蔡 娟，周 凱，盛文權(quán)，隋延鳴，來(lái)琦芳，陸建學(xué)，么宗利，高鵬程

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，鹽堿水域漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

水體pH值是水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中一個(gè)重要的環(huán)境因子，也是養(yǎng)殖環(huán)境的重要指標(biāo)之一。pH高低直接影響水生動(dòng)物的攝食、生長(zhǎng)及生理代謝［1］，例如：短期的低 pH暴露會(huì)導(dǎo)致厚殼貽貝（Mytilus coruscus）生長(zhǎng)速度減緩，能量積累減少［2］，氧化應(yīng)激增強(qiáng)［3］，免疫水平降低［4］，最終導(dǎo)致厚殼貽貝攝食能力減弱［5］；GUO等［6］研究發(fā)現(xiàn)低pH會(huì)導(dǎo)致雜色鮑（Haliotis diversicolor）、皺紋盤(pán)鮑（H.discus hannai）以及葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）受精率、幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)以及擔(dān)輪幼蟲(chóng)和面盤(pán)幼蟲(chóng)等各階段的表態(tài)率。然而，目前關(guān)于pH對(duì)青蛤（Cyclina sinensis）影響的報(bào)道甚少。青蛤是一種潮間帶貝類(lèi)，廣泛的分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)以及南亞各國(guó)的沿海灘涂［7］，其適宜鹽度、溫度范圍廣，生長(zhǎng)速度快，因此從上世紀(jì)80年代開(kāi)始青蛤已在中國(guó)沿海開(kāi)始人工養(yǎng)殖。近些年，隨著青蛤養(yǎng)殖技術(shù)的進(jìn)一步成熟，內(nèi)陸鹽堿水青蛤養(yǎng)殖也逐漸展開(kāi)［8］。在沿海灘涂的青蛤養(yǎng)殖面臨海水酸化的威脅，而在內(nèi)陸鹽堿水養(yǎng)殖又面臨高pH威脅，因此系統(tǒng)研究pH對(duì)青蛤的生理影響意義重大。

貝類(lèi)體表外包被一層厚厚的石灰質(zhì)貝殼，在其生長(zhǎng)過(guò)程中貝殼也不斷地延伸，因此貝類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程同時(shí)也被看作是一個(gè)生物鈣化的過(guò)程［9］。海洋鈣化生物的貝殼和骨架主要由CaCO3的兩種晶體：文石和方解石構(gòu)成，它們不會(huì)被海水溶解的原因是由于海水中含有過(guò)飽和的 Ca2+和［10］。當(dāng)水體pH改變時(shí)含量隨之變化，這會(huì)對(duì)貝類(lèi)鈣化率造成影響。碳酸酐酶（CA）是一種活性中心含有鋅離子的金屬酶，能夠逆向催化CO2生成碳酸氫鹽的水合反應(yīng)，其在生物鈣化和酸堿平衡方面發(fā)揮著重要的作用［11］。此外，環(huán)境因子（如pH、溫度、溶氧及鹽度）的改變［1，12-13］會(huì)引起生物體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激，為了應(yīng)對(duì)應(yīng)激生物體會(huì)調(diào)節(jié)體內(nèi)抗應(yīng)激相關(guān)酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)重要的抗應(yīng)激酶，它可以將機(jī)體內(nèi)過(guò)多的O-2催化生成H2O2和O2，從而起到保護(hù)機(jī)體的作用［14］。大量研究表明當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）活性會(huì)有所變化［1，12-13］。因此，本實(shí)驗(yàn)從鈣化、碳酸酐酶（CA）活性和超氧化歧化酶（SOD）活性3個(gè)方面來(lái)研究pH變化對(duì)青蛤的影響，以期為pH波動(dòng)條件下的青蛤養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)用青蛤購(gòu)自上海市銅川路水產(chǎn)市場(chǎng)，殼長(zhǎng)為（3.5±0.5）cm、濕重為（13.6±1.2）g。將青蛤表面清洗后，移入盛有鹽度15（模擬青蛤養(yǎng)殖棲息地鹽度）人工海水的500 L塑料箱中。暫養(yǎng)期間，溫度保持25℃，持續(xù)微充氣，日換水量為1／2，投 喂 25 000 cells· mL-1牟 氏 角 毛 藻（Chaetocerosmueller）和微綠球藻（Nannochloropsis oculata）混合藻液，7 d后，選擇健康、活性強(qiáng)、規(guī)格基本一致的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置 5個(gè) pH梯度：7.4、7.8、8.2、8.6、9.0（其中 pH 8.2為對(duì)照組），對(duì)高 pH的控制用Na2CO3和NaHCO3不同配比來(lái)實(shí)現(xiàn)，對(duì)低pH的控制通過(guò)導(dǎo)入CO2來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)在50 L塑料箱中進(jìn)行，每天投喂?jié)舛?5 000 cells·mL-1牟氏角毛藻和微綠球藻混合藻液5 L，半個(gè)小時(shí)后換水1／2。每個(gè)pH組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)中50 ind青蛤，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行7 d，分別在以下時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣：0 h、3 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)隨機(jī)取出5 ind青蛤，隨即在準(zhǔn)備好的冰盒上進(jìn)行內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、鰓等組織的采集。取樣后一部分直接放置于-80℃冰箱中冷凍保存，另一部分按照質(zhì)量體積比1∶9與0.9%生理鹽水緩沖液混合勻漿，8 000 r·min-1離心后取上清液分裝放置于-80℃冰箱保存。同時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器取出3 ind青蛤轉(zhuǎn)移入裝有與處理相同pH海水的3 L塑料瓶中密封5 h，密封前后測(cè)定瓶?jī)?nèi)海水的總堿度，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖稱(chēng)量青蛤去貝殼后的濕重。

