朱杭 林士明 王棟 諸力 何永江 王堅(jiān) 潘浩

椎間盤退變是機(jī)體正常的退化過程，椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)丟失是其典型特征[1]。椎間盤突出引起的神經(jīng)根性疼痛與背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）受壓、髓核接觸神經(jīng)根后誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)有關(guān)[2-6]。髓核突出后誘導(dǎo)的神經(jīng)根性炎癥反應(yīng)極其復(fù)雜，各種促炎細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等參與其中[7-9]；此外，免疫球蛋白、氫、一氧化氮（NO）也參與其中[10]。核因子-κB（NF-κB）在炎癥反應(yīng)應(yīng)激過程中起著關(guān)鍵的作用，其參與多種疾病的發(fā)病[11-14]。在退化的椎間盤內(nèi)作為NF-κB靶基因的TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8水平增加[15-16]，表明NF-κB參與了椎間盤的退行性改變。此外，在退化的椎間盤內(nèi)NF-κB傳導(dǎo)信號通路也被激活，尤其在髓核組織中，并顯示與累積的氧化應(yīng)激和基質(zhì)丟失相關(guān)[17-18]。酸敏感離子通道（acid sensing ion channel，ASIC）蛋白是阿米洛利敏感性Na+通道/變性蛋白家族的成員，其形成同聚和異聚功能膜通道[19]，其中ASIC3已被證實(shí)與缺血、炎癥或組織酸中毒相關(guān)疼痛的傳導(dǎo)緊密相關(guān)，使髓核適應(yīng)椎間盤的酸性和高滲微環(huán)境。本研究擬觀察NF-κB和ASIC3信號通路阻斷劑PDTC和阿米洛利對髓核致炎大鼠DRG中NF-κB和ASIC3表達(dá)的影響，并檢測大鼠后足機(jī)械刺激縮足閾值（pain withdrawal threshold，PWT）及外周血和 DRG 中 NO、TNF-α、IL-6水平，以探索 NF-κB和ASIC3在髓核組織誘導(dǎo)發(fā)生神經(jīng)根性疼痛的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物條件 80只清潔級成年雄性SD大鼠，體重220～240g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXY（浙）2013-0016。實(shí)驗(yàn)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室溫度22～25℃、12h明暗循環(huán)，大鼠自由飲水?dāng)z食。實(shí)驗(yàn)程序遵循美國國立衛(wèi)生研究院制定的《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》（第9版，2010年）。動物實(shí)驗(yàn)方案通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 手術(shù)方法 通過腹腔內(nèi)注射水合氯醛（100g/L）麻醉大鼠。以大鼠髂嵴最高點(diǎn)連線為中心作25～30mm正中縱切口暴露脊柱及兩側(cè)組織，切除L5下關(guān)節(jié)突、L6上關(guān)節(jié)突和L5半椎板，暴露左側(cè)L5DRG及部分脊髓硬膜囊。采用18G的皮膚穿刺針頭在L5～6椎間盤進(jìn)行穿刺，針頭用持針器夾持，尖端保留5mm長度，于纖維環(huán)前外側(cè)方平行終板方向刺入，深度控制在5mm，刺入后維持5s；然后，斷尾，縱向切開鼠尾根部，從2個(gè)椎間盤內(nèi)取髓核組織共0.4mg，置于L5DRG上，術(shù)畢逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。術(shù)后肌肉注射2萬U青霉素（80萬 U/0.48g，H37021359，齊魯制藥有限公司）預(yù)防感染。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 80只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，對照組、模型組、阿米洛利組、PDTC組和阿米洛利+PDTC組，每組16只。各組處理及給藥方法如下：（1）對照組在上述手術(shù)過程中暴露L5DRG后直接縫合。（2）模型組按上述手術(shù)方法進(jìn)行造模。（3）阿米洛利組按上述手術(shù)方法進(jìn)行造模，并于術(shù)后2周內(nèi)每天腹腔內(nèi)注射20μg/kg阿米洛利（H10900015，美國Sigma公司）。（4）PDTC組按上述手術(shù)方法進(jìn)行造模，并于術(shù)后2周內(nèi)每天腹腔內(nèi)注射20μg/kg PDTC（S1809，美國Sigma公司）。（5）阿米洛利+PDTC組按上述手術(shù)方法進(jìn)行造模，并于術(shù)后2周內(nèi)每天腹腔內(nèi)注射20μg/kg阿米洛利和20μg/kg PDTC。對照組和模型組不進(jìn)行藥物干預(yù)。術(shù)后1、3、7、14d，每天隨機(jī)處死3只大鼠并取出L5DRG，采用5ml注射器刺入L5～6椎間隙水平內(nèi)取外周血，-20℃保存。

