)鍵抑制因子MIG1的表達(dá)水平也降低，但未明確指出表明MIG1是否直接參與葡萄糖抑制木糖代謝的調(diào)控。de Figueiredo Vilela等[8]通過(guò)進(jìn)化工程 (Evolutionary engineering) 獲得木糖代謝效率提升的菌株，與出發(fā)菌株相比，該進(jìn)化菌的HXT2(編碼低親和力己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白) 和TAL1(編碼磷酸戊糖途徑非氧化階段的轉(zhuǎn)醛酶) 表達(dá)水平均升高。另一方面有研究表明，MIG1的敲除能部分緩解工程菌中葡萄糖對(duì)木糖代謝的抑制作用，提高木糖在葡萄糖保持低水平的限碳或限氮連續(xù)發(fā)酵時(shí)的發(fā)酵能力[9–10]。另外，呼吸缺陷菌株經(jīng)過(guò)工程改造和進(jìn)一步的適應(yīng)性進(jìn)化后，木糖的發(fā)酵能力得到提高，這可能與經(jīng)由 Snf1/Mig1的葡萄糖感應(yīng)和阻遏調(diào)控途徑受到擾動(dòng)有關(guān)[11]。雖然以上研究表明葡萄糖阻遏木糖代謝所需基因的表達(dá)可能是在混合糖條件下工程菌不能速效利用木糖的原因之一，另一方面也表明解除或擾動(dòng)葡萄糖阻遏效應(yīng)的關(guān)鍵因子可能有助于實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖的共利用。然而，尚無(wú)研究報(bào)道明確指出MIG1和/或SNF1如何影響混合糖條件下木糖代謝所需基因的表達(dá)調(diào)控。
關(guān)于釀酒酵母的葡萄糖阻遏效應(yīng)已經(jīng)有大量的研究[12–15]。MIG1和SNF1是葡萄糖阻遏效應(yīng)的兩個(gè)關(guān)鍵因子。MIG1基因編碼一個(gè)含有2個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，可以結(jié)合到一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域，在葡萄糖存在的條件下抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄，例如麥芽糖、蔗糖和半乳糖代謝相關(guān)的酶基因[16–17]。Mig1受 Snf1的負(fù)調(diào)控。SNF1編碼一個(gè)蛋白激酶，是碳代謝中的中心調(diào)節(jié)因子，可用于解除葡萄糖對(duì)次級(jí)碳源的阻礙作用，如麥芽糖、半乳糖、蔗糖等。在葡萄糖存在的條件下，Snf1的活性受到抑制[18–19]。在沒(méi)有葡萄糖或葡萄糖濃度很低的條件下，Snf1磷酸化 Mig1，使細(xì)胞核中的 Mig1轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，不能再結(jié)合到基因啟動(dòng)子上抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而導(dǎo)致葡萄糖所抑制基因的表達(dá)解抑制[20–21]。因此，葡萄糖阻遏效應(yīng)可以歸結(jié)為3個(gè)連續(xù)的負(fù)調(diào)控步驟：葡萄糖抑制Snf1的活性，Snf1抑制Mig1轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能，Mig1抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。
本實(shí)驗(yàn)利用前期構(gòu)建的一株可以利用木糖的釀酒酵母工程菌株W32N55a，通過(guò)同源重組技術(shù)分別對(duì)葡萄糖阻遏效應(yīng)中的關(guān)鍵基因SNF1和MIG1基因進(jìn)行單敲除和雙敲除，然后評(píng)價(jià)了敲除菌株對(duì)葡萄糖和木糖共利用的性能，并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 (RNA-seq) 技術(shù)分析了在低濃度混合糖條件下MIG1和SNF1單敲除和雙敲除對(duì)全基因組水平上基因表達(dá)譜的影響。發(fā)現(xiàn)SNF1的敲除以及與MIG1的雙敲除有利于葡萄糖和木糖的共利用，初步揭示了Mig1和Snf1在負(fù)調(diào)控氮分解阻遏基因中的作用，同時(shí)，為進(jìn)一步提高葡萄糖和木糖的共利用提供了依據(jù)和線索。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和質(zhì)粒
本文所用菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。
1.1.2 引物
根據(jù)Saccharomyces Genome Database (SGD，ID：S000003003) 中報(bào)道的釀酒酵母中MIG1基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)同源臂片段擴(kuò)增引物F1、R1和F2、R2；根據(jù)質(zhì)粒pYES2/CT-ZGO-ZeoR中ZeoR表達(dá)框，設(shè)計(jì)引物 F3、R3；敲除驗(yàn)證引物 F4、R4。根據(jù)SGD (ID：S000002885) 中報(bào)道的釀酒酵母中SNF1基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)同源臂片段擴(kuò)增引物 F 5、R 5和 F 6、R 6；根據(jù)質(zhì)粒pRS313-ZGO-KanR中KanR表達(dá)框，設(shè)計(jì)引物F7、R7；敲除驗(yàn)證引物F8、R8。引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。本文所用引物見(jiàn)表2。
表1 本研究使用的釀酒酵母菌株和質(zhì)粒Table 1 S. cerevisiae strains and plasmids used in this study
PsXR: xylose reductase fromP. stipitis;PsXDH: xylitol dehydrogenase fromP. stipitis;ScXK: xylulokinase fromS. cerevisiae.
表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study
1.1.3 主要試劑和儀器
TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；博來(lái)霉素、G418購(gòu)自北京索萊寶公司；葡萄糖、木糖購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)有限公司。核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PTC100型PCR儀購(gòu)自美國(guó)M J Research公司等。
1.2 方法
1.2.1 SNF1和MIG1基因同源重組DNA片段的構(gòu)建
MIG1基因敲除同源片段的構(gòu)建過(guò)程如圖1A所示。以 W32N55a菌株基因組為模板，用引物對(duì)F1/R1和F2/R2，分別擴(kuò)增MIG1基因兩端同源臂mig1-up和mig1-down，各500 bp左右。以質(zhì)粒 pYES2/CT-ZGO-ZeoR為模板，用引物對(duì)F3/R3擴(kuò)增基因ZeoR表達(dá)框，大小為1 200 bp左右。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ將相應(yīng)片段分別酶切，用 T4 DNA連接酶將獲得的片段mig1-up、ZeoR、mig1-down連接起來(lái)獲得MIG1基因敲除同源片段“mig1-up-ZeoR-mig1-down”，并用引物對(duì)F1/R2擴(kuò)增此片段，大小約為2 200 bp。
圖1 MIG1和SNF1基因敲除同源片段的構(gòu)建過(guò)程Fig. 1 Working flow for MIG1 and SNF1 disruption cassette construction.
SNF1基因敲除組同源片段的構(gòu)建過(guò)程如圖1B所示。以W32N55a菌株基因組為模板，用引物對(duì) F5/R5和 F6/R6，分別擴(kuò)增SNF1基因兩端同源臂snf1-up和snf1-down，各500 bp左右。以質(zhì)粒pRS313-ZGO-KanR為模板，用引物對(duì)F7/R7擴(kuò)增基因KanR表達(dá)框，大小為1 500 bp左右。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ將相應(yīng)片段分別酶切，用T4 DNA連接酶將片段snf1-up、KanR、snf1-down接起來(lái)獲得SNF1基因敲除同源片段“snf1-up-KanR-snf1-down”，并用引物對(duì) F5/R6擴(kuò)增敲除同源片段，大小約為2 500 bp。
敲除同源片段構(gòu)建過(guò)程中各片段的合成都采用高保真的pfuDNA聚合酶。
1.2.2 酵母細(xì)胞培養(yǎng)，基因組提取和PCR
[22–24]進(jìn)行操作。
1.2.3 SNF1基因和MIG1基因敲除同源片段的轉(zhuǎn)化及克隆子篩選
采用LiAc/SS-DNA/PEG高效酵母轉(zhuǎn)化法[25]，將MIG1基因敲除同源片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母W32N55a感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含100 μg/mL博來(lái)霉素的YPD平板 (酵母膏2%、蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%) 上，30 ℃培養(yǎng)2–5 d單菌落出現(xiàn)。將SNF1基因敲除同源片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母 W32N55a感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含200 μg/mL G418的YPD (酵母膏 1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂糖2%) 平板上，30 ℃培養(yǎng)2–5 d單菌落出現(xiàn)。將SNF1基因敲除同源片段同時(shí)轉(zhuǎn)化至已經(jīng)敲除掉MIG1的釀酒酵母W32N55a (mig1Δ0) 感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含 100 μg/mL的博來(lái)霉素和200 μg/mL G418 的 YPD 平板上，30 ℃培養(yǎng) 2–5 d單菌落出現(xiàn)。
1.2.4 克隆子驗(yàn)證
將平板上出現(xiàn)的單菌落，挑選至 YPD液體培養(yǎng)中，提取基因組，用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR驗(yàn)證。用引物對(duì)F4/R4驗(yàn)證MIG1基因敲除菌，用引物對(duì)F8/R8驗(yàn)證SNF1基因敲除菌，用這兩對(duì)引物驗(yàn)證雙敲菌株。
1.2.5 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
將親本菌株和敲除菌株在相同的條件下進(jìn)行代謝評(píng)價(jià)。發(fā)酵條件分別為：YP培養(yǎng)基 (酵母膏2%、蛋白胨2%)，5%混合糖和10%混合糖 (葡萄糖∶木糖=1∶1)，30 ℃，初始接種量為0.5OD，250 mL三角瓶中發(fā)酵體系為80 mL、200 r/min。
1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)分析
按照5%混合糖發(fā)酵條件培養(yǎng)細(xì)胞，取9 h處的細(xì)胞送至北京金唯智公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并分析表達(dá)差異基因?；蚬δ茏⑨尯屯緩椒治霾捎肧GD的途徑數(shù)據(jù)庫(kù) (http://pathway.yeastgenome.org/)。YEASTRACT在線數(shù)據(jù)庫(kù)用來(lái)預(yù)測(cè)可能參與調(diào)控表達(dá)差異基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[26]。
1.2.7 葡萄糖、木糖、乙醇含量的測(cè)定
發(fā)酵液中的葡萄糖、木糖、乙醇含量利用HPLC進(jìn)行測(cè)定。采用裝有示差折光檢測(cè)器的安捷倫HPLC檢測(cè)儀器，伯樂(lè)Aminex HPX-87H分析柱，流動(dòng)相使用0.005 mol/L硫酸，流速為0.6 mL/min，溫度63 ℃。
2 結(jié)果與分析
2.1 SNF1和MIG1基因敲除菌的構(gòu)建
2.1.1 同源重組DNA片段的構(gòu)建
以釀酒酵母W32N55a基因組為模板，用PCR分別擴(kuò)增MIG1和SNF1基因上、下游同源臂片段，結(jié)果如圖2A所示；ZeoR和KanR抗性基因片段結(jié)果如圖 2B所示；SNF1基因敲除的同源片段“snf1-up-KanR-snf1-down”以及MIG1基因敲除的同源片段“mig1-up-ZeoR-mig1-down”結(jié)果如圖 2C所示。經(jīng)過(guò)測(cè)序結(jié)果正確。這樣，獲得的 DNA片段可以用于相應(yīng)目標(biāo)基因的敲除。
2.1.2 克隆子驗(yàn)證
用引物對(duì)F4/R4進(jìn)行PCR鑒定篩選出W32N55a(mig1△0) 的單克隆，用引物對(duì)F8/R8進(jìn)行PCR鑒定 篩 選 出 W32N55a (snf1△0) 和 W32N55a(mig1&snf1△0) 的單克隆，電泳結(jié)果如圖3所示。這些結(jié)果表明目標(biāo)突變菌株被成功構(gòu)建。
圖2 同源重組DNA片段的構(gòu)建Fig. 2 Construction of homologous recombination DNA fragments. (A) M: DNA marker; 1: snf1-up; 2: snf1-down;3: mig1-up; 4: mig1-down. (B) M: DNA marker; 1: ZeoR; 2: KanR. (C) M: DNA marker; 1: snf1-up-KanR-snf1-down;2 200bp; 2: mig1-up-ZeoR-mig1-down.
圖3 陽(yáng)性克隆子的驗(yàn)證Fig. 3 Screening for positive clones. (A) M: marker;lane 1–2: W32N55a (snf1Δ0), PCR with primer F8 and R8; lane 3–5: W32N55a (mig1Δ0), PCR with primer F4 and R4. (B) M: marker; lane 1–3: W32N55a (mig1&snf1Δ0), PCR with primer F8 and R8.
2.2 發(fā)酵結(jié)果分析
對(duì)原始菌 W32N55a、單敲除菌株 W32N55a(mig1△0) 和 W32N55a (snf1△0)、雙敲除菌株W32N55a (mig1&snf1△0) 進(jìn)行發(fā)酵，并測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液葡萄糖、木糖、乙醇含量的變化。對(duì)于5%混合糖中的葡萄糖消耗而言，從圖4A的發(fā)酵曲線可以看出，與原始菌相比，MIG1敲除菌降低，SNF1敲除菌基本不變，雙敲除菌顯著加快。根據(jù)表3中的發(fā)酵參數(shù)比較，原始菌株的最大葡萄糖消耗速率和最大葡萄糖比消耗速率分別為(3.05±0.33) g/(L·h) 和(2.65±0.29) g/(L·h·OD)，MIG1敲除菌相應(yīng)的發(fā)酵參數(shù)分別降低為原始菌株的0.76倍和0.70倍，而MIG1和SNF1雙敲除菌相應(yīng)的發(fā)酵參數(shù)分別提高到原始菌株的 1.28倍和 1.24倍。Klein等曾報(bào)道[27]，MIG1敲除菌的葡萄糖代謝能力下降，延滯期變長(zhǎng)，導(dǎo)致混合糖的綜合利用速度變慢。這與我們的結(jié)果相似。而且，SNF1的敲除可能在某種程度上消除了MIG1敲除對(duì)葡萄糖消耗的負(fù)面影響，甚至讓葡萄糖代謝更好。
對(duì)于5%混合糖中的木糖利用而言，從圖4B的發(fā)酵曲線可以看出，在0–3 h內(nèi)，原始菌可以代謝木糖，似乎沒(méi)有受到葡萄糖的抑制，當(dāng) 3 h以后，細(xì)胞似乎受到葡萄糖抑制效應(yīng)的影響，不再代謝木糖，直到9 h以后才繼續(xù)代謝木糖，此時(shí)混合糖中殘余的葡萄糖只剩下約3 g/L。與原始菌相比，MIG1敲除菌對(duì)混合糖中木糖的利用表現(xiàn)類似的代謝趨勢(shì)，表明MIG1的敲除對(duì)解除葡萄糖對(duì)木糖的抑制作用沒(méi)有作用。而SNF1敲除菌的木糖利用在6–9 h沒(méi)有停滯，表明SNF1的敲除可能有助于解除葡萄糖對(duì)木糖代謝的抑制作用。與SNF1敲除菌相似，MIG1和SNF1雙敲除菌木糖的利用在6–9 h沒(méi)有明顯的停滯，但木糖利用速率明顯變慢，原始菌株的最大木糖消耗速率和最大木糖比消耗速率分別為(2.23±0.04) g/(L·h) 和(1.94±0.03) g/(L·h·OD) (表 3)，雙敲除菌的相應(yīng)發(fā)酵參數(shù)降低為原始菌株的 0.44倍和 0.43倍，進(jìn)一步說(shuō)明葡萄糖對(duì)木糖抑制作用在某種程度上的解除可能歸功于SNF1的敲除而不是MIG1；總體而言，該菌利用木糖的速度與原始菌株相比明顯變慢。
對(duì)于 5%混合糖發(fā)酵最終的乙醇生產(chǎn)性能而言 (圖4C)，MIG1敲除會(huì)降低代謝葡萄糖產(chǎn)生乙醇的速率，其最大乙醇生產(chǎn)速率和最大乙醇比生產(chǎn)速率分別降低為原始菌株的0.80倍和0.74倍。曾有研究表明，MIG1敲除提高混合糖利用的能力有限，只有在特定的低水平葡萄糖條件下的限碳或限氮連續(xù)發(fā)酵中才能實(shí)現(xiàn)[9–10]。在我們利用豐富氮源培養(yǎng)的條件下，沒(méi)有觀察到MIG1敲除對(duì)木糖代謝和混合糖利用的促進(jìn)效應(yīng)，這可能與所采用的發(fā)酵條件不同有關(guān)。由于葡萄糖和木糖利用的疊加效應(yīng)，SNF1敲除菌與原始菌相比乙醇的生產(chǎn)速率相當(dāng)。MIG1和SNF1雙敲除菌的乙醇生產(chǎn)速率加快，最大乙醇生產(chǎn)速率和最大乙醇比生產(chǎn)速率分別提高到原始菌株的 1.08倍和1.11倍，這可能與SNF1敲除后部分解除了葡萄糖對(duì)木糖利用的延滯同時(shí)促進(jìn)了葡萄糖的代謝能力有關(guān)，MIG1在其中的作用比較復(fù)雜，尚難以分析。另外，對(duì)于最終糖醇轉(zhuǎn)化率，即乙醇產(chǎn)率而言 (表3)，敲除菌株與原始菌株之間并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。因此，MIG1和SNF1的雙敲除能夠促進(jìn)葡萄糖和木糖共利用，主要體現(xiàn)在提高混合糖產(chǎn)生乙醇的效率方面。
當(dāng)將混合糖濃度提到 10%時(shí)，與 5%混合糖的發(fā)酵結(jié)果相比，敲除菌對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的影響程度明顯降低。從表3中可以看出，敲除菌和原始菌的大部分發(fā)酵參數(shù)沒(méi)有明顯的差異，只有MIG1和SNF1雙敲除的最大葡萄糖比消耗速率降低為原始菌株的 0.82倍，而最大木糖比消耗速率提高到原始菌株的1.23倍。這個(gè)結(jié)果表明MIG1和SNF1的雙敲除對(duì)葡萄糖和木糖共利用也受不同糖濃度的影響，具體的機(jī)理尚待研究。
圖4 原始菌和敲除菌混合糖發(fā)酵Fig. 4 Evaluation for mixed xylose and glucose fermentation. (A, B, C) glucose consumption, xylose consumption and ethanol production profiles using 5% mixed sugar. Data represent the mean and standard error of duplicate cultures grown on each source.
2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析敲除菌的基因表達(dá)差異
為了從全基因組轉(zhuǎn)錄水平上解析MIG1和SNF1單敲除和雙敲除對(duì)酵母共利用葡萄糖和木糖產(chǎn)生影響的可能原因，我們對(duì) 5%混合糖發(fā)酵 9 h的酵母細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，并以相同發(fā)酵條件下的原始菌株 W32N55a為對(duì)照，分析了敲除菌中發(fā)生明顯表達(dá)差異的基因，并結(jié)合 SGD數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋和途徑分析 (圖5)，對(duì)這些基因可能影響的細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行探究。與原始菌株比，敲除菌中發(fā)生明顯表達(dá)差異的基因數(shù)量情況如下：MIG1敲除菌有12個(gè)基因 (上調(diào)表達(dá)的8個(gè)，下調(diào)表達(dá)的4個(gè))；SNF1敲除菌有25個(gè)(上調(diào)表達(dá)的23個(gè)，下調(diào)表達(dá)的2個(gè))；MIG1和SNF1雙敲菌株有47個(gè) (上調(diào)表達(dá)的41個(gè)，下調(diào)表達(dá)的6個(gè))。其中，MIG1敲除菌與MIG1和SNF1雙敲除菌沒(méi)有共享的表達(dá)上調(diào)基因，SNF1敲除菌與MIG1和SNF1雙敲除菌共享20個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，MIG1和SNF1雙敲除菌特有21個(gè)表達(dá)上調(diào)基因。整體而言，MIG1和SNF1的敲除導(dǎo)致更多的基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)，也就是說(shuō)這些基因的轉(zhuǎn)錄可能是受MIG1或 (和)SNF1直接或間接抑制的，敲除MIG1和SNF1則解除了這些抑制，從而使細(xì)胞更有利于共利用葡萄糖和木糖。
通過(guò)進(jìn)一步考察表達(dá)差異基因的功能注釋和途徑分析，可以更清晰地了解在混合糖條件下可能受MIG1和SNF1調(diào)控的基因和途徑。MIG1敲除菌中上調(diào)和下調(diào)的基因功能如圖 5B所示。上調(diào)的基因與細(xì)胞壁成分、色氨酸的降解、細(xì)胞核mRNA輸出、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、熱激轉(zhuǎn)錄因子、蛋白折疊、精氨酸吸收以及甘氨酸代謝有關(guān)，這些基因可能直接或間接受MIG1的抑制。下調(diào)的基因與鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白的合成和降解以及呼吸生長(zhǎng)調(diào)控有關(guān)，這些基因可能是直接或間接受MIG1的激活。需要注意的是，編碼低親和力高轉(zhuǎn)運(yùn)性能的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HXT1在MIG1敲除菌中表達(dá)上調(diào)。曾有報(bào)道指出[28]，HXT1在葡萄糖濃度較低時(shí)被Rgt1阻遏，Mig1并不是HXT1的調(diào)控蛋白，另外，其他葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HXT2/HXT3/HXT4是由 Mig1/Mig2和 Rgt1共同阻遏調(diào)控。由于MIG1敲除菌中只有HXT1表達(dá)上調(diào)，而其他葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)未發(fā)生明顯變化，意味著這一結(jié)果可能是由非MIG1敲除的因素造成的。重新審視基因組測(cè)序分析的取樣點(diǎn) (圖4A，9 h) 時(shí)，發(fā)現(xiàn)MIG1敲除菌的殘留葡萄糖濃度為10 g/L左右，明顯高于原始菌株的3 g/L左右。因此，與原始菌株相比，高水平的殘留葡萄糖濃度可能造成了MIG1敲除菌中HXT1表達(dá)的解抑制。另外，高水平的殘留葡萄糖濃度還可能造成MIG1敲除對(duì)基因表達(dá)的影響被高水平殘留葡萄糖的調(diào)控所掩蓋，其具體情況尚待研究。但是從分析混合糖條件下影響木糖代謝變化相關(guān)的基因表達(dá)差異的角度，我們可以忽略葡萄糖殘留濃度的影響，而認(rèn)為所有樣品都是在有葡萄糖的情況下進(jìn)行比較。
SNF1敲除菌中明顯上調(diào)表達(dá)的基因有23個(gè)，其中20個(gè)基因在MIG1和SNF1雙敲除菌中表達(dá)也明顯上調(diào) (圖 5A)，而在MIG1敲除菌中表達(dá)沒(méi)有發(fā)生明顯變化 (圖 5B)。這一比較結(jié)果說(shuō)明這20個(gè)基因可能是受Snf1特異負(fù)調(diào)控，而不受Mig1的調(diào)控。也就是說(shuō)，只要SNF1被敲除，這20個(gè)基因的表達(dá)就會(huì)被解抑制。非常有趣的是，這 20個(gè)基因明顯富集在與氨基酸 (主要包括精氨酸、脯氨酸和絲氨酸) 和其他氮源 (尿囊素、尿素和氨) 的吸收和降解相關(guān)的途徑 (圖 5C)，而這些基因是氮分解代謝物阻遏 (NCR) 基因，受氮源的營(yíng)養(yǎng)水平調(diào)控[29-30]。精氨酸可以作為酵母偏好的氮源，在Can1、Car1和Car2以及Pro3的作用下產(chǎn)生脯氨酸；脯氨酸由 Put4、Put1和Put2的作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酸，再由Gdh2作用降解為氨和α-酮戊二酸，α-酮戊二酸可以經(jīng)由TCA循環(huán)進(jìn)入碳中心代謝，而氨又可以進(jìn)入氨基酸代謝。另外，絲氨酸在Agp1和Cha1的作用下降解為氨和丙酮酸，丙酮酸進(jìn)入碳代謝途徑進(jìn)而生產(chǎn)乙醇。與原始菌株相比，SNF1敲除菌可以更快利用木糖可能與胞內(nèi)更豐富的氮源有關(guān)。綜上所述，氮分解代謝物阻遏基因表達(dá)上調(diào)，可能更有利于細(xì)胞吸收更多的氮源，從而使細(xì)胞積累更多的氨，更有利于細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝，比如蛋白質(zhì)合成前體——氨基酸的積累；同時(shí)這些氨基酸和氮源降解的產(chǎn)物又與碳中心代謝途徑相連，可能影響細(xì)胞的糖代謝，其分子機(jī)理尚待研究。
表3 原始菌和敲除菌發(fā)酵參數(shù)的比較Table 3 Comparison of fermentation parameters between wild type and gene deletion strains
圖5 表達(dá)差異基因的功能和參與途徑示意圖Fig. 5 Gene function and pathway mapping of differentially expressed genes. (A) Venn diagram among differentially expressed genes in W32N55a (mig1Δ0), W32N55a (snf1Δ0) and W32N55a (mig1&snf1Δ0) by comparing with wild type strain W32N55a. (B) Up- and down-regulated genes in W32N55a (mig1Δ0) compared with wild type strain W32N55a. (C) Overlapped up-regulated genes in W32N55a (snf1Δ0) and W32N55a (mig1&snf1Δ0) compared with wild type strain W32N55a. (D) Unique up- and down-regulated genes in W32N55a (snf1Δ0) and W32N55a (mig1&snf1Δ0)compared with wild type strain W32N55a. Red: up-regulated; Green: down-regulated.
在MIG1和SNF1雙敲除菌中發(fā)現(xiàn)的41個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因，除了在SNF1敲除菌中也發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的20個(gè)基因外，還有21個(gè)基因。這21個(gè)基因在MIG1敲除菌中表達(dá)未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明這21基因，可能是受Snf1和Mig1共同負(fù)調(diào)控的作用。也就是說(shuō)，單獨(dú)敲除MIG1和SNF1中的任何一個(gè)，都不會(huì)影響這21個(gè)基因的表達(dá)，當(dāng)同時(shí)敲除這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，這 21個(gè)基因的表達(dá)就會(huì)被解抑制。代謝途徑分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的富集。不過(guò)，在Snf1調(diào)控功能缺失的基礎(chǔ)上，MIG1的敲除會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致參與氨基酸吸收和降解途徑的個(gè)別基因表達(dá)上調(diào)，包括DIP5、BAP2、ARO9、ARO10、GAD1和ASP3-1(圖 5D)。另外，還包括磷酸戊糖途徑中的SOL4和GND2以及參與線粒體丙酮酸合成的CYB2，其他上調(diào)基因還包括一些與膜結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)的基因。以上結(jié)果暗示，在SNF1敲除的基礎(chǔ)上，MIG1的敲除可能造成細(xì)胞對(duì)其他氨基酸氮源的偏好，同時(shí)影響到磷酸戊糖途徑和線粒體丙酮酸代謝，從而造成細(xì)胞更傾向于快速利用葡萄糖，同時(shí)雖然木糖的利用速度降低，但并不會(huì)受到抑制，表明葡萄糖對(duì)木糖代謝的抑制作用部分得到緩解，而且最終導(dǎo)致代謝混合糖積累乙醇的速度變快。
2.4 Mig1和Snf1對(duì)差異表達(dá)基因的層級(jí)調(diào)控
利用 YEASTRACT可以分析可能參與表達(dá)差異基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，從而有助于解析在混合糖條件下Mig1和Snf1如何調(diào)控氨基酸和氮源代謝進(jìn)而影響葡萄糖和木糖的共利用 (圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNF1敲除菌與MIG1和SNF1雙敲除菌共有的20個(gè)表達(dá)上調(diào)基因均受Gln3調(diào)控 (P-value小于0.000 1)；另外，GAT1編碼調(diào)控NCR基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，其轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)。Gln3和Gat1是NCR基因表達(dá)必需的轉(zhuǎn)錄激活因子，并且Snf1位于基因表達(dá)層級(jí)的上游來(lái)調(diào)控 Gln3的活性[31]。之前的諸多研究指出 Snf1只在葡萄糖缺乏的條件下才起作用[9,12]。然而 Nicastro等最新的研究表明[32]，Snf1可以在有葡萄糖存在的條件下起調(diào)控作用，SNF1的敲除會(huì)造成細(xì)胞吸收和代謝氨基酸的能力加強(qiáng)，而且這種現(xiàn)象在葡萄糖濃度低 (2%) 的條件下比高濃度 (5%) 時(shí)更為明顯。也就是說(shuō)，即便在葡萄糖存在的條件下，Snf1存在某種活性形式可以參與氨基酸和氮源代謝相關(guān)基因的抑制調(diào)控，這種相應(yīng)的 Snf1形式我們界定為 Snf1in，在原始菌株中，混合糖條件下Snf1in可能抑制Gln3的活性，從而抑制這些 NCR基因的表達(dá)。相應(yīng)地，受葡萄糖代謝影響的Snf1形式我們界定為Snf1dp。
另一方面，經(jīng)過(guò)YEASTRACT分析，MIG1和SNF1雙敲除菌特有的21個(gè)表達(dá)上調(diào)基因均受Gcn4的調(diào)控，Gcn4是參與調(diào)控氨基酸合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子。這 21個(gè)基因的負(fù)調(diào)控可能是通過(guò)兩條路徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，一條是經(jīng)由不受葡萄糖代謝影響的Snf1in形式，在原始菌株中，混合糖條件下Snf1in會(huì)抑制Gcn4的活性，從而抑制這21個(gè)基因的表達(dá)；另一條是通過(guò)Mig1對(duì)這21個(gè)基因的抑制作用，Snf1dp是Mig1上游層級(jí)的負(fù)調(diào)控因子，在葡萄糖存在的條件下不具有活性。基于以上分析，MIG1敲除菌中，由于Snf1in的存在，會(huì)抑制Gln3和Gcn4的活性，因此受這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活的基因水平不會(huì)發(fā)生變化；SNF1敲除菌中，Gln3和Gcn4的活性得到解抑制，因此，受 Gln3激活的 20個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，而受 Gcn4激活的21個(gè)基因，由于依然受Mig1的抑制，其表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化；當(dāng)在SNF1雙敲除菌中繼續(xù)敲除MIG1時(shí)，Mig1對(duì)這21個(gè)基因的抑制得到解除，從而基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)。至于以上層級(jí)調(diào)控的具體細(xì)節(jié)以及Snf1in在葡萄糖存在條件下的形式尚待研究。
基于以上分析，在混合糖發(fā)酵條件下，一方面不受葡萄糖代謝影響的Snf1in具有活性，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄激活因子Gln3和Gcn4的功能，分別經(jīng)由Snf1in-Gln3和Snf1in-Gcn4途徑抑制兩部分參與氨基酸吸收和降解等功能基因的表達(dá)；另一方面，由于葡萄糖的存在，受葡萄糖代謝影響的Snf1dp處于非活性狀態(tài)，不能夠磷酸化失活 Mig1，因此Mig1也可能抑制經(jīng)由Snf1in-Gcn4途徑所抑制的那部分基因的表達(dá)，其中包括磷酸戊糖途徑氧化階段的兩個(gè)基因——SOL4(6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶)和GND2(編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶) (圖6)。無(wú)論是單敲除SNF1還是雙敲除SNF1和MIG1，與原始菌株相比，木糖的利用在3–9 h之間都沒(méi)有明顯地被延滯 (圖4B)，而且只要SNF1被敲除，經(jīng)由 Snf1in-Gln3途徑抑制的基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)，這表明經(jīng)由Snf1in-Gln3途徑抑制的這些參與氨基酸吸收和降解功能的基因 (圖 5、圖 6)，其表達(dá)的解抑制是實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖的同步利用所必需的。與單敲除SNF1相比，SNF1和MIG1雙敲除菌的葡萄糖代謝速率明顯加快 (圖4A，表3)，而木糖代謝速率大大降低 (圖4B，表3)，與此同時(shí)，由于MIG1也被敲除，經(jīng)由Snf1in-Gcn4途徑抑制的基因表達(dá)發(fā)生上調(diào) (圖5、圖6)，說(shuō)明這些基因很可能參與細(xì)胞對(duì)葡萄糖和木糖代謝流的控制。另外，SNF1和MIG1雙敲除能夠加快乙醇的積累 (圖 4C，表 3)，從而改善葡萄糖和木糖的共利用，這可能主要?dú)w功于葡萄糖代謝能力的大幅度加快。雖然曾有研究表明[7–8]，磷酸戊糖途徑相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)有利于促進(jìn)木糖代謝，但是在SNF1和MIG1雙敲除菌中，表達(dá)上調(diào)的SOL4和GND2以及其他經(jīng)由Snf1in-Gcn4途徑抑制的基因所起的作用依然有待進(jìn)一步研究。
圖6 Mig1和Snf1對(duì)表達(dá)差異的基因不同層級(jí)的調(diào)控Fig. 6 Mig1 and Snf1 in a hierarchical regulatory network for regulating differentially expressed genes. Snf1in: Snf1 analog independent of glucose metabolism; Snf1in: Snf1 analog dependent of glucose metabolism.
3 結(jié)論
以釀酒酵母工程菌株W32N55a為出發(fā)菌株，通過(guò)同源重組技術(shù)分別對(duì)葡萄糖阻遏效應(yīng)中的關(guān)鍵基因SNF1和MIG1基因進(jìn)行單敲除和雙敲除，評(píng)價(jià)了敲除菌株共利用葡萄糖和木糖的性能。在低濃度混合糖條件下MIG1單敲除對(duì)混合糖的共利用影響不大，SNF1單敲除明顯提高了木糖的利用效率，MIG1和SNF1雙敲除明顯促進(jìn)葡萄糖的利用效率同時(shí)可以以較慢的速度共利用木糖，從而積累乙醇的效率得到提高；當(dāng)混合糖濃度提高到 10%時(shí)，MIG1和SNF1的單敲除效應(yīng)變得不明顯，MIG1和SNF1雙敲除的效應(yīng)依然很明顯，但影響程度已經(jīng)明顯低于低濃度混合糖的情況。我們利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了在低濃度混合糖條件下MIG1和SNF1單敲除和雙敲除對(duì)全基因組水平上基因表達(dá)譜的影響。SNF1單敲除后，一些氮分解代謝物阻遏基因表達(dá)明顯上調(diào)，這可能是導(dǎo)致SNF1單敲除菌利用木糖效率提高的主要原因。MIG1和SNF1雙敲除菌除了上述SNF1單敲除對(duì)轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生的影響外，還會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致參與氨基酸分解代謝相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，可能是造成雙敲除菌傾向于更快利用葡萄糖但同時(shí)可以共利用木糖的主要原因。我們的研究結(jié)果暗示了Snf1可能以依賴于葡萄糖代謝和不依賴于葡萄糖代謝這兩種形式參與 NCR基因的層級(jí)調(diào)控，這些研究發(fā)現(xiàn)將有助于進(jìn)一步提高釀酒酵母工程菌共利用葡萄糖和木糖的效率。
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2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308
3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049
利用可再生的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料和生物基化學(xué)品是解決全球可持續(xù)發(fā)展所面臨的資源和環(huán)境問(wèn)題的重要途徑之一。木質(zhì)纖維素主要由纖維素 (38%–50%)、半纖維素 (23%–32%) 和木質(zhì)素 (15%–30%) 組成[1]。當(dāng)前工業(yè)條件下，木質(zhì)纖維素經(jīng)過(guò)預(yù)處理技術(shù)解離出纖維素和半纖維素，隨后被纖維素酶等水解成微生物可發(fā)酵的糖類[2]，水解液中木糖的含量?jī)H次于葡萄糖。目前，如何實(shí)現(xiàn)木糖的高效轉(zhuǎn)化以及與葡萄糖的共利用依然是阻礙木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)經(jīng)濟(jì)性利用的主要關(guān)鍵因素。
自然界中有許多微生物包括細(xì)菌、真菌和酵母菌可以利用木糖，而酵母菌由于具有較強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用屬性，引起人們的廣泛關(guān)注。利用木糖的酵母菌主要可以分為兩大類：一類是以樹(shù)干畢赤酵母Pichia stipitis為代表的天然利用木糖的酵母菌，另一類是攜帶外源木糖代謝途徑的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae工程菌。然而，葡萄糖阻遏效應(yīng) (Glucose repression) 在酵母菌糖代謝調(diào)控中普遍存在。無(wú)論是天然菌[3]還是工程菌[4–5]，在利用葡萄糖和木糖的混合糖時(shí)都表現(xiàn)出葡萄糖的優(yōu)先利用現(xiàn)象，也就是說(shuō)，木糖只有在葡萄糖耗盡后才開(kāi)始被利用，從而導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程的總糖轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度降低。在混合糖條件下釀酒酵母工程菌不能速效利用木糖的原因之一可能是由于葡萄糖抑制木糖代謝所需基因的表達(dá)，葡萄糖對(duì)這些基因表達(dá)抑制作用的解除或緩解有利于促進(jìn)混合糖條件下木糖的利用效率。有研究表明，釀酒酵母工程菌的一些糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以非特異地轉(zhuǎn)運(yùn)木糖，例如Hxt7，但在葡萄糖存在條件下HXT7的表達(dá)受抑制，從而限制混合糖條件下木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用[6]。Wahlbom 等[7]通過(guò)研究化學(xué)誘變獲得的木糖代謝能力提高的突變工程菌中基因表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)該突變株中一些參與糖轉(zhuǎn)運(yùn)、初始木糖代謝和磷酸戊糖途徑的基因表達(dá)加強(qiáng)，而且突變株在木糖唯一碳源條件下葡萄糖阻遏效應(yīng)關(guān)鍵抑制因子MIG1的表達(dá)水平也降低，但未明確指出表明MIG1是否直接參與葡萄糖抑制木糖代謝的調(diào)控。de Figueiredo Vilela等[8]通過(guò)進(jìn)化工程 (Evolutionary engineering) 獲得木糖代謝效率提升的菌株，與出發(fā)菌株相比，該進(jìn)化菌的HXT2(編碼低親和力己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白) 和TAL1(編碼磷酸戊糖途徑非氧化階段的轉(zhuǎn)醛酶) 表達(dá)水平均升高。另一方面有研究表明，MIG1的敲除能部分緩解工程菌中葡萄糖對(duì)木糖代謝的抑制作用，提高木糖在葡萄糖保持低水平的限碳或限氮連續(xù)發(fā)酵時(shí)的發(fā)酵能力[9–10]。另外，呼吸缺陷菌株經(jīng)過(guò)工程改造和進(jìn)一步的適應(yīng)性進(jìn)化后，木糖的發(fā)酵能力得到提高，這可能與經(jīng)由 Snf1/Mig1的葡萄糖感應(yīng)和阻遏調(diào)控途徑受到擾動(dòng)有關(guān)[11]。雖然以上研究表明葡萄糖阻遏木糖代謝所需基因的表達(dá)可能是在混合糖條件下工程菌不能速效利用木糖的原因之一，另一方面也表明解除或擾動(dòng)葡萄糖阻遏效應(yīng)的關(guān)鍵因子可能有助于實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖的共利用。然而，尚無(wú)研究報(bào)道明確指出MIG1和/或SNF1如何影響混合糖條件下木糖代謝所需基因的表達(dá)調(diào)控。
關(guān)于釀酒酵母的葡萄糖阻遏效應(yīng)已經(jīng)有大量的研究[12–15]。MIG1和SNF1是葡萄糖阻遏效應(yīng)的兩個(gè)關(guān)鍵因子。MIG1基因編碼一個(gè)含有2個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，可以結(jié)合到一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域，在葡萄糖存在的條件下抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄，例如麥芽糖、蔗糖和半乳糖代謝相關(guān)的酶基因[16–17]。Mig1受 Snf1的負(fù)調(diào)控。SNF1編碼一個(gè)蛋白激酶，是碳代謝中的中心調(diào)節(jié)因子，可用于解除葡萄糖對(duì)次級(jí)碳源的阻礙作用，如麥芽糖、半乳糖、蔗糖等。在葡萄糖存在的條件下，Snf1的活性受到抑制[18–19]。在沒(méi)有葡萄糖或葡萄糖濃度很低的條件下，Snf1磷酸化 Mig1，使細(xì)胞核中的 Mig1轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，不能再結(jié)合到基因啟動(dòng)子上抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而導(dǎo)致葡萄糖所抑制基因的表達(dá)解抑制[20–21]。因此，葡萄糖阻遏效應(yīng)可以歸結(jié)為3個(gè)連續(xù)的負(fù)調(diào)控步驟：葡萄糖抑制Snf1的活性，Snf1抑制Mig1轉(zhuǎn)錄抑制因子的功能，Mig1抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。
本實(shí)驗(yàn)利用前期構(gòu)建的一株可以利用木糖的釀酒酵母工程菌株W32N55a，通過(guò)同源重組技術(shù)分別對(duì)葡萄糖阻遏效應(yīng)中的關(guān)鍵基因SNF1和MIG1基因進(jìn)行單敲除和雙敲除，然后評(píng)價(jià)了敲除菌株對(duì)葡萄糖和木糖共利用的性能，并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 (RNA-seq) 技術(shù)分析了在低濃度混合糖條件下MIG1和SNF1單敲除和雙敲除對(duì)全基因組水平上基因表達(dá)譜的影響。發(fā)現(xiàn)SNF1的敲除以及與MIG1的雙敲除有利于葡萄糖和木糖的共利用，初步揭示了Mig1和Snf1在負(fù)調(diào)控氮分解阻遏基因中的作用，同時(shí)，為進(jìn)一步提高葡萄糖和木糖的共利用提供了依據(jù)和線索。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和質(zhì)粒
本文所用菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。
1.1.2 引物
根據(jù)Saccharomyces Genome Database (SGD，ID：S000003003) 中報(bào)道的釀酒酵母中MIG1基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)同源臂片段擴(kuò)增引物F1、R1和F2、R2；根據(jù)質(zhì)粒pYES2/CT-ZGO-ZeoR中ZeoR表達(dá)框，設(shè)計(jì)引物 F3、R3；敲除驗(yàn)證引物 F4、R4。根據(jù)SGD (ID：S000002885) 中報(bào)道的釀酒酵母中SNF1基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)同源臂片段擴(kuò)增引物 F 5、R 5和 F 6、R 6；根據(jù)質(zhì)粒pRS313-ZGO-KanR中KanR表達(dá)框，設(shè)計(jì)引物F7、R7；敲除驗(yàn)證引物F8、R8。引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。本文所用引物見(jiàn)表2。
表1 本研究使用的釀酒酵母菌株和質(zhì)粒Table 1 S. cerevisiae strains and plasmids used in this study
PsXR: xylose reductase fromP. stipitis;PsXDH: xylitol dehydrogenase fromP. stipitis;ScXK: xylulokinase fromS. cerevisiae.
表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study
1.1.3 主要試劑和儀器
TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；博來(lái)霉素、G418購(gòu)自北京索萊寶公司；葡萄糖、木糖購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)有限公司。核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PTC100型PCR儀購(gòu)自美國(guó)M J Research公司等。
1.2 方法
1.2.1 SNF1和MIG1基因同源重組DNA片段的構(gòu)建
MIG1基因敲除同源片段的構(gòu)建過(guò)程如圖1A所示。以 W32N55a菌株基因組為模板，用引物對(duì)F1/R1和F2/R2，分別擴(kuò)增MIG1基因兩端同源臂mig1-up和mig1-down，各500 bp左右。以質(zhì)粒 pYES2/CT-ZGO-ZeoR為模板，用引物對(duì)F3/R3擴(kuò)增基因ZeoR表達(dá)框，大小為1 200 bp左右。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ將相應(yīng)片段分別酶切，用 T4 DNA連接酶將獲得的片段mig1-up、ZeoR、mig1-down連接起來(lái)獲得MIG1基因敲除同源片段“mig1-up-ZeoR-mig1-down”，并用引物對(duì)F1/R2擴(kuò)增此片段，大小約為2 200 bp。
圖1 MIG1和SNF1基因敲除同源片段的構(gòu)建過(guò)程Fig. 1 Working flow for MIG1 and SNF1 disruption cassette construction.
SNF1基因敲除組同源片段的構(gòu)建過(guò)程如圖1B所示。以W32N55a菌株基因組為模板，用引物對(duì) F5/R5和 F6/R6，分別擴(kuò)增SNF1基因兩端同源臂snf1-up和snf1-down，各500 bp左右。以質(zhì)粒pRS313-ZGO-KanR為模板，用引物對(duì)F7/R7擴(kuò)增基因KanR表達(dá)框，大小為1 500 bp左右。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NotⅠ將相應(yīng)片段分別酶切，用T4 DNA連接酶將片段snf1-up、KanR、snf1-down接起來(lái)獲得SNF1基因敲除同源片段“snf1-up-KanR-snf1-down”，并用引物對(duì) F5/R6擴(kuò)增敲除同源片段，大小約為2 500 bp。
敲除同源片段構(gòu)建過(guò)程中各片段的合成都采用高保真的pfuDNA聚合酶。
1.2.2 酵母細(xì)胞培養(yǎng)，基因組提取和PCR
[22–24]進(jìn)行操作。
1.2.3 SNF1基因和MIG1基因敲除同源片段的轉(zhuǎn)化及克隆子篩選
采用LiAc/SS-DNA/PEG高效酵母轉(zhuǎn)化法[25]，將MIG1基因敲除同源片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母W32N55a感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含100 μg/mL博來(lái)霉素的YPD平板 (酵母膏2%、蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%) 上，30 ℃培養(yǎng)2–5 d單菌落出現(xiàn)。將SNF1基因敲除同源片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母 W32N55a感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含200 μg/mL G418的YPD (酵母膏 1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂糖2%) 平板上，30 ℃培養(yǎng)2–5 d單菌落出現(xiàn)。將SNF1基因敲除同源片段同時(shí)轉(zhuǎn)化至已經(jīng)敲除掉MIG1的釀酒酵母W32N55a (mig1Δ0) 感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含 100 μg/mL的博來(lái)霉素和200 μg/mL G418 的 YPD 平板上，30 ℃培養(yǎng) 2–5 d單菌落出現(xiàn)。
1.2.4 克隆子驗(yàn)證
將平板上出現(xiàn)的單菌落，挑選至 YPD液體培養(yǎng)中，提取基因組，用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR驗(yàn)證。用引物對(duì)F4/R4驗(yàn)證MIG1基因敲除菌，用引物對(duì)F8/R8驗(yàn)證SNF1基因敲除菌，用這兩對(duì)引物驗(yàn)證雙敲菌株。
1.2.5 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
將親本菌株和敲除菌株在相同的條件下進(jìn)行代謝評(píng)價(jià)。發(fā)酵條件分別為：YP培養(yǎng)基 (酵母膏2%、蛋白胨2%)，5%混合糖和10%混合糖 (葡萄糖∶木糖=1∶1)，30 ℃，初始接種量為0.5OD，250 mL三角瓶中發(fā)酵體系為80 mL、200 r/min。
1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)分析
按照5%混合糖發(fā)酵條件培養(yǎng)細(xì)胞，取9 h處的細(xì)胞送至北京金唯智公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并分析表達(dá)差異基因?；蚬δ茏⑨尯屯緩椒治霾捎肧GD的途徑數(shù)據(jù)庫(kù) (http://pathway.yeastgenome.org/)。YEASTRACT在線數(shù)據(jù)庫(kù)用來(lái)預(yù)測(cè)可能參與調(diào)控表達(dá)差異基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[26]。
1.2.7 葡萄糖、木糖、乙醇含量的測(cè)定
發(fā)酵液中的葡萄糖、木糖、乙醇含量利用HPLC進(jìn)行測(cè)定。采用裝有示差折光檢測(cè)器的安捷倫HPLC檢測(cè)儀器，伯樂(lè)Aminex HPX-87H分析柱，流動(dòng)相使用0.005 mol/L硫酸，流速為0.6 mL/min，溫度63 ℃。
2 結(jié)果與分析
2.1 SNF1和MIG1基因敲除菌的構(gòu)建
2.1.1 同源重組DNA片段的構(gòu)建
以釀酒酵母W32N55a基因組為模板，用PCR分別擴(kuò)增MIG1和SNF1基因上、下游同源臂片段，結(jié)果如圖2A所示；ZeoR和KanR抗性基因片段結(jié)果如圖 2B所示；SNF1基因敲除的同源片段“snf1-up-KanR-snf1-down”以及MIG1基因敲除的同源片段“mig1-up-ZeoR-mig1-down”結(jié)果如圖 2C所示。經(jīng)過(guò)測(cè)序結(jié)果正確。這樣，獲得的 DNA片段可以用于相應(yīng)目標(biāo)基因的敲除。
2.1.2 克隆子驗(yàn)證
用引物對(duì)F4/R4進(jìn)行PCR鑒定篩選出W32N55a(mig1△0) 的單克隆，用引物對(duì)F8/R8進(jìn)行PCR鑒定 篩 選 出 W32N55a (snf1△0) 和 W32N55a(mig1&snf1△0) 的單克隆，電泳結(jié)果如圖3所示。這些結(jié)果表明目標(biāo)突變菌株被成功構(gòu)建。
圖2 同源重組DNA片段的構(gòu)建Fig. 2 Construction of homologous recombination DNA fragments. (A) M: DNA marker; 1: snf1-up; 2: snf1-down;3: mig1-up; 4: mig1-down. (B) M: DNA marker; 1: ZeoR; 2: KanR. (C) M: DNA marker; 1: snf1-up-KanR-snf1-down;2 200bp; 2: mig1-up-ZeoR-mig1-down.
圖3 陽(yáng)性克隆子的驗(yàn)證Fig. 3 Screening for positive clones. (A) M: marker;lane 1–2: W32N55a (snf1Δ0), PCR with primer F8 and R8; lane 3–5: W32N55a (mig1Δ0), PCR with primer F4 and R4. (B) M: marker; lane 1–3: W32N55a (mig1&snf1Δ0), PCR with primer F8 and R8.
2.2 發(fā)酵結(jié)果分析
對(duì)原始菌 W32N55a、單敲除菌株 W32N55a(mig1△0) 和 W32N55a (snf1△0)、雙敲除菌株W32N55a (mig1&snf1△0) 進(jìn)行發(fā)酵，并測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液葡萄糖、木糖、乙醇含量的變化。對(duì)于5%混合糖中的葡萄糖消耗而言，從圖4A的發(fā)酵曲線可以看出，與原始菌相比，MIG1敲除菌降低，SNF1敲除菌基本不變，雙敲除菌顯著加快。根據(jù)表3中的發(fā)酵參數(shù)比較，原始菌株的最大葡萄糖消耗速率和最大葡萄糖比消耗速率分別為(3.05±0.33) g/(L·h) 和(2.65±0.29) g/(L·h·OD)，MIG1敲除菌相應(yīng)的發(fā)酵參數(shù)分別降低為原始菌株的0.76倍和0.70倍，而MIG1和SNF1雙敲除菌相應(yīng)的發(fā)酵參數(shù)分別提高到原始菌株的 1.28倍和 1.24倍。Klein等曾報(bào)道[27]，MIG1敲除菌的葡萄糖代謝能力下降，延滯期變長(zhǎng)，導(dǎo)致混合糖的綜合利用速度變慢。這與我們的結(jié)果相似。而且，SNF1的敲除可能在某種程度上消除了MIG1敲除對(duì)葡萄糖消耗的負(fù)面影響，甚至讓葡萄糖代謝更好。
對(duì)于5%混合糖中的木糖利用而言，從圖4B的發(fā)酵曲線可以看出，在0–3 h內(nèi)，原始菌可以代謝木糖，似乎沒(méi)有受到葡萄糖的抑制，當(dāng) 3 h以后，細(xì)胞似乎受到葡萄糖抑制效應(yīng)的影響，不再代謝木糖，直到9 h以后才繼續(xù)代謝木糖，此時(shí)混合糖中殘余的葡萄糖只剩下約3 g/L。與原始菌相比，MIG1敲除菌對(duì)混合糖中木糖的利用表現(xiàn)類似的代謝趨勢(shì)，表明MIG1的敲除對(duì)解除葡萄糖對(duì)木糖的抑制作用沒(méi)有作用。而SNF1敲除菌的木糖利用在6–9 h沒(méi)有停滯，表明SNF1的敲除可能有助于解除葡萄糖對(duì)木糖代謝的抑制作用。與SNF1敲除菌相似，MIG1和SNF1雙敲除菌木糖的利用在6–9 h沒(méi)有明顯的停滯，但木糖利用速率明顯變慢，原始菌株的最大木糖消耗速率和最大木糖比消耗速率分別為(2.23±0.04) g/(L·h) 和(1.94±0.03) g/(L·h·OD) (表 3)，雙敲除菌的相應(yīng)發(fā)酵參數(shù)降低為原始菌株的 0.44倍和 0.43倍，進(jìn)一步說(shuō)明葡萄糖對(duì)木糖抑制作用在某種程度上的解除可能歸功于SNF1的敲除而不是MIG1；總體而言，該菌利用木糖的速度與原始菌株相比明顯變慢。
對(duì)于 5%混合糖發(fā)酵最終的乙醇生產(chǎn)性能而言 (圖4C)，MIG1敲除會(huì)降低代謝葡萄糖產(chǎn)生乙醇的速率，其最大乙醇生產(chǎn)速率和最大乙醇比生產(chǎn)速率分別降低為原始菌株的0.80倍和0.74倍。曾有研究表明，MIG1敲除提高混合糖利用的能力有限，只有在特定的低水平葡萄糖條件下的限碳或限氮連續(xù)發(fā)酵中才能實(shí)現(xiàn)[9–10]。在我們利用豐富氮源培養(yǎng)的條件下，沒(méi)有觀察到MIG1敲除對(duì)木糖代謝和混合糖利用的促進(jìn)效應(yīng)，這可能與所采用的發(fā)酵條件不同有關(guān)。由于葡萄糖和木糖利用的疊加效應(yīng)，SNF1敲除菌與原始菌相比乙醇的生產(chǎn)速率相當(dāng)。MIG1和SNF1雙敲除菌的乙醇生產(chǎn)速率加快，最大乙醇生產(chǎn)速率和最大乙醇比生產(chǎn)速率分別提高到原始菌株的 1.08倍和1.11倍，這可能與SNF1敲除后部分解除了葡萄糖對(duì)木糖利用的延滯同時(shí)促進(jìn)了葡萄糖的代謝能力有關(guān)，MIG1在其中的作用比較復(fù)雜，尚難以分析。另外，對(duì)于最終糖醇轉(zhuǎn)化率，即乙醇產(chǎn)率而言 (表3)，敲除菌株與原始菌株之間并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。因此，MIG1和SNF1的雙敲除能夠促進(jìn)葡萄糖和木糖共利用，主要體現(xiàn)在提高混合糖產(chǎn)生乙醇的效率方面。
當(dāng)將混合糖濃度提到 10%時(shí)，與 5%混合糖的發(fā)酵結(jié)果相比，敲除菌對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的影響程度明顯降低。從表3中可以看出，敲除菌和原始菌的大部分發(fā)酵參數(shù)沒(méi)有明顯的差異，只有MIG1和SNF1雙敲除的最大葡萄糖比消耗速率降低為原始菌株的 0.82倍，而最大木糖比消耗速率提高到原始菌株的1.23倍。這個(gè)結(jié)果表明MIG1和SNF1的雙敲除對(duì)葡萄糖和木糖共利用也受不同糖濃度的影響，具體的機(jī)理尚待研究。
圖4 原始菌和敲除菌混合糖發(fā)酵Fig. 4 Evaluation for mixed xylose and glucose fermentation. (A, B, C) glucose consumption, xylose consumption and ethanol production profiles using 5% mixed sugar. Data represent the mean and standard error of duplicate cultures grown on each source.
2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析敲除菌的基因表達(dá)差異
為了從全基因組轉(zhuǎn)錄水平上解析MIG1和SNF1單敲除和雙敲除對(duì)酵母共利用葡萄糖和木糖產(chǎn)生影響的可能原因，我們對(duì) 5%混合糖發(fā)酵 9 h的酵母細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，并以相同發(fā)酵條件下的原始菌株 W32N55a為對(duì)照，分析了敲除菌中發(fā)生明顯表達(dá)差異的基因，并結(jié)合 SGD數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋和途徑分析 (圖5)，對(duì)這些基因可能影響的細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行探究。與原始菌株比，敲除菌中發(fā)生明顯表達(dá)差異的基因數(shù)量情況如下：MIG1敲除菌有12個(gè)基因 (上調(diào)表達(dá)的8個(gè)，下調(diào)表達(dá)的4個(gè))；SNF1敲除菌有25個(gè)(上調(diào)表達(dá)的23個(gè)，下調(diào)表達(dá)的2個(gè))；MIG1和SNF1雙敲菌株有47個(gè) (上調(diào)表達(dá)的41個(gè)，下調(diào)表達(dá)的6個(gè))。其中，MIG1敲除菌與MIG1和SNF1雙敲除菌沒(méi)有共享的表達(dá)上調(diào)基因，SNF1敲除菌與MIG1和SNF1雙敲除菌共享20個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，MIG1和SNF1雙敲除菌特有21個(gè)表達(dá)上調(diào)基因。整體而言，MIG1和SNF1的敲除導(dǎo)致更多的基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)，也就是說(shuō)這些基因的轉(zhuǎn)錄可能是受MIG1或 (和)SNF1直接或間接抑制的，敲除MIG1和SNF1則解除了這些抑制，從而使細(xì)胞更有利于共利用葡萄糖和木糖。
通過(guò)進(jìn)一步考察表達(dá)差異基因的功能注釋和途徑分析，可以更清晰地了解在混合糖條件下可能受MIG1和SNF1調(diào)控的基因和途徑。MIG1敲除菌中上調(diào)和下調(diào)的基因功能如圖 5B所示。上調(diào)的基因與細(xì)胞壁成分、色氨酸的降解、細(xì)胞核mRNA輸出、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、熱激轉(zhuǎn)錄因子、蛋白折疊、精氨酸吸收以及甘氨酸代謝有關(guān)，這些基因可能直接或間接受MIG1的抑制。下調(diào)的基因與鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白的合成和降解以及呼吸生長(zhǎng)調(diào)控有關(guān)，這些基因可能是直接或間接受MIG1的激活。需要注意的是，編碼低親和力高轉(zhuǎn)運(yùn)性能的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HXT1在MIG1敲除菌中表達(dá)上調(diào)。曾有報(bào)道指出[28]，HXT1在葡萄糖濃度較低時(shí)被Rgt1阻遏，Mig1并不是HXT1的調(diào)控蛋白，另外，其他葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HXT2/HXT3/HXT4是由 Mig1/Mig2和 Rgt1共同阻遏調(diào)控。由于MIG1敲除菌中只有HXT1表達(dá)上調(diào)，而其他葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)未發(fā)生明顯變化，意味著這一結(jié)果可能是由非MIG1敲除的因素造成的。重新審視基因組測(cè)序分析的取樣點(diǎn) (圖4A，9 h) 時(shí)，發(fā)現(xiàn)MIG1敲除菌的殘留葡萄糖濃度為10 g/L左右，明顯高于原始菌株的3 g/L左右。因此，與原始菌株相比，高水平的殘留葡萄糖濃度可能造成了MIG1敲除菌中HXT1表達(dá)的解抑制。另外，高水平的殘留葡萄糖濃度還可能造成MIG1敲除對(duì)基因表達(dá)的影響被高水平殘留葡萄糖的調(diào)控所掩蓋，其具體情況尚待研究。但是從分析混合糖條件下影響木糖代謝變化相關(guān)的基因表達(dá)差異的角度，我們可以忽略葡萄糖殘留濃度的影響，而認(rèn)為所有樣品都是在有葡萄糖的情況下進(jìn)行比較。
SNF1敲除菌中明顯上調(diào)表達(dá)的基因有23個(gè)，其中20個(gè)基因在MIG1和SNF1雙敲除菌中表達(dá)也明顯上調(diào) (圖 5A)，而在MIG1敲除菌中表達(dá)沒(méi)有發(fā)生明顯變化 (圖 5B)。這一比較結(jié)果說(shuō)明這20個(gè)基因可能是受Snf1特異負(fù)調(diào)控，而不受Mig1的調(diào)控。也就是說(shuō)，只要SNF1被敲除，這20個(gè)基因的表達(dá)就會(huì)被解抑制。非常有趣的是，這 20個(gè)基因明顯富集在與氨基酸 (主要包括精氨酸、脯氨酸和絲氨酸) 和其他氮源 (尿囊素、尿素和氨) 的吸收和降解相關(guān)的途徑 (圖 5C)，而這些基因是氮分解代謝物阻遏 (NCR) 基因，受氮源的營(yíng)養(yǎng)水平調(diào)控[29-30]。精氨酸可以作為酵母偏好的氮源，在Can1、Car1和Car2以及Pro3的作用下產(chǎn)生脯氨酸；脯氨酸由 Put4、Put1和Put2的作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酸，再由Gdh2作用降解為氨和α-酮戊二酸，α-酮戊二酸可以經(jīng)由TCA循環(huán)進(jìn)入碳中心代謝，而氨又可以進(jìn)入氨基酸代謝。另外，絲氨酸在Agp1和Cha1的作用下降解為氨和丙酮酸，丙酮酸進(jìn)入碳代謝途徑進(jìn)而生產(chǎn)乙醇。與原始菌株相比，SNF1敲除菌可以更快利用木糖可能與胞內(nèi)更豐富的氮源有關(guān)。綜上所述，氮分解代謝物阻遏基因表達(dá)上調(diào)，可能更有利于細(xì)胞吸收更多的氮源，從而使細(xì)胞積累更多的氨，更有利于細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝，比如蛋白質(zhì)合成前體——氨基酸的積累；同時(shí)這些氨基酸和氮源降解的產(chǎn)物又與碳中心代謝途徑相連，可能影響細(xì)胞的糖代謝，其分子機(jī)理尚待研究。
表3 原始菌和敲除菌發(fā)酵參數(shù)的比較Table 3 Comparison of fermentation parameters between wild type and gene deletion strains
圖5 表達(dá)差異基因的功能和參與途徑示意圖Fig. 5 Gene function and pathway mapping of differentially expressed genes. (A) Venn diagram among differentially expressed genes in W32N55a (mig1Δ0), W32N55a (snf1Δ0) and W32N55a (mig1&snf1Δ0) by comparing with wild type strain W32N55a. (B) Up- and down-regulated genes in W32N55a (mig1Δ0) compared with wild type strain W32N55a. (C) Overlapped up-regulated genes in W32N55a (snf1Δ0) and W32N55a (mig1&snf1Δ0) compared with wild type strain W32N55a. (D) Unique up- and down-regulated genes in W32N55a (snf1Δ0) and W32N55a (mig1&snf1Δ0)compared with wild type strain W32N55a. Red: up-regulated; Green: down-regulated.
在MIG1和SNF1雙敲除菌中發(fā)現(xiàn)的41個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因，除了在SNF1敲除菌中也發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的20個(gè)基因外，還有21個(gè)基因。這21個(gè)基因在MIG1敲除菌中表達(dá)未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明這21基因，可能是受Snf1和Mig1共同負(fù)調(diào)控的作用。也就是說(shuō)，單獨(dú)敲除MIG1和SNF1中的任何一個(gè)，都不會(huì)影響這21個(gè)基因的表達(dá)，當(dāng)同時(shí)敲除這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，這 21個(gè)基因的表達(dá)就會(huì)被解抑制。代謝途徑分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的富集。不過(guò)，在Snf1調(diào)控功能缺失的基礎(chǔ)上，MIG1的敲除會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致參與氨基酸吸收和降解途徑的個(gè)別基因表達(dá)上調(diào)，包括DIP5、BAP2、ARO9、ARO10、GAD1和ASP3-1(圖 5D)。另外，還包括磷酸戊糖途徑中的SOL4和GND2以及參與線粒體丙酮酸合成的CYB2，其他上調(diào)基因還包括一些與膜結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)的基因。以上結(jié)果暗示，在SNF1敲除的基礎(chǔ)上，MIG1的敲除可能造成細(xì)胞對(duì)其他氨基酸氮源的偏好，同時(shí)影響到磷酸戊糖途徑和線粒體丙酮酸代謝，從而造成細(xì)胞更傾向于快速利用葡萄糖，同時(shí)雖然木糖的利用速度降低，但并不會(huì)受到抑制，表明葡萄糖對(duì)木糖代謝的抑制作用部分得到緩解，而且最終導(dǎo)致代謝混合糖積累乙醇的速度變快。
2.4 Mig1和Snf1對(duì)差異表達(dá)基因的層級(jí)調(diào)控
利用 YEASTRACT可以分析可能參與表達(dá)差異基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，從而有助于解析在混合糖條件下Mig1和Snf1如何調(diào)控氨基酸和氮源代謝進(jìn)而影響葡萄糖和木糖的共利用 (圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNF1敲除菌與MIG1和SNF1雙敲除菌共有的20個(gè)表達(dá)上調(diào)基因均受Gln3調(diào)控 (P-value小于0.000 1)；另外，GAT1編碼調(diào)控NCR基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，其轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)。Gln3和Gat1是NCR基因表達(dá)必需的轉(zhuǎn)錄激活因子，并且Snf1位于基因表達(dá)層級(jí)的上游來(lái)調(diào)控 Gln3的活性[31]。之前的諸多研究指出 Snf1只在葡萄糖缺乏的條件下才起作用[9,12]。然而 Nicastro等最新的研究表明[32]，Snf1可以在有葡萄糖存在的條件下起調(diào)控作用，SNF1的敲除會(huì)造成細(xì)胞吸收和代謝氨基酸的能力加強(qiáng)，而且這種現(xiàn)象在葡萄糖濃度低 (2%) 的條件下比高濃度 (5%) 時(shí)更為明顯。也就是說(shuō)，即便在葡萄糖存在的條件下，Snf1存在某種活性形式可以參與氨基酸和氮源代謝相關(guān)基因的抑制調(diào)控，這種相應(yīng)的 Snf1形式我們界定為 Snf1in，在原始菌株中，混合糖條件下Snf1in可能抑制Gln3的活性，從而抑制這些 NCR基因的表達(dá)。相應(yīng)地，受葡萄糖代謝影響的Snf1形式我們界定為Snf1dp。
另一方面，經(jīng)過(guò)YEASTRACT分析，MIG1和SNF1雙敲除菌特有的21個(gè)表達(dá)上調(diào)基因均受Gcn4的調(diào)控，Gcn4是參與調(diào)控氨基酸合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子。這 21個(gè)基因的負(fù)調(diào)控可能是通過(guò)兩條路徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，一條是經(jīng)由不受葡萄糖代謝影響的Snf1in形式，在原始菌株中，混合糖條件下Snf1in會(huì)抑制Gcn4的活性，從而抑制這21個(gè)基因的表達(dá)；另一條是通過(guò)Mig1對(duì)這21個(gè)基因的抑制作用，Snf1dp是Mig1上游層級(jí)的負(fù)調(diào)控因子，在葡萄糖存在的條件下不具有活性。基于以上分析，MIG1敲除菌中，由于Snf1in的存在，會(huì)抑制Gln3和Gcn4的活性，因此受這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活的基因水平不會(huì)發(fā)生變化；SNF1敲除菌中，Gln3和Gcn4的活性得到解抑制，因此，受 Gln3激活的 20個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，而受 Gcn4激活的21個(gè)基因，由于依然受Mig1的抑制，其表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化；當(dāng)在SNF1雙敲除菌中繼續(xù)敲除MIG1時(shí)，Mig1對(duì)這21個(gè)基因的抑制得到解除，從而基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)。至于以上層級(jí)調(diào)控的具體細(xì)節(jié)以及Snf1in在葡萄糖存在條件下的形式尚待研究。
基于以上分析，在混合糖發(fā)酵條件下，一方面不受葡萄糖代謝影響的Snf1in具有活性，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄激活因子Gln3和Gcn4的功能，分別經(jīng)由Snf1in-Gln3和Snf1in-Gcn4途徑抑制兩部分參與氨基酸吸收和降解等功能基因的表達(dá)；另一方面，由于葡萄糖的存在，受葡萄糖代謝影響的Snf1dp處于非活性狀態(tài)，不能夠磷酸化失活 Mig1，因此Mig1也可能抑制經(jīng)由Snf1in-Gcn4途徑所抑制的那部分基因的表達(dá)，其中包括磷酸戊糖途徑氧化階段的兩個(gè)基因——SOL4(6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶)和GND2(編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶) (圖6)。無(wú)論是單敲除SNF1還是雙敲除SNF1和MIG1，與原始菌株相比，木糖的利用在3–9 h之間都沒(méi)有明顯地被延滯 (圖4B)，而且只要SNF1被敲除，經(jīng)由 Snf1in-Gln3途徑抑制的基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)，這表明經(jīng)由Snf1in-Gln3途徑抑制的這些參與氨基酸吸收和降解功能的基因 (圖 5、圖 6)，其表達(dá)的解抑制是實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖的同步利用所必需的。與單敲除SNF1相比，SNF1和MIG1雙敲除菌的葡萄糖代謝速率明顯加快 (圖4A，表3)，而木糖代謝速率大大降低 (圖4B，表3)，與此同時(shí)，由于MIG1也被敲除，經(jīng)由Snf1in-Gcn4途徑抑制的基因表達(dá)發(fā)生上調(diào) (圖5、圖6)，說(shuō)明這些基因很可能參與細(xì)胞對(duì)葡萄糖和木糖代謝流的控制。另外，SNF1和MIG1雙敲除能夠加快乙醇的積累 (圖 4C，表 3)，從而改善葡萄糖和木糖的共利用，這可能主要?dú)w功于葡萄糖代謝能力的大幅度加快。雖然曾有研究表明[7–8]，磷酸戊糖途徑相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)有利于促進(jìn)木糖代謝，但是在SNF1和MIG1雙敲除菌中，表達(dá)上調(diào)的SOL4和GND2以及其他經(jīng)由Snf1in-Gcn4途徑抑制的基因所起的作用依然有待進(jìn)一步研究。
圖6 Mig1和Snf1對(duì)表達(dá)差異的基因不同層級(jí)的調(diào)控Fig. 6 Mig1 and Snf1 in a hierarchical regulatory network for regulating differentially expressed genes. Snf1in: Snf1 analog independent of glucose metabolism; Snf1in: Snf1 analog dependent of glucose metabolism.
3 結(jié)論
以釀酒酵母工程菌株W32N55a為出發(fā)菌株，通過(guò)同源重組技術(shù)分別對(duì)葡萄糖阻遏效應(yīng)中的關(guān)鍵基因SNF1和MIG1基因進(jìn)行單敲除和雙敲除，評(píng)價(jià)了敲除菌株共利用葡萄糖和木糖的性能。在低濃度混合糖條件下MIG1單敲除對(duì)混合糖的共利用影響不大，SNF1單敲除明顯提高了木糖的利用效率，MIG1和SNF1雙敲除明顯促進(jìn)葡萄糖的利用效率同時(shí)可以以較慢的速度共利用木糖，從而積累乙醇的效率得到提高；當(dāng)混合糖濃度提高到 10%時(shí)，MIG1和SNF1的單敲除效應(yīng)變得不明顯，MIG1和SNF1雙敲除的效應(yīng)依然很明顯，但影響程度已經(jīng)明顯低于低濃度混合糖的情況。我們利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了在低濃度混合糖條件下MIG1和SNF1單敲除和雙敲除對(duì)全基因組水平上基因表達(dá)譜的影響。SNF1單敲除后，一些氮分解代謝物阻遏基因表達(dá)明顯上調(diào)，這可能是導(dǎo)致SNF1單敲除菌利用木糖效率提高的主要原因。MIG1和SNF1雙敲除菌除了上述SNF1單敲除對(duì)轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生的影響外，還會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致參與氨基酸分解代謝相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，可能是造成雙敲除菌傾向于更快利用葡萄糖但同時(shí)可以共利用木糖的主要原因。我們的研究結(jié)果暗示了Snf1可能以依賴于葡萄糖代謝和不依賴于葡萄糖代謝這兩種形式參與 NCR基因的層級(jí)調(diào)控，這些研究發(fā)現(xiàn)將有助于進(jìn)一步提高釀酒酵母工程菌共利用葡萄糖和木糖的效率。
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