龐亞如，胡智慧，肖冬光，于愛群

天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457

檸檬烯是一種來源于植物的天然活性化合物。它在自然界中分布較為廣泛，主要存在于柑橘類 (如橙子、檸檬、柑橘、西柚) 精油中，并且已被FDA鑒定為安全的 (Generally regarded as safe，GRAS) 化合物[1]。

檸檬烯屬于單環(huán)單萜類化合物，化學(xué)式為C10H16。檸檬烯分子內(nèi)只含有一個(gè)手性碳原子，因此檸檬烯有右旋檸檬烯 (D-檸檬烯，如圖 1A所示)和左旋檸檬烯 (L-檸檬烯，如圖1B所示) 兩種光學(xué)異構(gòu)體，此外還存在一種外消旋體(D/L-檸檬烯，如圖1C所示)[2]。

近年來的研究表明，檸檬烯具有多種重要的應(yīng)用價(jià)值。D-檸檬烯有類似檸檬或甜橙的悅?cè)讼阄?；L-檸檬烯則有類似松油和松脂的芳香氣味，因此檸檬烯可作為優(yōu)質(zhì)的香料被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品中，具有很高的市場價(jià)值。在工業(yè)上，D-檸檬烯還是一種天然、綠色、環(huán)保的工業(yè)清洗劑，被廣泛應(yīng)用于印刷、機(jī)械、航空、電子和電器工業(yè)部件的清洗。在農(nóng)業(yè)上，D-檸檬烯還被用作農(nóng)作物的生物殺蟲劑。在衛(wèi)生醫(yī)療領(lǐng)域中，D-檸檬烯具有抑菌、抗菌活性，可以作為良好的天然抗菌活性物質(zhì)；同時(shí)，它還具有很好的藥用價(jià)值，如具有抗癌活性、促進(jìn)消化和減肥作用等[9-13]。在能源領(lǐng)域中，氫化檸檬烯具有低溶點(diǎn)和不溶于水的優(yōu)良特性，可以用作航空燃油或者燃油添加劑[14]。此外，檸檬烯還可以作為多種具有重要應(yīng)用價(jià)值的單萜類衍生物如紫蘇醇、薄荷醇、松油醇、香芹醇、香芹酮的前體物[15]。

圖 1 D-檸檬烯[3](A)、L-檸檬烯[4](B)、DL-檸檬烯[5](C)、α-紅沒藥烯[6](D)、β-紅沒藥烯[7](E)和 γ-紅沒藥烯[8](F)的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The chemical structures of D-limonene[3](A),L-limonene[4](B), DL-limonene[5](C), α-bisabolene[6](D),β-bisabolene[7](E) and γ-bisabolene[8](F).

紅沒藥烯也是一種植物來源的天然活性化合物，它在自然界中分布也較為廣泛，主要存在于天然的植物精油中，如紅沒藥油、檸檬油等。

紅沒藥烯屬于單環(huán)倍半萜類化合物，化學(xué)式為C15H24，根據(jù)雙鍵位置的不同可分為3種同分異構(gòu)體：α-紅沒藥烯、β-紅沒藥烯、γ-紅沒藥烯(圖 1D，E，F(xiàn))。

在用途和功能上，紅沒藥烯與檸檬烯有許多相似之處，同樣具有很高的市場價(jià)值。例如，紅沒藥烯有類似果香和香脂的氣味，其中β-紅沒藥烯有類似香油的氣味，可以作為食用香精及日化香精；紅沒藥烯也是極具潛力的新型生物燃料；β-紅沒藥烯和 γ-紅沒藥烯還具有抗癢、消炎的功能和抗癌活性。此外，紅沒藥烯也是多種高附加值工業(yè)產(chǎn)品合成的前體物質(zhì)，如生物燃料、生物塑料、化妝品、保健品及藥品等[16-17]。