1.2.3 大鼠后足PWT測定 各組隨機(jī)選取4只大鼠分別于術(shù)后 2、4、6、8、10、12d 采用 Up-Down 法測定大鼠后足PWT。檢測工具為8根強(qiáng)度呈對數(shù)遞增方式的Von Frey纖毛機(jī)械刺激針（BIO-EVF3，上海玉研科學(xué)儀器有限公司），間隔5min重復(fù)刺激3次，初始刺激強(qiáng)度為2.04g，每次刺激時(shí)間為4～6s。在測試前30min，將大鼠置于測定PWT值用的籠子內(nèi)適應(yīng)測試環(huán)境。

1.2.4 ASIC3、NF-κB p65、TNF-α 和 IL-6 mRNA 表達(dá)水平測定 采用RT-PCR法。術(shù)后14d，以Trizol法提取L5DRG中總RNA。取1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 60min，85℃ 5min，4℃ 5min。以 GAPDH為內(nèi)參，設(shè)計(jì)引物：ASIC3上游為 5′-CGCTATGTGGCTCGGAAGTG-3′，下游為 5′-TGTAGGACTCGCTGCGGTTG-3′；NF-κB p65 上 游 為 5′-TTTAGCCT-GCTGGCGGTTCC-3′，下游為 5′-ACCGAGTGCAGCCGTGATTG-3′；TNF-α 上游為 5′-CTGAGGTCAACCTGCCCAAG-3′，下游為 5′-GGCTGGGTAGAGAACGGATG-3′；IL-6 上游為 5′-CACCAGGAACGAAAGTCAAC-3′，下游為 5′-GGCTGTCAACAACATCAGTC-3′。通過逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 2μl進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR 反應(yīng)條件為：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s循環(huán)擴(kuò)增。采用ABI Prism 7300 SDS（美國ABI公司）儀器分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 ASIC3、NF-κB p65、TNF-α 和 IL-6 蛋白表達(dá)水平測定 采用Western blot法。術(shù)后14d，將DRG剪成細(xì)小的碎片，按每20mg加入150～250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12 000g離心15min，取上清液，進(jìn)行蛋白含量測定。蛋白含量采用紫外分光光度法在562nm處進(jìn)行測定。灌膠上樣進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳后，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用立春紅染色觀察轉(zhuǎn)印是是否成功，5%脫脂奶粉的Tris緩沖液4℃過夜封閉，洗膜后分別加入兔抗鼠 ASIC3（1∶400）、NF-κB p65（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）一抗溶液，4℃雜交過夜，用洗膜液漂洗后加入1∶1 000稀釋的二抗雜交 1h后，取出用洗膜液沖洗，ECL顯色，并使用Image J.1.46軟件分析灰度值。

1.2.6 TNF-α和IL-6水平測定 采用ELISA法測定術(shù)后1、3、7、14d外周血及DRG上清液中的TNF-α和IL-6水平。試劑盒由上海恒斐生物科技有限公司提供。1.2.7 NO水平測定 將外周血和DRG以1 000g離心10min，收集上清液，使用NO測定試劑盒（型號A012，南京建成生物工程研究所）在術(shù)后1、3、7、14d測定NO水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較 模型組、阿米洛利組、PDTC組和阿米洛利+PDTC組大鼠DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白水平均高于對照組（均P＜0.05），而阿米洛利組、PDTC組和阿米洛利+PDTC組大鼠DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于模型組（均P＜0.05），見圖1。

圖1 5組大鼠DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（a：5組大鼠NF-κB p65和ASIC3的mRNA表達(dá)水平比較；b：5組大鼠NF-κB p65和ASIC3蛋白表達(dá)電泳圖；c：5組大鼠NF-κB p65和ASIC3的蛋白表達(dá)水平比較）

