肖杰華 冶娟

[摘要]目的：對體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細胞分別使用3種不同波長（595nm、755nm、1 064nm）的激光照射，觀察分析不同波長激光照射對成纖維細胞中I型、Ⅲ型前膠原mRNA表達水平的影響。方法：采用體外培養(yǎng)新生小鼠成纖維細胞，根據(jù)激光照射的波長不同通將其分為對照組6只（不采用激光照射），595nm組6只（采用波長為595nm激光照射），755nm組6只（采用波長為755nm激光照射）及1 064nm組6只（采用波長為1 064nm激光照射）。通過熒光定量（RT-PCR）法測定成纖維細胞I型、Ⅲ型前膠原mRNA的表達水平。結(jié)果：4組間Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的表達水平間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其中1 064nm組的Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的相對表達量達到最高，分別為（113.07±2.85）×10-2、（118.72±1.96）×10-2，均顯著高于595nm組的[（96.74±1.03）×10-2、（101.51±1.64）×10-2，P<0.01]，755nm組的[（100.02±1.86）×10-2、（109.27±1.02）×10-2，P<0.01]，及對照組的[（87.14±0.82）×10-2、（100.48±0.73）×10-2，P<0.01]；755nm組Ⅰ型前膠原mRNA的相對表達量顯著高于對照組（P<0.01），而其Ⅲ型前膠原mRNA的表達水平則顯著高于595nm組和對照組（P<0.01）；595nm組僅有Ⅰ型前膠原表達水平mRNA顯著高于對照組（P<0.01）。結(jié)論：激光照射可以誘導成纖維細胞中I型、Ⅲ型前膠原mRNA表達增加。其中，波長為595nm的激光照射僅能促進I型前膠原mRNA表達上調(diào)，755nm激光照射后Ⅲ型前膠原mRNA表達上調(diào)明顯高于595nm激光，而1 064nm激光照射后兩種前膠原mRNA表達水平最高。

[關(guān)鍵詞]激光；小鼠成纖維細胞；前膠原I型；前膠原Ⅲ型；mRNA；皮膚老化

[中圖分類號]R329 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）12-0125-04

Effects of Three Wavelength Laser Irradiation on the Expression of Procollagen Type Ⅰ and Ⅲ Procollagen mRNA in Cultured Fibroblasts

XIAO Jie-hua1，YE Juan2

（1.Qinghai Health Vocational and Technical College，Xining 810000，Qinghai，China；2. Medical Beauty Center，Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining 810000，Qinghai，China）

Abstract： Objective In vitro cultured mouse fibroblasts were irradiated with 3 different wavelengths （595/755/1 064nm）， and the effects of laser irradiation at different wavelengths on the expression of two types of procollagen （type I， type Ⅲ） in fibroblasts were observed and analyzed. Methods Neonatal mouse fibroblasts were cultured in vitro. According to the wavelength of laser irradiation， it was divided into 6 cases in control group， 6 cases in 595nm group with laser irradiation at 595nm， 6 cases in 755nm group with laser irradiation at 755nm and 6 cases in 1 064nm group laser irradiation at 1064nm. The expression of type I and type Ⅲ procollagen mRNA in fibroblasts was determined by RT-PCR. Results There were significant differences in the expression of procollagen mRNA among the four groups （P<0.05）， and the relative expression of procollagen mRNA in 1 064nm group was the highest[ （113.07±2.85）×10-2，（118.72±1.96）×10-2，P<0.01]，respectively. It was significantly higher than those in 595nm group [（96.74±1.03）×10-2，（101.51±1.64）×10-2，P<0.01]，than those in 755nm group [（100.02±1.86）×10-2， （109.27±1.02）×10-2，P<0.01]. In the control group [（87.14±0.82） ×10-2，（100.48±0.73）×10-2，P<0.01]. The relative expression of typeⅠprocollagen mRNA in group B was significantly higher than that in control group （P<0.01）， and the expression level of type Ⅲ procollagen mRNA in 755nm group was significantly higher than that in 595nm group and control group （P<0.01）， but only typeⅠprocollagen mRNA in 595nm group was significantly higher than that in control group （P<0.01）. Conclusion Laser irradiation can induce two precollagen （typeⅠ， type Ⅲ） mRNA expression in fibroblasts. The laser irradiation with a wavelength of 595nm can only promote the up regulation of mRNA expression of type I procollagen， and the up regulation of mRNA expression of type Ⅲ procollagen mRNA after 755nm laser irradiation is significantly higher than that of 595nm laser， while the highest expression level of two procollagen mRNA was observed after 1 064nm laser irradiation.