目前檸檬烯和紅沒藥烯的工業(yè)生產(chǎn)主要還是通過植物提取法實(shí)現(xiàn)的。但是，這一方法存在諸多弊端，如原料來源有限、目標(biāo)物質(zhì)含量低、分離提取難度大等；利用化學(xué)方法也能夠合成檸檬烯和紅沒藥烯，但化學(xué)合成法需要采用高溫、高壓和昂貴的催化劑，而且生產(chǎn)設(shè)備復(fù)雜、原料利用率低、環(huán)境污染嚴(yán)重。近年來，隨著人們對健康、能源和環(huán)境問題越來越關(guān)注，從而掀起了對有著重要生物學(xué)功能的萜類化合物的研究熱潮。因此利用微生物代謝工程技術(shù)生產(chǎn)檸檬烯和紅沒藥烯已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。相比植物提取法和化學(xué)合成法，微生物合成法具有反應(yīng)條件溫和、底物轉(zhuǎn)化率高、低碳環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)點(diǎn)，因此具有廣闊的發(fā)展前景。

本文系統(tǒng)總結(jié)了代謝工程技術(shù)在微生物法生產(chǎn)檸檬烯和紅沒藥烯中的應(yīng)用，包括所涉及的宿主菌株、關(guān)鍵酶和代謝途徑，尤其重點(diǎn)介紹了代謝途徑改造思路。最后，本文展望了利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建檸檬烯和紅沒藥烯生產(chǎn)菌株未來的發(fā)展趨勢。

1 檸檬烯和紅沒藥烯的生物合成途徑

植物中檸檬烯和紅沒藥烯的合成途徑已經(jīng)研究得較為清楚 (圖 2)。植物細(xì)胞主要依靠甲基赤蘚醇-4-磷酸 (The methylerythritol phosphate，MEP) 途徑，以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸作為底物，在一系列酶的共同催化下，最終生成異戊烯基焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)。IPP和 DMAPP在香葉基香葉基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase)作用下進(jìn)一步合成香葉基焦磷酸 (Geranyl diphosphate，GPP)和法尼基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)。以來自MEP途徑的GPP作為底物，在L-檸檬烯合酶 (L-limonene synthase)和D-檸檬烯合酶(D-limonene synthase) 催化下分別合成L-檸檬烯和D-檸檬烯；以來自MEP途徑的FPP作為底物，在α-紅沒藥烯合酶(α-bisabolene synthase)、β-紅沒藥烯合酶(β-bisabolene synthase) 和 γ-紅沒藥烯合酶(γ-bisabolene synthase) 催化下分別合成3種紅沒藥烯——α-紅沒藥烯、β-紅沒藥烯和 γ-紅沒藥烯[18]。

與植物不同，釀酒酵母依靠以乙酰輔酶A為底物的甲羥戊酸途徑 (Mevalonate pathway，MVA)合成IPP和DMAPP。3個(gè)乙酰輔酶A (Acetyl-CoA)在乙酰輔酶A硫解酶 (Acetyl-CoA thiolase) 和羥甲基戊二酸單酰輔酶 A合成酶 (HMG-CoA synthase) 的作用下縮合成 3-羥基-3甲基戊二酸單酰輔酶 A (HMG-CoA)；隨后 HMG-CoA在HMG-CoA還原酶的作用下生成甲羥戊酸(Mevalonate)；再經(jīng)過焦磷酸化和脫羧化生成IPP；IPP在異構(gòu)化酶的作用下生成 DMAPP，IPP和DMAPP又在香葉基香葉基焦磷酸合成酶的作用下進(jìn)一步合成GPP和FPP (圖3)。

2 檸檬烯和紅沒藥烯的微生物代謝工程應(yīng)用實(shí)例

檸檬烯和紅沒藥烯現(xiàn)已成為食品、能源、化工和醫(yī)藥等許多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。利用微生物開發(fā)生產(chǎn)檸檬烯和紅沒藥烯的可再生資源，用其來補(bǔ)充甚至代替原有的植物資源，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

圖2 植物中檸檬烯和紅沒藥烯的合成途徑Fig. 2 The biosynthetic pathways of limonene and bisabolene in plants.