2.2 大鼠后足 PWT的變化情況 術(shù)后 2、4、6、8、10、12d模型組大鼠后足PWT與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。阿米洛利組、PDTC組和阿米洛利+PDTC組大鼠后足PWT術(shù)后8d內(nèi)下降，之后逐漸增加；術(shù)后10、12d阿米洛利組、PDTC組和阿米洛利+PDTC組大鼠后足PWT明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01），見圖2。

圖2 大鼠后足PWT的變化情況

2.3 5組大鼠外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6表達(dá)水平的比較 模型組、阿米洛利組、PDTC組和阿米洛利+PDTC組大鼠外周血和DRG中術(shù)后1、3、7、14d的NO、TNF-α和IL-6表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)（均 P＜0.01），且模型組術(shù)后 3、7、14d 的 NO、TNF-α和IL-6表達(dá)水平較阿米洛利組、PDTC組和阿米洛利+PDTC組也顯著上調(diào)（均P＜0.01），見圖3。通過RTPCR法和Western blot法測量5組大鼠DRG也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，見圖4。

圖3 5組大鼠外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6表達(dá)水平比較（a、b：5組大鼠外周血和DRG中NO表達(dá)水平比較；c、d：5組大鼠外周血和DRG中TNF-α表達(dá)水平比較；e、f：5組大鼠外周血和DRG中IL-6表達(dá)水平比較）

圖4 5組大鼠DRG中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（a：5組大鼠IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平比較；b：5組大鼠IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)電泳圖；c：5組大鼠IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平比較）

3 討論

椎間盤是由髓核和纖維環(huán)組成的特殊生物力學(xué)結(jié)構(gòu)，髓核細(xì)胞外基質(zhì)由蛋白多糖和蛋白聚糖組成，使組織具有較高的滲透壓，使其適應(yīng)所施加的機(jī)械負(fù)荷。最近許多研究把焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到由髓核組織與神經(jīng)根和周圍組織接觸引發(fā)的炎癥過程[10，20]。本研究通過將髓核置于DRG的模型組與未將髓核置于DRG的對照組比較，發(fā)現(xiàn)模型組DRG中NF-κB p65和ASIC3的mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著增加，表明髓核組織可以刺激NF-κB和ASIC3在DRG的表達(dá)。而腹腔內(nèi)注射PDTC或/和阿米洛利則顯著抑制由髓核組織暴露DRG中NF-κB和ASIC3的表達(dá)。

機(jī)械痛覺過敏是炎癥過程的特征性特點(diǎn)，在于感受傷害閾值的降低和對于熱和機(jī)械刺激的敏感性增加[21]。本研究模型組中大鼠后足PWT在術(shù)后12d內(nèi)持續(xù)下降，在10d時(shí)下降最為明顯。然而，由髓核組織誘導(dǎo)的痛覺過敏在阿米洛利或/和PDTC組中得到顯著改善，在術(shù)后8d開始顯著上升，表明ASIC3和NF-κB可能與機(jī)械痛覺過敏有緊密的聯(lián)系，ASIC3的特異阻斷劑阿米洛利和NF-κB抑制劑PDTC可減輕機(jī)械痛覺過敏。

細(xì)胞炎性因子與神經(jīng)肽的增加相關(guān)，用其抑制劑可以減少外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛[22-23]。本研究模型組術(shù)后14d，通過ELISA和生化檢測到外周血和DRG中NO、TNF-α和IL-6水平均增加。通過Western blot法也同樣檢測到DRG中TNF-α和IL-6水平均增加。阿米洛利組、PDTC組和阿米洛利+PDTC組顯著抑制了術(shù)后3、7、14d內(nèi)NO、TNF-α和IL-6水平的上調(diào)，表明NF-κB和ASIC3與炎癥過程密切相關(guān)，可使多種細(xì)胞炎性因子的表達(dá)上調(diào)并增強(qiáng)這些介質(zhì)的疼痛加強(qiáng)作用。而PDTC或/和阿米洛利通過抑制NF-κB和ASIC3的表達(dá)從而降低細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，減緩局部的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，椎間盤突出發(fā)生后，髓核介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以引起NF-κB和ASIC3在DRG中的表達(dá)上調(diào)，而NF-κB和ASIC3可相互影響通過抑制NO及多種細(xì)胞炎性因子（TNF-α和IL-6）的表達(dá)，減弱髓核組織對DRG的炎癥損傷而致的痛覺過敏，減緩神經(jīng)根性疼痛。

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