Key words： laser； mouse fibroblasts； procollagen type I； procollagen type Ⅲ； mRNA； skin aging

膠原蛋白是皮膚真皮的重要組成部分，隨著年齡增長，其在人體內(nèi)的含量也會隨之減少。因此，膠原蛋白也被臨床作為評估皮膚衰老的重要指標[1]。成纖維細胞是合成分泌膠原蛋白的主要細胞，當皮膚成纖維細胞老化后，其活性下降，分泌的膠原蛋白也隨之減少，進而加速了皮膚老化[2-3]。國內(nèi)外相關(guān)研究[4-5]曾表明：非剝脫性激光照射可以加速成纖維細胞的增殖分化。且激光治療的嫩膚效果明顯，已被廣泛應(yīng)用于皮膚美容中?；诖耍疚氖褂昧?種不同波長的激光照射成纖維細胞，進一步研究討論不同激光作用下，I型和Ⅲ型前膠原mRNA表達水平是否存在差異，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器：選取出生2個月的健康昆明小鼠，均為雌性，體重（34±2）g，由廣州市賽柏諾生物科技有限公司提供。倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；595nm脈沖染料激光（PDL），購自美國賽諾秀公司；755nm翠綠寶石激光（GentleLase），Q開關(guān)1 064nm激光（ND：YAG），755nm、1 064nm激光儀均購自美國Candela公司；PCR儀購自美國ABI公司；TM 2 200凝膠成像系統(tǒng)（Alphaimager），購自北京博嘉興業(yè)科技有限公司；提取總RNA的Trizol試劑購自合肥博美生物科技有限責任公司；熒光定量PCR試劑盒來自美國Pepro Tech 公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 體外成纖維細胞培養(yǎng)及分組：根據(jù)參考文獻的[6]方法收集小鼠皮膚，向DEME培養(yǎng)基內(nèi)接種成纖維細胞，放置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件：5% CO2、37℃、95%飽和濕度。通過倒置顯微鏡觀察到纖維母細胞邊界清楚、呈梭形或多角形胞體，均為貼壁生長，待細胞生長達到相互融合狀態(tài)后，進行消化傳代培養(yǎng)，并將細胞接種于玻璃培養(yǎng)皿中。單個樣本：以1ml第2代細胞懸液5×106細胞/ml接種于新的培養(yǎng)皿中為準，根據(jù)激光照射的波長不同通將所有樣本分為對照組6只，不給予激光照射；595nm組6只，采用波長為595nm的激光照射，脈寬3ms，光斑直徑為7mm，能量密度保持為10J/cm2；755nm組6只，采用波長為755nm的激光照射，脈寬及能量密度同595nm組，光斑直徑為10mm；1 064nm組6只，采用波長為1 064nm的激光照射，脈寬10ms，光斑直徑為3mm，能量密度保持為2.5J/cm2。激光分10個區(qū)域垂直照射玻璃培養(yǎng)蓋，非重疊全覆蓋照射，每天1次，連續(xù)照射3d。激光照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)10h。

1.2.2 RT-PCR檢測：采用Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；嚴格按照RT-PCR試劑盒操作，加入Ⅰ、Ⅲ型前膠原上、下游引物進行PCR反應(yīng)。擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶圖像，以β-actin為內(nèi)參標準，計算I型、Ⅲ型前膠原電泳條帶密度/β-actin比值，即膠原的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析：采用軟件SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)，計量資料用（x?±s）表示，組間比較行F檢驗，兩兩比較行配對t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Ⅰ型前膠原mRNA相對表達量比較：4組間Ⅰ型前膠原mRNA的表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與對照組相比，595nm組、755nm組、1 064nm組Ⅰ型前膠原mRNA的表達水平明顯更高（P<0.01）；其中1 064nm組的mRNA的表達水平最高，明顯高于595nm組、755nm組（P<0.01），而595nm組、755nm組mRNA的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1，圖1。

2.2 各組Ⅲ型前膠原mRNA相對表達量比較：4組間Ⅲ型前膠原mRNA的表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其中，1 064nm組的mRNA表達水平最高，明顯高于595nm組、755nm組和對照組（P<0.01），而755nm組mRNA的表達水平則顯著高于595nm組和對照組（P<0.01），但595nm組mRNA的表達水平與對照比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2，圖2。

3 討論

隨著年齡增加，皮膚衰老明顯，表現(xiàn)為：松弛、彈性下降等，而這些均是由成纖維細胞失去活性，合成分泌功能減弱有關(guān)。成纖維細胞是皮膚真皮的重要組成部分，研究表明：其合成分泌的膠原蛋白，是維持皮膚彈性，修復皮膚創(chuàng)傷的基礎(chǔ)[7-8]。因此，增強成纖維細胞活性，促進膠原含量的合成分泌，是抗皮膚衰老的關(guān)鍵[9]。CO2激光是早期剝除式的嫩膚美容技術(shù)，雖然能夠有效促進真皮及表皮的再生，但術(shù)后易出現(xiàn)瘢痕等并發(fā)癥[10]。而非剝除式激光嫩膚技術(shù)出現(xiàn)，正好彌補了這一缺陷，在阻止真皮層受損的同時，還能達到促進膠原再生的目的，且術(shù)后并發(fā)癥少，已被廣泛應(yīng)用于皮膚美容中[11]。目前常用的非剝除式嫩膚的光源有ND：YAG及脈沖染料激光等，其作用的理論基礎(chǔ)為國外學者提出的光熱解理論[12]。國內(nèi)外多項研究也已經(jīng)證實非剝除式嫩膚具有治療色素沉著、延緩皮膚衰老等作用[13-15]。但關(guān)于不同激光技術(shù)對于成纖維細胞中膠原蛋白影響的研究還較少。因此，本研究分別選用了3種不同波長的激光照射成纖維細胞，分析討論其中膠原mRNA的變化。

國內(nèi)Dang[16]研究報道稱：595nm激光治療可使膠原纖維含量增加，尤其是Ⅰ型前膠原。本研究結(jié)果也顯示：與對照組相比，595nm I型前膠原mRNA明顯增加（P<0.05），但595nm與對照組間的Ⅲ型前膠原mRNA表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示：595nm激光可促進I型膠原的合成，而對Ⅲ型膠原的的影響則較小。原因可能為：該類脈沖染料激光可以穿透真皮，被血管中的血色素吸收，促進細胞因子的釋放，并激活成纖維細胞，合成新的膠原蛋白。國內(nèi)Dang等[17]對昆明小鼠的研究表明：1 064nm激光照射組小鼠皮膚中膠原蛋白較595nm激光照射組明顯增加。本研究結(jié)果也證實1 064nm的I型和Ⅲ型前膠原mRNA表達均高于595nm組、755nm組及對照組。而劉華緒[18]對昆明小鼠的的研究也證實了：1 064nm激光照射下，非磨削膠原重組效果優(yōu)于595nm組。提示：激光刺激下，成纖維細胞的膠原含量均有所增加，且波長越長，誘導合的膠原也隨之增多。國內(nèi)研究[19-20]中多采用755nm翠綠寶石激光進行脫毛或治療的色素性皮膚病。而關(guān)于其對膠原影響的研究較少。本研究結(jié)果顯示：與對照組及595nm組相比，755nm組的Ⅲ型前膠原mRNA表達明顯上調(diào)，但其與595nm組I型膠原蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；提示：755nm翠綠寶石激光也能刺激成纖維細胞合成膠原蛋白，尤其是Ⅲ型前膠原。

綜上所述，3種激光均能誘導成纖維細胞合成分泌更多的Ⅰ、Ⅲ型前膠原，且1 064nm激光促進膠原合成的效果最好，但本研究尚存在不足指出，如研究范圍較小，未分析激光使用周期、炎癥反應(yīng)等因素的影響等，需進一步行大樣本研究。

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[收稿日期]2018-06-25 [修回日期]2018-08-15

編輯/朱婉蓉