到目前為止，研究者已經(jīng)從多種不同的植物中克隆得到了檸檬烯合酶基因和紅沒藥烯合酶基因。1993年，Colby等從綠薄荷Mentha spicata中分離得到了 L-檸檬烯合酶基因 (GenBank Accession No. L13459.1)[19]；1996年，Yuba等從紫蘇Perilla frutescens中分離得到了L-檸檬烯合酶基因 (GenBank Accession No. D49368.1)[20]；1997年，Bohlmann等從北美冷杉Abies grandis中分離得到了 L-檸檬烯合酶基因 (GenBank Accession No.AF006193.1)[21]；2001年，Maruyama等從荊芥Schizonepeta tenuifolia中分離得到了D-檸檬烯合酶基因 (GenBank Accession No. AF282875.2)[22]；2002年，Lücker等從檸檬Citrus limon中分離得到了D-檸檬烯合酶基因 (GenBank Accession No.AF514287.1)[23]；2004年，Shimada等從蜜柑Citrus unshiu中分離得到了一個(gè) D-檸檬烯合酶基因(GenBank Accession No. AB110636.1)[24]；2005年，Shimada等從蜜柑Citrus unshiu中分離得到了另一個(gè)D-檸檬烯合酶基因 (GenBank Accession No.AB110637.1)[25]；1998年，Bohlmann等從北美冷杉中分離得到了 α-紅沒藥烯合酶基因(GenBank Accession No. AF006195.1)[26]；2004 年，Martin等從歐洲云杉Picea abies中分離得到了α-紅沒藥烯合酶基因 (GenBank Accession No. AY473619.1)[27]；2015年，Parveen等從銀杏葉Ginkgo biloba中分離得到了 α-紅沒藥烯合酶基因 (GenBank Accession No. KM248384.1)[28]；2010 年 Fujisawa等從鐵皮石斛Zingiber officinale中分離得到了β-紅沒藥烯合酶基因 (GenBank Accession No.AB511917.1)[29]；2011年，Jones等從新克里多尼亞檀香Santalum austrocaledonicum中分離得到了β-紅沒藥烯合酶基因 (GenBank Accession No.HQ343279.1)[30]；2015年，Srivastava等從檀香Santalum album中分離得到了 β-紅沒藥烯合酶基因(GenBank Accession No. KJ665778.1)[31]；2005 年，Huber等從花旗松Pseudotsuga menziesii中分離得到了 γ-紅沒藥烯合酶基因 (GenBank Accession No.AY906868.1)[32]；2006年，Ro等從擬南芥Arabidopsis thaliana中分離得到了兩個(gè) γ-紅沒藥烯合酶基因(AtTPS12和AtTPS13)[33]。2016年，Aschenbrenner等從向日葵Helianthus annuus中分離得到了兩個(gè)γ-紅沒藥烯合酶基因 (GenBank Accession No. KU674382.1和KU674381.1)[34]。

圖3 釀酒酵母的MVA途徑Fig. 3 The MVA pathway of Saccharomyces cerevisiae.

近年來，研究者們紛紛利用代謝工程和合成生物學(xué)的方法在不同微生物宿主中成功構(gòu)建了檸檬烯和紅沒藥烯的生物合成途徑。萜類合成酶已成為影響單萜、倍半萜產(chǎn)量的關(guān)鍵酶，因此篩選高活性的檸檬烯合成酶、紅沒藥烯合成酶至關(guān)重要。2011年，Keasling研究組為了篩選到高活性的紅沒藥烯合成酶，分別選擇了來自北美冷杉的α-紅沒藥烯合酶基因 (Ag1)、來自歐洲云杉的α-紅沒藥烯合酶基因 (TPS-BIS)、來自花旗松的 γ-紅沒藥烯合酶基因 (TPS3)和兩個(gè)來自擬南芥的γ-紅沒藥烯合酶基因 (AtTPS12和AtTPS13)，利用已構(gòu)建的高產(chǎn) FPP平臺，通過分別表達(dá)以上5個(gè)紅沒藥烯合成酶基因，從而成功地在大腸桿菌Escherichia coli和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae兩種模式菌株中分別構(gòu)建了 α-紅沒藥烯和 γ-紅沒藥烯的合成途徑。最終，篩選出高產(chǎn)紅沒藥烯的合成酶基因——來自北美冷杉的 α-紅沒藥烯合酶基因(Ag1)。在宿主大腸桿菌中，通過對來自釀酒酵母MVA途徑 的4個(gè)基因tHMGR、HMGS、MK、PMK進(jìn)行密碼子優(yōu)化，增加了前體物甲羥戊酸的產(chǎn)量，并采用了強(qiáng)啟動(dòng)子(Ptrc) 策略，推動(dòng)甲羥戊酸流向FPP，同時(shí)再表達(dá)經(jīng)密碼子優(yōu)化的 α-紅沒藥烯合酶基因 (Ag1)，α-紅沒藥烯的終產(chǎn)量為912 mg/L；在宿主釀酒酵母中，通過表達(dá)甾醇合成途徑的全局轉(zhuǎn)錄因子upc2-1、已密碼子優(yōu)化的α-紅沒藥烯合酶基因(Ag1) 和弱化鯊烯合成途徑中的關(guān)鍵酶——鯊烯合成酶基因 (ERG9) 后，α-紅沒藥烯的最高產(chǎn)量達(dá)到994 mg/L[16]。

