許文豪 周婉 臧敦安 鞏雪潔 劉慶華 于孟飛 薛璐 彭勇波

摘要：以小鼠S100A9基因為例，設計針對該基因的sgRNA，體外轉(zhuǎn)錄后與Cas9 mRNA通過顯微注射入受精卵，選取囊胚期的胚胎，單枚獨立進行基因型分析，并綜合得出編輯效率。結(jié)果表明，顯微注射113枚受精卵，其中28枚成功發(fā)育到囊胚期，其中有5枚囊胚在特定位點產(chǎn)生了基因突變，總編輯效率為18%。該方法操作簡單，可快速對sgRNA活性進行體內(nèi)驗證，并為后續(xù)基因編輯小鼠的制備提供基礎。

關鍵詞：CRISPR/Cas9;小鼠;sgRNA有效性;囊胚

中圖分類號：Q78? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）24-0156-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.042? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The mouse gene，S100A9 was used as an example to illustrate the expected sgRNA design. After in vitro transcription and Cas9 mRNA were injected into the fertilized egg by micro-injection，the embryos in the blastocyst stage were selected，and then performed with genotype identification. The results showed that a total of 113 fertilized eggs were microinjected，of which 28 successfully developed into the blastocyst stage，and five blastocysts produced effective genetic mutations at specific sites. The editing efficiency was 18%. This method is simple to operate，can rapidly verify the sgRNA activity in vivo，and provides a basis for the preparation of subsequent genetically edited mice.

Key words： CRISPR/Cas9; mouse; sgRNA validity; blastosphere

2013年，美國科學家Zhang等首次證明了Cas9核酸酶可以對小鼠和人類細胞DNA進行有效的編輯[1]。CRISPR/Cas9被整合為基因編輯工具后，由于在特異性識別基因組上的目標位點和在目標位點對DNA雙鏈進行切割誘發(fā)DNA損傷修復機制這兩方面表現(xiàn)出了較強的功能，該系統(tǒng)在包括果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠和人類等在內(nèi)的各物種的基因組編輯中得到廣泛運用[2]。經(jīng)過改造后的CRISPR/Cas9將原本獨立的crRNA及tracrRNA[3]融合為一條單鏈引導RNA（single-stranded guide RNA，sgRNA）[4]使其更加易于使用。

依靠CRISPR/Cas9技術和胚胎顯微注射技術，研究人員可以高效地構建基因敲除、定點敲入及敲減的動物模型，為研究基因功能、藥物開發(fā)和發(fā)病機制研究提供新的材料和策略。但CRISPR/Cas9系統(tǒng)中設計的sgRNA是否具有特異性的胚胎內(nèi)源引導活性，是成功進行基因編輯中至關重要的環(huán)節(jié)。現(xiàn)階段sgRNA的篩選主要有通過sgRNA與Cas9蛋白進行體外酶切驗證[5]和利用敲除載體進行細胞系水平驗證2種方式[6]。上述2種sgRNA活性驗證方式都存在一定的弊端，如前者為體外酶切試驗，無法真實反映該sgRNA在細胞內(nèi)的引導活性;后者由于細胞系選擇不同，導致結(jié)果存在誤差，且制備過程繁瑣，耗時耗力?；谀壳坝嘘PCRISPR/Cas9系統(tǒng)中sgRNA有效性驗證存在的不足，本研究以小鼠S100A9基因為例，建立了基于體外培養(yǎng)顯微注射后的胚胎[7]和對囊胚時期單胚胎進行基因型分析，從而對sgRNA有效性進行驗證。

1? 材料與方法

1.1? 材料

SPF級4周齡C57BL/6小鼠，SCXK（鄂）2017-0018。

lentiCRISPR V2載體（Addgene公司）、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（百奧邁科生物技術有限公司）、KSOM培養(yǎng)基（Sigma公司）、PCR引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? sgRNA設計與合成? 根據(jù)GenBank中的鼠源S100A9基因（NM_001281852）包含3個外顯子，將選擇后的外顯子片段在麻省理工學院的CRISPR Design軟件（http：//CRISPR.mit.edu/）中進行sgRNA設計。根據(jù)得分高低順序依此選擇6條候選sgRNA進行后續(xù)試驗。表1加粗部分為質(zhì)粒載體骨架序列，gRNA-RP為載體通用下游引物。

1.2.2? 體外轉(zhuǎn)錄? 以lentiCRISPR v2（Plasmid #52961）為模板，PCR擴增上述6條sgRNA，純化后溶于Nuclease-FreeWater，-20 ℃保存。純化后的DNA片段通過T7 RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后為單一條帶，且A260 nm/A280 nm>1.9，A260 nm/A230 nm>2.3。

1.2.3? Cas9 mRNA/sgRNA 顯微注射? 選取4周齡C57BL/6雌性小鼠提前進行PMSG（10 IU/只）及HCG（10 IU/只）人工超數(shù)排卵，并在HCG注射當日與性成熟的雄性C57BL/6小鼠進行合籠，次日取見栓雌鼠解剖。在顯微鏡下，用針頭將輸卵管壺腹部刺破，將富集有受精卵的云霧團劃出，移至含有0.1%透明質(zhì)酸M2溶液中消化。將明顯破損或異常的受精卵進行剔除，完成后待顯微注射用。

將6條sgRNA提前混合，隨后與Cas9 RNA按照終濃度10、100 ng/μL再次混勻。選取狀態(tài)良好的受精卵進行顯微注射，調(diào)整合適注射壓保證外源物質(zhì)順利進入胞內(nèi)，且不使其發(fā)生破裂和融解為宜。

1.2.4? 胚胎體外培養(yǎng)? 注射完成后的受精卵轉(zhuǎn)移至KSOM培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)，直至胚胎囊胚期。囊胚期是現(xiàn)階段人工體外培養(yǎng)胚胎能達到的最后階段，在該階段Cas9的切割作用也已基本完成。按單枚胚胎每管收集正常發(fā)育中的囊胚期的胚胎，用于后續(xù)基因型分析和對sgRNA內(nèi)源活性進行鑒定。

1.2.5? 囊胚總DNA提取及基因型鑒定? 按表2中所示比例配置裂解液，并將單枚囊胚置于其中?；旌暇鶆蚝笤?5 ℃下裂解20 min，隨后95 ℃作用5 min。此時囊胚中的基因組DNA已經(jīng)充分釋放，可進行后續(xù)驗證試驗。

根據(jù)sgRNA位點，設計了如下檢測引物F（5′-3′）CTCCATTATGTAGCACCCTA，R（5′-3′）TCACCA

TCCTCCCAACTC進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物進行測序鑒定，并分析sgRNA內(nèi)源活性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 受精卵顯微注射及體外培養(yǎng)

經(jīng)過顯微注射后的受精卵，在KSOM溶液中培養(yǎng)至胚胎3.5 d。顯微注射113枚受精卵，其中28枚受精卵成功發(fā)育到囊胚期。在培養(yