吳兆圓 張亞妮 方偉 石麗橋 劉曼莉

摘要：在抗菌活性天然產(chǎn)物的篩選過(guò)程中，篩選到一株具有強(qiáng)抗菌活性的真菌SF_24818，通過(guò)活性跟蹤，確定其中的活性組分，并大量發(fā)酵菌株，經(jīng)提取和制備高效液相色譜，分離得到2個(gè)抗菌活性化合物，經(jīng)紫外、質(zhì)譜和核磁共振確定化合物為新羥基曲霉酸和曲霉酸，進(jìn)一步的抗菌活性測(cè)試表明其具有顯著的抗金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）作用。

關(guān)鍵詞：抗菌活性;真菌;新羥基曲霉酸;曲霉酸

中圖分類號(hào)：S482.2+92? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）24-0093-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.025? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： In the search for antimicrobial natural products， fungus SF_24818 with strong antimicrobial activity was obtained. By active tracking，the active fraction was detected，and two active compounds which were identified as neohydroxyaspergillic acid and aspergillic acid by UV，MS and NMR were isolated from the culture of large scare fermentation of SF_24818. Further antimicrobial activity tests showed that the two active compounds had significant antimicrobial effect to Staphylicoccus aureus.

Key words： antimicrobial activity; fungi; neohydroxyaspergillic acid; aspergillic acid

細(xì)菌性傳染病一直是人類和動(dòng)物健康的重要威脅。抗生素在控制細(xì)菌感染中發(fā)揮著重要作用。但臨床多重耐藥菌株、超級(jí)耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，均提示現(xiàn)有抗細(xì)菌感染的藥物已不能滿足動(dòng)物和人類防控細(xì)菌感染的需求。因此迫切需要研究新的抗細(xì)菌藥物。

真菌分布廣泛，從陸地到海洋，從動(dòng)物到植物，乃至其他微生物，幾乎都有真菌的存在。正是由于真菌的物種多樣性與生態(tài)環(huán)境的多樣性導(dǎo)致了其次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和生物活性的多樣性，因而一直以來(lái)都是藥物及其先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源之一[1，2]。臨床上廣泛使用的青霉素、洛伐他汀、環(huán)孢素以及棘白霉素等藥物，都是真菌次生代謝產(chǎn)物或其衍生物[3]。

在抗菌活性篩選過(guò)程中，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心課題組篩選到一株強(qiáng)抗菌活性真菌SF_24818，通過(guò)活性追蹤，得到其中的抗菌活性化合物，經(jīng)LC_MS和NMR鑒定為曲霉酸（Aspergillic acid）和新羥基曲霉酸（Neohydroxyaspergillic acid）。

1? 材料與方法

1.1? 主要儀器和試劑

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)，δ為mg/L，J為Hz）（德國(guó)Bruker BioSpin公司）;Waters 2695液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）;Water 2767高效液相制備儀（Waters 2525泵，帶2767自動(dòng)收集系統(tǒng)，2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站Masslynx V4.0）;美國(guó)Sunfire C18 OBD制備柱（5 μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，愛(ài)爾蘭）。分離提取用試劑乙酸乙酯和乙腈均為國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)。

1.2? 菌株

1.2.1? 化合物產(chǎn)生菌? 編號(hào)SF_24818菌株分離自武漢市周邊土壤樣本，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

1.2.2? 細(xì)菌菌株? 大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）、沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、乙型鏈球菌（Beta streptococcus）菌種由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

1.3? 化合物的培養(yǎng)和提取

菌株SF_24818的種子在ISP-2培養(yǎng)基（麥芽糖6.25 g/L，麥芽提取物6.25 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，硫酸鎂0.625 g/L，pH調(diào)至7.0）中于28 ℃，以轉(zhuǎn)速120 r/min進(jìn)行振搖培養(yǎng)。發(fā)酵96 h后，在無(wú)菌條件下將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)入ISP-2培養(yǎng)基中，接種量為10%（V/V），在28 ℃的溫度下，在搖床上以120 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行培養(yǎng)120 h。

初篩時(shí)發(fā)酵液為50 mL，冷凍干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，離心，取上層有機(jī)相，回收乙酸乙酯后加入1 mL甲醇溶解，作為活性測(cè)試和活性跟蹤樣品。大量發(fā)酵為20 L的發(fā)酵液中加入20 L的乙酸乙酯攪拌提取3次，提取液過(guò)濾后真空濃縮得到提取物。

1.4? 活性跟蹤和分離純化

取初篩樣品進(jìn)行半制備（Sunfire C18 OBD制備柱，5 μm，10 mm×250 mm，7.5 mL/min），洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min，得到36個(gè)組分，溶劑揮發(fā)干后，用1 mL甲醇溶解作為活性測(cè)試樣品。

大量發(fā)酵的乙酸乙酯提取物溶解于甲醇中，用反相制備色譜柱（Sunfire C18 OBD制備柱，5 μm， 19 mm×250 mm，27 mL/min）進(jìn)行粗分，洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min，然后再針對(duì)活性化合物進(jìn)行細(xì)分，采用洗脫梯度10%～60%得到化合物1和化合物2。

1.5? 提取物抗菌活性測(cè)試

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、乙型鏈球菌菌種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)1次后，再將其接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6～12 h為種子菌液。將種子菌液按培養(yǎng)基總體積的1‰接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后將菌液稀釋至1×106 CFU/mL備用。待測(cè)樣品用乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至96孔板，待乙醇揮發(fā)干后，加入菌液200 μL/孔，使待測(cè)樣品終濃度約為20 μg/mL，振蕩混勻后37 ℃培養(yǎng)12～24 h，用酶標(biāo)儀測(cè)OD630 nm，同時(shí)設(shè)空白培養(yǎng)基對(duì)照孔和不加藥的菌液對(duì)照孔。以培養(yǎng)基為空白（0），以未處理帶菌培養(yǎng)液為對(duì)照（100%），計(jì)分方法：“-”為無(wú)死亡;“+”為少于25%死亡;“++”為25%～50%死亡;“+++”為50%～75%死亡;“++++”為超過(guò)75%死亡。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 活性測(cè)試結(jié)果

初篩結(jié)果（表1）表明，SF_24818的乙酸乙酯提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌以及乙型鏈球菌均呈現(xiàn)較強(qiáng)的抗菌活性?；钚愿櫧Y(jié)果（表1）表明，組分11和組分15具有強(qiáng)抗菌活性，其中組分15對(duì)所有病原菌都呈現(xiàn)>75%的抗菌活性。SF_24818大量發(fā)酵后，根據(jù)LC_MS分析，活性組分11和組分15所含主要化合物分別為化合物1和化合物2，分離純化后再次進(jìn)行活性測(cè)試，表明化合物1和化合物2為抗菌活性化合物。

2.2? 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1（圖1）：淡黃色粉末;UV（MeOH）λmax：228，320 nm;ESI-MS（陽(yáng)離子）：165.2，207.3，225.3[M+1]+;ESI-MS（陰離子）：108.0，151.1，223.2[M-1]（圖2、圖3）。根據(jù)化合物的紫外以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，查詢天然產(chǎn)物詞典（Dictionary of Natural Products on CD-ROM，2009版），結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[4]，鑒定為曲霉酸。

化合物2（圖1）：UV（MeOH）λmax：240，326，365（sh） nm;ESI-MS（陽(yáng)離子）：162.5，206.3，241.4[M+1]+;ESI-MS（陰離子）：167.1，239.2[M-1]（圖2、圖3）。根據(jù)化合物的紫外以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，查詢天然產(chǎn)物詞典，推測(cè)化合物為新曲霉酸類化合物，進(jìn)一步通過(guò)13C-NMR數(shù)據(jù)[5]，鑒定為新羥基曲霉酸。13C-NMR（CD3OD，125 MHz）：155.8（C-2，s），154.3（C-3），122.4（C-5），142.6（C-6），43.0（C-7），28.4（C-8），23.0（C-9），23.0（C-10），72.5（C-11），33.6（C-12）， 19.9（C-13），16.8（C-14）。

3? 討論

抗生素在畜牧業(yè)中的應(yīng)用非常廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)生產(chǎn)的抗生素原料有接近半數(shù)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[6]?？股氐拇罅渴褂萌菀自斐赡退幘漠a(chǎn)生，同時(shí)存在抗生素殘留等問(wèn)題。盡管現(xiàn)在一般使用專用的飼料抗生素，但是由于存在監(jiān)管問(wèn)題，人用抗生素的濫用也是較為普遍的問(wèn)題，這將很大程度上增強(qiáng)人感染微生物的耐藥性，給人類生命健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅[7，8]。進(jìn)一步加快專門(mén)的畜牧用抗生素的研發(fā)是解決途徑之一。在本研究中，篩選到具有抗菌活性的化合物曲霉酸和新羥基曲霉酸，這類化合物早期就被發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性[9，10]。表明從真菌中發(fā)現(xiàn)活性抗菌化合物是一個(gè)較好的途徑，另外，隨著耐藥菌的出現(xiàn)以及新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，對(duì)一些已知化合物的抗菌活性再評(píng)價(jià)也是有必要的。

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