2013年，Lee研究組在大腸桿菌中構(gòu)建了L-檸檬烯的合成途徑。具體策略為：1) 引入來自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus的HMGS和HMGR基因，來自釀酒酵母的MK、PMK和PMD基因，從而構(gòu)建異源的 MVA途徑，以增加 IPP和 DMAPP的產(chǎn)量；2) 同時(shí)引入來自綠薄荷的trGPPS基因，從而表達(dá)高活性的 GPP合酶，強(qiáng)化IPP和DMAPP流向GPP；3) 再引入來自北美冷杉的LS基因，從而表達(dá)高活性的 L-檸檬烯合酶，以促進(jìn)GPP轉(zhuǎn)化成L-檸檬烯。最終，L-檸檬烯的終產(chǎn)量為430 mg/L[35]。

2014年，Davies研究組在聚球藍(lán)細(xì)菌Synechococcussp. PCC 7002中分別引入一個(gè)來自綠薄荷的 L-檸檬烯合酶基因 (MsLS) 和一個(gè)來自北美冷杉的α-紅沒藥烯合酶基因 (AgBIS)，從而成功構(gòu)建了 L-檸檬烯和 α-紅沒藥烯的合成途徑。L-檸檬烯和α-紅沒藥烯的終產(chǎn)量分別為4 mg/L和0.6 mg/L[17]。

2015年，Beekwilder研究組在釀酒酵母中分別引入一個(gè)來自紫蘇的L-檸檬烯合酶基因和一個(gè)來自檸檬的D-檸檬烯合酶基因，再加上一個(gè)突變的香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因，成功構(gòu)建了L-檸檬烯和D-檸檬烯的合成途徑。L-檸檬烯和D-檸檬烯的終產(chǎn)量分別為0.49 mg/L和0.12 mg/L[36]。

3 結(jié)論和展望

由此可見，目前關(guān)于利用代謝工程合成檸檬烯和紅沒藥烯的研究主要還是集中在大腸桿菌和釀酒酵母這兩種模式菌株中，但是檸檬烯和紅沒藥烯產(chǎn)量并不高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。針對檸檬烯和紅沒藥烯等萜類物質(zhì)合成產(chǎn)量低的問題，研究者已開展很多探索。本文將從以下幾點(diǎn)介紹萜類合成代謝網(wǎng)絡(luò)改造的新思路。

3.1 萜類合成途徑的酶分子改造

在萜類代謝途徑中，目的產(chǎn)物的產(chǎn)量往往受限于限速步驟。限速步驟的解除將有助于提高前體物的供應(yīng)量，從而增加目的產(chǎn)物的積累量。目前，限速步驟的解除主要有兩種方法：一種是提高限速酶的表達(dá)量；另一種是提高限速酶的酶活。酶的過量表達(dá)可以通過密碼子優(yōu)化或者選擇高拷貝質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)，操作方法相對簡單、方便；但是該法主要是通過增加酶的濃度來強(qiáng)化代謝途徑的通量，往往會給細(xì)胞帶來較大的代謝負(fù)擔(dān)，影響細(xì)胞的正常生長。而且，限速酶的過量表達(dá)還可能會引發(fā)新的限速點(diǎn)，消耗更多的碳源和能量。因此，如何通過精細(xì)調(diào)控實(shí)現(xiàn)代謝途徑的平衡對提高目的產(chǎn)物的合成量具有重要的意義。比較而言，提高限速酶的酶活能夠更有效地解除限速步驟。近年來，一些研究者利用酶工程技術(shù)極大地提高了萜類代謝途徑中某些限速酶的酶活。如 2010年，Stephanopoulos和Prather課題組在利用大腸桿菌合成左旋海松二烯的研究中，利用番茄紅素作為顏色指示劑，對來源于紅豆杉Taxus chinensis的香葉基香葉基焦磷酸合成酶(GGPP) 和來源于銀杏的左旋海松二烯合成酶(LPS)進(jìn)行了定向進(jìn)化。通過平板篩選法獲得了一株目的產(chǎn)物產(chǎn)量最高的正向突變菌株 (GGPPSS239C/G295DLPSM593I/Y700F)，再結(jié)合其他的代謝工程策略，左旋海松二烯的產(chǎn)量提高了 2 600倍，終產(chǎn)量達(dá)到700 mg/L[15]；2017年，元英進(jìn)課題組在利用釀酒酵母合成香葉醇的研究中，通過蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)，成功提高了關(guān)鍵酶法尼基焦磷酸合成酶 (Erg20F96W-N127W) 的酶活；同時(shí)通過酶融合技術(shù)，將來源于長春花Catharanthus roseus的香葉醇合成酶與Erg20F96W-N127W融合表達(dá)，最終香葉醇的產(chǎn)量達(dá)到1.68 g/L[37]。

3.2 代謝途徑的平衡調(diào)控

由于萜類合成途徑中涉及了多個(gè)基因、多個(gè)限速酶和多步反應(yīng)，所以單個(gè)基因的過表達(dá)或敲除往往難以產(chǎn)生理想性狀，比如萜類化合物的異源高產(chǎn)，因此，如何實(shí)現(xiàn)萜類合成途徑的平衡調(diào)控對于提高萜類化合物的產(chǎn)量具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。萜類合成途徑的基因表達(dá)可以從轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后3個(gè)水平進(jìn)行調(diào)控。相比較而言，轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控能量損耗少、操作簡單，因此應(yīng)用最為廣泛。本文將從以下幾個(gè)方面對其進(jìn)行簡要介紹。

1) 啟動(dòng)子工程。主要是采用易錯(cuò) PCR在啟動(dòng)子的–10和–35區(qū)段引入隨機(jī)突變從而構(gòu)建具有不同啟動(dòng)效率的啟動(dòng)子文庫。將這種方法應(yīng)用到萜類化合物合成途徑中，能夠梯度調(diào)控基因的表達(dá)。2011年，Alper課題組在解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica中設(shè)計(jì)了一套可調(diào)控啟動(dòng)效率的啟動(dòng)子系統(tǒng)，其由多個(gè)重復(fù)的上游增強(qiáng)序列(UASS)和核心元件構(gòu)成。這個(gè)動(dòng)態(tài)的啟動(dòng)子文庫成功地應(yīng)用到了萜類化合物合成途徑的平衡調(diào)控中[38]。

2) 建立代謝途徑多模塊系統(tǒng)。例如，可以將萜類代謝途徑首先分成多個(gè)模塊，然后通過優(yōu)化啟動(dòng)子、RBS結(jié)合位點(diǎn)、終止子、基因的拷貝數(shù)等策略分別或者組合調(diào)控各個(gè)模塊，以強(qiáng)化多模塊之間的協(xié)調(diào)作用。2010年，Stephanopoulos課題組將釀酒酵母紫杉烯的合成途徑分為上游模塊，即由MEP途徑至IPP、DMAPP和下游模塊，即由IPP、DMAPP至目的產(chǎn)物紫杉烯 (或者檸檬烯和紅沒藥烯)，如圖4。通過控制和優(yōu)化目標(biāo)模塊的啟動(dòng)子和質(zhì)粒的拷貝數(shù)，進(jìn)而對紫杉烯的合成途徑進(jìn)行了精確調(diào)控，最終紫杉烯產(chǎn)量提高了15 000倍。這是利用模塊系統(tǒng)調(diào)控萜類代謝途徑的經(jīng)典實(shí)例[39]。

圖4 代謝工程技術(shù)改造酵母合成檸檬烯和紅沒藥烯的代謝途徑Fig. 4 Overview of metabolic pathways that lead to the production of limonene and bisabolene in yeast.

3) 全局轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。萜類合成途徑在整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中的具體作用和地位目前尚不清楚，因此萜類化合物的代謝工程很難從局部通路水平上升到整體水平，全局轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控則提供了一個(gè)很好的解決方案。2006年，Sarpong課題組和Keasling課題組在釀酒酵母中構(gòu)建青蒿酸合成途徑的研究中，通過過表達(dá)全局轉(zhuǎn)錄因子 upc2-1p激活了甾醇合成基因 (ERG13、ERG12、ERG8)，從而強(qiáng)化了MVA途徑，青蒿酸的終產(chǎn)量達(dá)到100 mg/L[40]。

3.3 萜類合成途徑的區(qū)域化工程調(diào)控

代謝途徑相關(guān)酶的共區(qū)域化工程可以加強(qiáng)酶的協(xié)同催化效應(yīng)，這也是一種提高目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的有效途徑。其策略主要有兩種：一是通過構(gòu)建蛋白支架或者酶的自身融合將多個(gè)酶集合在一起。2009年，Prather課題組和Keasling課題組在大腸桿菌中將甲羥戊酸合成途徑的 3個(gè)酶(AtoB、HMGS、HMGR) 通過蛋白支架的方法構(gòu)建了一個(gè)酶的復(fù)合體，從而極大提高了酶的活性，最終甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了 77倍[41]。二是將分散在不同細(xì)胞域的酶集合在同一細(xì)胞區(qū)域內(nèi)，如線粒體工程。線粒體作為獨(dú)立的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在其中進(jìn)行萜類代謝調(diào)控具有乙酰輔酶 A (萜類合成前體物) 供應(yīng)充足、ATP含量豐富等優(yōu)勢。此外，線粒體體積較小，能增加底物和中間產(chǎn)物的濃度，從而提高反應(yīng)速率和產(chǎn)物產(chǎn)量。2016年，于洪巍課題組將釀酒酵母MVA途徑的酶采用酶融合的方法定位于線粒體中，同時(shí)結(jié)合其他代謝工程策略，最終異戊二烯的產(chǎn)量達(dá)到2.527 g/L[42]。以上這些方法對于微生物合成檸檬烯和紅沒藥烯的代謝工程改造具有重要的指導(dǎo)意義。

目前，檸檬烯和紅沒藥烯在所構(gòu)建的微生物細(xì)胞工廠中的產(chǎn)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。這主要是因?yàn)槲⑸镙祁惡铣傻拇x及調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，存在諸多限制因素：1) 乙酰-CoA作為檸檬烯和紅沒藥烯生物合成的前體物，其持續(xù)供應(yīng)能力存在嚴(yán)重不足。在釀酒酵母中，一方面可以通過過量表達(dá)乙酰-CoA合成酶基因ACS1和ACS2，以強(qiáng)化丙酮酸代謝旁路，進(jìn)而增加乙酰-CoA的通量[43]；另一方面也可以通過異源構(gòu)建丙酮酸脫氫酶途徑，以替換原有高耗能、反饋抑制強(qiáng)的丙酮酸代謝旁路，減少合成乙酰-CoA的能耗，增加能源的利用率，進(jìn)而提高乙酰-CoA的產(chǎn)量[44-45]。2) 檸檬烯和紅沒藥烯的大量合成勢必需要消耗大量的輔酶 NADPH，因此會引起細(xì)胞內(nèi)輔酶水平的不平衡。NADPH的再生可通過強(qiáng)化磷酸戊糖途徑、異檸檬酸脫氫酶途徑及乙醛脫氫酶途徑實(shí)現(xiàn)，也可以通過葡萄糖-葡萄糖脫氫酶 (FDH) 等酶偶聯(lián)輔酶循環(huán)系統(tǒng)來完成[46]。3) 檸檬烯和紅沒藥烯生物合成途徑中關(guān)鍵性限速酶的活性不足?？梢圆扇《c(diǎn)突變、定向進(jìn)化和融合表達(dá)等技術(shù)手段對相關(guān)限速酶進(jìn)行改造，獲得催化活性更高的酶蛋白分子，這對提高檸檬烯和紅沒藥烯等萜類化合物的產(chǎn)量和產(chǎn)率至關(guān)重要[37]。4) 檸檬烯和紅沒藥烯等萜類物質(zhì)的積累對微生物自身具有毒害作用。如何及時(shí)、快速地把它們從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，這也是亟待解決的問題。

綜上所述，微生物異源合成檸檬烯和紅沒藥烯的代謝及調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，單一代謝調(diào)控手段很難實(shí)現(xiàn)檸檬烯和紅沒藥烯的高產(chǎn)。優(yōu)化、協(xié)同多種代謝調(diào)控手段，從而實(shí)現(xiàn)代謝途徑的平衡調(diào)控，將是今后在不同微生物宿主中利用代謝工程技術(shù)合成檸檬烯和紅沒藥烯的主流策略。

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