1.2.2 CA酶和SOD酶活性測(cè)定方法

CA酶測(cè)定在HENRY等［15］ΔpH法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。將貯存的青蛤組織置于預(yù)冷的Tris緩沖液中（甘露醇225 mmol·L-1，蔗糖75 mmol·L-1，Tris 10 mmol·L-1，用 15%磷酸調(diào)到 pH 7.4）在冰浴條件下勻漿后取適量的組織勻漿液，用預(yù)冷的Tris緩沖液稀釋至8 mL組成反應(yīng)緩沖體系，震蕩混勻，插入pH電極開(kāi)始監(jiān)測(cè)反應(yīng)緩沖體系pH值，待pH穩(wěn)定后，加入240μL 0℃飽和CO2水溶液，即刻起，記錄下降0.15個(gè)pH單位所用的時(shí)間（tenz）。酶催化反應(yīng)的速率要減去不加酶的空白反應(yīng)速率。酶活性標(biāo)準(zhǔn)單位用μmol CO2（mg·min）-1表示。一個(gè)酶活性單位（U）定義為在4℃反應(yīng)體系重，起始pH值為7.4，添加240μL 0℃飽和CO2水溶液，pH值下降0.15所用的時(shí)間（tenz）為空白對(duì)照反應(yīng)時(shí)間（t0）的一半時(shí)所需的酶量。酶活性單位計(jì)算公式：U＝t0·tenz-1。用 ΔpH轉(zhuǎn)化為 μmol CO2·min-1的方法：用移液槍每次加10μL的0.1 mol·L-1HCl，直到媒介下降0.15單位pH，記錄下所用的HCl量，在反應(yīng)中 H+∶CO2＝1∶1，從而獲得消耗 CO2的量。

SOD酶測(cè)定方法參照南京建成總超氧化物歧化酶試劑盒羥胺法測(cè)定。計(jì)算公式：SOD活性（U·mL-1）＝（對(duì)照組OD值-測(cè)定OD值）÷對(duì)照組÷50%×放映稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。單位為：U·mgprot-1。

總蛋白含量采用微量酶標(biāo)法（BCA）測(cè)定。計(jì)算公式：總蛋白濃度（μg·mL-1）＝（測(cè)定 OD值-空白OD值）÷（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（563μg·mL-1）×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。單位為：μg·mL-1。

1.2.3 鈣化率的測(cè)定方法

鈣化率的測(cè)定方法為堿度異常技術(shù)［16］，堿度測(cè)定采用酸堿滴定法［17］。鈣化率的計(jì)算公式：

G＝（TA1-TA2）×V÷（2×T×M），單位為μmol·（g·h）-1。式中，G代表鈣化率；TA1、TA2代表實(shí)驗(yàn)前后總堿度［單位：μmol·（g·h）-1］，T代表實(shí)驗(yàn)時(shí)間（單位：h）；M代表實(shí)驗(yàn)對(duì)象質(zhì)量（單位：g）。堿度的計(jì)算公式：

式中，CHCl為滴定鹽酸濃度，（單位：mol·L-1）；VT為消耗鹽酸總體積（單位：mL）；AT為總堿度（單位：mmol·L-1）。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

文中數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）、Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)置為P＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)青蛤鈣化率的影響

如圖 1所示，與對(duì)照組 pH 8.2相比，pH 7.4、pH 8.6、pH 9.0 3個(gè)處理組鈣化率顯著降低（P＜0.05），而 pH 7.8組相較于對(duì)照組鈣化率下降但差異不顯著。這些結(jié)果表明，當(dāng)pH降至7.8時(shí)青蛤鈣化效率開(kāi)始降低，當(dāng)pH降至7.4時(shí)青蛤鈣化顯著地受到抑制。此外，pH上升同樣會(huì)抑制青蛤鈣化率，當(dāng)pH達(dá)到時(shí)9.0時(shí)青蛤鈣化率幾乎為零。

圖1 pH對(duì)青蛤鈣化率的影響Fig.1 The effects of pH on the calcification rate in Cyclina sinensis

2.2 pH對(duì)青蛤兩種酶（CA、SOD）活性的影響

2.2.1 pH對(duì)青蛤內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、鰓CA酶活性的影響

由圖2可知，在3 h、12 h、1 d、2 d、3 d，與對(duì)照組內(nèi)臟團(tuán)CA酶活性相比，［d2］pH 7.4組內(nèi)臟團(tuán)CA酶活性在各時(shí)間點(diǎn)均顯著上升（P＜0.05）；pH 9.0組內(nèi)臟團(tuán)CA酶活性在12 h、1 d與對(duì)照組內(nèi)臟團(tuán)相比有顯著上升（P＜0.05）。其余時(shí)間段，各個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。

圖2 pH對(duì)青蛤內(nèi)臟團(tuán)碳酸酐酶活性的影響Fig.2 The effects of pH on CA enzyme activity in the visceralmass of Cyclina sinensis

由圖3可知，在12 h、1 d pH 7.4組和pH 9.0組與對(duì)照組外套膜CA酶活性相比顯著上升（P＜0.05），其余各個(gè)時(shí)間段各個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組差異均不顯著。

圖3 pH對(duì)青蛤外套膜碳酸酐酶活性的影響Fig.3 The effects of pH on CA enzyme activity in themantle of Cyclina sinensis

由圖4可知，與對(duì)照組鰓CA酶活性相比，在3 h、12 h、1 d、2 d、3 d時(shí)間段中，pH 7.4組鰓 CA酶活性顯著升高（P＜0.05）；而在 12 h、1 d、2 d時(shí)間段中，pH 9.0組鰓CA酶活性顯著升高（P＜0.05）。

圖4 pH對(duì)青蛤鰓碳酸酐酶活性的影響Fig.4 The effects of pH on CA enzyme activity in the gill of Cyclina sinensis

2.2.2 pH對(duì)青蛤內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、鰓SOD酶活性的影響

由圖5可知，與對(duì)照組內(nèi)臟團(tuán)SOD酶活性相比，在12 h和 1 d pH 7.4組、pH 9.0組內(nèi)臟團(tuán)SOD酶活性顯著上升（P＜0.05），其余各時(shí)間段各組間均無(wú)顯著性差異。

圖5 pH對(duì)青蛤內(nèi)臟團(tuán)SOD酶活性的影響Fig.5 The effects of pH on SOD enzyme activity in the visceralm ass of Cyclina sinensis

由圖6可知，與對(duì)照組外套膜SOD酶活性相比，在12 h、1 d兩個(gè)時(shí)間段 pH 7.4組和 pH 9.0組SOD酶活性出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05），其余各個(gè)階段各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖6 pH對(duì)青蛤外套膜SOD酶活性的影響Fig.6 The effects of pH on SOD enzyme activity in themantle of Cyclina sinensis

由圖7可知，與對(duì)照組鰓SOD酶活性相比，在12 h、1 d兩個(gè)時(shí)間段pH 7.4組和pH 9.0組鰓SOD酶活性出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05），其余各個(gè)階段各試驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖7 pH對(duì)青蛤鰓超氧化歧化酶活性的影響Fig.7 The effects of pH on SOD enzyme activity in the gill of Cyclina sinensis

3 討論

3.1 pH對(duì)青蛤鈣化率的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH改變后青蛤鈣化率也隨之變化，當(dāng)pH降至7.8時(shí)，青蛤鈣化率隨之降低，當(dāng)pH進(jìn)一步降低時(shí)青蛤鈣化效率進(jìn)一步出現(xiàn)顯著性下降。相較于pH降低，pH升高對(duì)青蛤鈣化影響更為明顯，表現(xiàn)為pH升至9.0時(shí)青蛤鈣化率幾乎降至零。目前關(guān)于pH降低對(duì)貝類(lèi)鈣化效率影響的研究屢見(jiàn)報(bào)道，如櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的鈣化率隨著酸化加劇而降低，當(dāng)pH下降到7.9時(shí)其鈣化率下降33%，當(dāng) pH繼續(xù)下降至 7.3時(shí)鈣化率趨近于0［18］。MILER等［19］研究發(fā)現(xiàn)海水pH降低對(duì)不同貝類(lèi)鈣化作用的影響程度不同，pH在7.7～8.1范圍內(nèi)，美洲牡蠣（C.virginica）幼蟲(chóng)的貝殼面積減少16%，鈣質(zhì)在貝殼中所占比例下降了近一半；而近江牡蠣（C.ariakensis）的鈣化活動(dòng)仍能正常進(jìn)行。由此可見(jiàn)，pH對(duì)貝類(lèi)鈣化率的影響有一定的種間差異性。當(dāng)海水吸收了大量CO2，pH下降，導(dǎo)致其中碳酸根含量降低，而海水中鈣離子濃度相對(duì)穩(wěn)定，因此海水中碳酸鈣飽和度Ω降低，直接導(dǎo)致了貝類(lèi)鈣化效率的降低，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也基本反映了這一現(xiàn)象；反之，當(dāng)海水pH升高時(shí)，海水中碳酸根含量升高，碳酸鈣飽和度Ω升高，理論上有利于貝類(lèi)鈣化效率。［d5］

3.2 不同pH對(duì)青蛤兩種酶（CA、SOD）活性的影響

3.2.1 不同pH對(duì)青蛤內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、鰓CA酶活性的影響

碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）是一種Zn2+結(jié)合金屬酶，催化 CO2水解可逆反應(yīng)（CO2+H2O?HCO-3+H+），具有廣泛的生物學(xué)功能，參與諸多生命活動(dòng)如酸堿平衡調(diào)節(jié)［20］、離子運(yùn)輸［21］、滲透壓調(diào)節(jié)［22］以及生物礦化［23］等。本研究顯示，當(dāng)pH在7.8～8.6幅度內(nèi)變化時(shí)，各組織CA活性變化不大，表明遭遇小幅度的pH波動(dòng)對(duì)青蛤的生理影響并不大。3種組織中內(nèi)臟團(tuán)CA活性最高，外套膜次之，鰓組織CA酶活性最低。與對(duì)照組相比，pH 7.4時(shí)青蛤內(nèi)臟團(tuán)、鰓組織中CA活性出現(xiàn)差異的時(shí)間段是在3 h～3 d，而外套膜CA活性?xún)H僅在12 h～1 d出現(xiàn)差異；在pH 9.0組內(nèi)臟團(tuán)CA酶活性出現(xiàn)差異的時(shí)間段是在3 h～3 d，持續(xù)的時(shí)間與pH 7.4組相同，鰓CA酶活性出現(xiàn)差異的時(shí)間段是在12 h～2 d，外套膜CA酶活性出現(xiàn)差異的時(shí)間段是在12 h～1d，持續(xù)時(shí)間最短。類(lèi)似的報(bào)道同樣出現(xiàn)在菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）中，VELEZ等［24］發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷7 d pH 7.3暴露，菲律賓蛤仔 CA活性顯著地上升之后迅速恢復(fù)正常；但是相反的結(jié)果出現(xiàn)在長(zhǎng)牡蠣（C.gigas）中，MOREIRA等［25］證實(shí)，pH 7.3暴露會(huì)明顯抑制牡蠣 CA活性。針對(duì)這兩種截然不同的結(jié)果，筆者推測(cè)這可能歸咎于物種生存習(xí)性的差異，菲律賓蛤仔和青蛤生活于灘涂中而牡蠣附著于潮間帶巖石上，相較于潮間帶，灘涂環(huán)境因子變化更加多樣頻繁，造就了物種更強(qiáng)的適應(yīng)能力。［d6］目前關(guān)于高pH對(duì)貝類(lèi)碳酸酐酶報(bào)道甚少，本課題組用高pH環(huán)境脅迫凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）發(fā)現(xiàn)其鰓在高碳酸鹽堿度脅迫的第1天CA基因表達(dá)量上升為對(duì)照組的30倍，之后在第2天回落到初始水平［26］。而本次實(shí)驗(yàn)青蛤需要3 d CA的活性才恢復(fù)原水平，說(shuō)明青蛤相較于凡納濱對(duì)蝦應(yīng)對(duì)pH變化的機(jī)理可能有一定的差別。

3.2.2 pH對(duì)青蛤內(nèi)臟團(tuán)、外套膜、鰓SOD酶活性的影響

SOD酶是生物體內(nèi)重要的抗應(yīng)激因子，其主要作用是清除機(jī)體過(guò)多的超氧陰離子（O-2）。在生物體內(nèi)超氧陰離子來(lái)源于線(xiàn)粒體代謝副產(chǎn)物［27］，一定量的超氧陰離子可以幫助機(jī)體清除凋亡細(xì)胞、殺死細(xì)菌、維持機(jī)體穩(wěn)定［28］，但當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境脅迫時(shí)（溫度、鹽度、pH等）線(xiàn)粒體代謝會(huì)產(chǎn)生過(guò)多O-2［29-30］，而過(guò)多的O-2會(huì)破壞DNA結(jié)構(gòu)，氧化細(xì)胞膜給機(jī)體帶來(lái)一系列的傷害［4］。為了控制體內(nèi)O-2水平，機(jī)體會(huì)調(diào)節(jié)SOD酶活性來(lái)清除過(guò)多的O-2以保證機(jī)體處于健康狀態(tài)。在低pH脅迫方面，大量的報(bào)道表明，低酸暴露貝類(lèi)SOD酶活性經(jīng)歷一個(gè)先升高后恢復(fù)的過(guò)程［1，3］，同樣在本實(shí)驗(yàn)中青蛤經(jīng)歷pH7.4暴露后鰓、內(nèi)臟團(tuán)以及外套膜SOD酶活性都呈現(xiàn)一個(gè)先升高后恢復(fù)過(guò)程。這可能由于青蛤在剛經(jīng)歷低pH暴露后其機(jī)體代謝會(huì)產(chǎn)生大量的O-2繼而誘導(dǎo)SOD酶活性提升，隨著時(shí)間的延續(xù)機(jī)體適應(yīng)了低pH因此代謝過(guò)程中產(chǎn)生O-2隨之降低而恢復(fù)到正常水平，因此SOD酶活性也恢復(fù)至原先的水平。高pH脅迫對(duì)貝類(lèi)的影響目前研究甚少，LIN等［8］指出長(zhǎng)期的高pH脅迫會(huì)導(dǎo)致青蛤血細(xì)胞數(shù)目降低，吞噬能力減弱，但對(duì)抗應(yīng)激相關(guān)蛋白的研究并無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高pH暴露青蛤各組織SOD酶活性同樣會(huì)經(jīng)歷一個(gè)先升高后恢復(fù)過(guò)程，筆者推測(cè)其原因與低pH暴露類(lèi)似。

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