劉 杰，吳曉龍

(1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004； 2.河南省漢帝藥業(yè)有限公司，河南 平頂山 467000)

五加皮酒由五加皮、陳皮、當歸、川芎等26味中藥組成，具有舒筋活血、除濕祛風功能，用于風濕痹痛，手足痙攣，四肢麻木，腰膝酸痛[1]。原質(zhì)量標準僅有性狀和常規(guī)檢查項目，不能滿足質(zhì)量控制的要求。本研究增加了五加皮酒中當歸、川芎和獨活的薄層色譜鑒別法和主要成分橙皮苷的高效液相色譜含量測定法，以提高其質(zhì)量標準，更好地控制本品質(zhì)量。

1 試藥與儀器

五加皮酒，由河南省漢帝藥業(yè)有限公司提供，批號20170101，20170102，20170103。橙皮苷，含量測定用，由中國藥品生物制品鑒定所提供，批號0721-200010。色譜純級甲醇；硅膠G，青島海洋化工廠產(chǎn)品。所用其他試劑均為分析純。Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司產(chǎn)品，配備Waters 2696二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站；C-18柱(250 mm id×4.6mm，5μm，美國熱電公司產(chǎn)品)。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 當歸和川芎的薄層色譜鑒別

按照《中國藥典》2015版通則0502薄層色譜法試驗。取本品30 mL，用乙醚振搖提取2次(25，20 mL)，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，轉(zhuǎn)入小容量瓶，得供試品溶液。取當歸、川芎對照藥材各0.5 g，分別加乙醚10 mL，超聲處理5 min，濾過，揮干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，轉(zhuǎn)入小容量瓶，得對照藥材溶液。在同一用5 g/L羧甲基纖維素鈉水溶液制備的硅膠G薄層板上，分別點樣供試品溶液10 μL、當歸和川芎對照藥材溶液各5 μL。展開劑為乙酸乙酯-正己烷(1∶9)，展開，晾干，于紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與2種對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。另取當歸和川芎陰性對照樣品，同法進行試驗。結(jié)果：當歸和川芎陰性對照樣品色譜中，在與兩種對照藥材色譜相應的位置上沒有相應的斑點。結(jié)果表明：本法專屬性高。見圖1。

1～3.3批樣品；4.當歸對照藥材；5.川芎對照藥材；6.當歸和川芎陰性對照品圖1 當歸和川芎的薄層色譜鑒別

2.1.2 獨活的鑒別

按《中國藥典》2015版通則0502薄層色譜法試驗。供試品溶液采用2.1.1項下的同一種溶液。取蛇床子素對照品置小量瓶中，加甲醇使溶解，制成濃度為0.2 g/L的溶液作為對照品溶液。另取獨活對照藥材0.5 g，加甲醇10 mL，超聲提取10 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。在同一用5 g/L羧甲基纖維素鈉水溶液制備的硅膠G薄層板上，分別點樣供試品溶液10 μL、對照品溶液和對照藥材溶液各5 μL，展開劑為乙酸乙酯-石油醚(60～90 ℃) (3∶7)，展開后晾干，于紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，分別顯相同顏色的熒光斑點。另取獨活陰性對照品同板進行試驗，結(jié)果：陰性對照品的薄層色譜中，在與蛇床子素對照品和獨活對照藥材薄層色譜相應的位置上，沒有相同顏色的熒光斑點。結(jié)果表明：該試驗方法專屬性強，見圖2。

1～3.3批樣品；4.獨活對照藥材； 5.蛇床子素對照品；6.獨活陰性對照品圖2 獨活的薄層色譜鑒別

2.2 含量測定

2.2.1 制備對照品溶液

取橙皮苷對照品適量，置25 mL容量瓶中，精密稱定為7.30 mg，加甲醇適量，超聲處理5 min使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，轉(zhuǎn)入10 mL量瓶中，加甲醇2 mL稀釋，再加水至刻度，搖勻，即得濃度為58.40 μg/L的橙皮苷對照品溶液。

2.2.2 制備供試品溶液

取本品濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 測定波長的選擇

對橙皮苷對照品色譜峰和樣品色譜中相應的色譜峰提取二極管陣列檢測器光譜，結(jié)果：二者的紫外光譜吸收基本一致，均在285 nm處有強吸收，與《中國藥典》2015版陳皮項下規(guī)定的波長基本一致。故采用測定波長為283 nm。

2.2.4 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；檢測波長283 nm；流動相為甲醇-20 g/L乙酸水溶液(40∶60)。按《中國藥典》規(guī)定，理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應不低于2 000。

曾對比甲醇-20 g/L乙酸水溶液(37∶63)、甲醇-20 g/L 乙酸水溶液(42∶58)和甲醇-20 g/L乙酸水溶液(40∶60)3種流動相。結(jié)果：以甲醇-20 g/L乙酸水溶液(40∶60)色譜的保留時間和分離效果更滿意，故采用該流動相。

在此色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，計算。

2.2.5 標準曲線的繪制

取對照品溶液，依次精密進樣2,5,10,15,20,25 μL，測定橙皮苷成分的峰面積。以進樣量為橫坐標x，以峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線。測得橙皮苷的標準曲線為：Y=1.314×103X-3.387×104，r=0.999 9。結(jié)果表明：橙皮苷進樣量在 0.116 8～1.460 0 μg之間有良好的線性關系，直線近乎過原點。因此，可以采用外標一點法進行含量測定。

2.2.6 陰性對照試驗

按制備工藝和處方比例，稱取除陳皮以外的各味藥材，制得陳皮陰性對照樣品。按供試品溶液制備方法，制得陳皮陰性對照溶液。分別吸取供試品溶液、橙皮苷對照品溶液和陰性對照溶液各10 μL，進樣測定。結(jié)果：供試品色譜中在與對照品色譜相對應的保留時間有色譜峰出現(xiàn)，而陰性對照溶液在相對應位置無相應的色譜峰。結(jié)果表明：本法專屬性強。見圖3。

a.五加皮酒；b.橙皮苷對照品；c.陳皮陰性對照品圖3 橙皮苷測定的HPLC色譜圖

2.2.7 進樣精密度試驗

取同一供試品溶液，按2.2.4含量測定方法進樣 6 次，以考察進樣精密度。每次進樣量為 10 μL，測定橙皮苷的峰面積。結(jié)果：平均值為539 950.7，RSD=0.4%(n=6)。結(jié)果表明：進樣精密度良好。

2.2.8 供試液穩(wěn)定性

取同一供試液，考察 8 h 內(nèi)供試液的穩(wěn)定性。分別于0,1,2,4,6,8 h 時進樣測定。結(jié)果：橙皮苷的峰面積平均值為542 343.4，RSD為 0.7%(n=6)。結(jié)果表明：供試液在 8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復性試驗

對同一批號的樣品，過濾制備 6 份供試品溶液，按2.2.4含量測得法進樣測定，各進樣10 μL。結(jié)果：6 份供試液的橙皮苷成分的含量平均值為 0.04 398 g/L，RSD為 0.6%(n=6)。結(jié)果表明：本法的重復性良好。

2.2.10 定量限的測定

取橙皮苷對照品溶液，逐級稀釋后進樣測定，直觀法測得定量限為 11.6ng。

2.2.11 回收率測定

精密量取已知含量的樣品 5 mL(含量為 0.043 98 g/L)，精密加入橙皮苷對照品溶液 4 mL(質(zhì)量分數(shù)為 0.067g/L)，搖勻，即得加樣回收供試液，同法進行測定，結(jié)果：平均加樣回收率為96.50%, RSD=1.28%(n=7)。見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

2.2.12 3批樣品含量測定

取五加皮酒樣品3批(批號依次為20170101，20170102，20170103)，按2.2.4含量測得法操作進行測定。結(jié)果：3批樣品中的橙皮苷的含量依次為0.0439，0.0441和0.0442 g/L。

3 討 論

本品方中的主要藥味為五加皮和陳皮。由于五加皮沒有合適的含量測定指標成分，故選取陳皮中的橙皮苷成分為含量測定的指標成分。有關橙皮苷含量測定的研究報道較多。筆者按照《中國藥典》中陳皮的含量測定方法，采用高效液相色譜法測定方中橙皮苷成分[2-3]。有文獻[4]以高效液相色譜法測定五加皮酒中的橙皮苷和齊墩果酸含量，但其采用的是柱切換技術，方法比較繁瑣，流動相比較復雜，測定結(jié)果的變異系數(shù)較大。筆者的方法較之更為簡便準確。當歸、川芎和獨活中均含有揮發(fā)性成分，故本研究采用乙醚萃取制備供試品溶液，參照《中國藥典》對這幾種藥材的薄層色譜鑒別方法進行改進，結(jié)果滿意。

在含量測定方法研究過程中，筆者還采用過以下幾種方法：①取本品，加氯仿振搖脫脂，水層水浴揮去溶劑，再以無水乙醇分次溶解，濾過，制備供試液；②取本品，揮去溶劑，殘渣加甲醇分次溶解，濾過，制備供試液；③取本品，揮去溶劑，加入硅藻土，攪拌均勻，揮干溶劑，再加入無水乙醇，水浴回流提取，制備供試液；④取本品，加乙酸乙酯振搖提取，水浴揮去溶劑，殘渣分次加40%甲醇使溶解，制備供試液。結(jié)果表明，采用前兩種方法時，由于本品中含有大量蔗糖，易粘在瓶壁上，影響溶液的轉(zhuǎn)溶；蔗糖沉淀中亦裹挾了較多的成分，影響分析結(jié)果。方法③采用硅藻土為吸附劑，目的是為了除去樣品中的糖等雜質(zhì)成分，但高效液相色譜實驗結(jié)果表明，本法亦造成橙皮苷成分損失。方法④采用乙酸乙酯溶劑萃取樣品中的橙皮苷成分，但色譜結(jié)果表明，本法提取率較低。故上述方法均不宜采用。本文所采用的供試液制備方法簡便易行，準確可靠。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準：中藥成方制劑:第一冊[M].北京：中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會，1989.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3]劉杰，任孝德，屠萬倩.健兒消食口服液質(zhì)量標準的改進[J].中醫(yī)研究，1997年，19(4): 8-9.

[4]楊江豐，沈利君.HPLC法測定五加皮酒中橙皮苷及齊墩果酸的含量[J].中成藥，1997，19(4): 8-9.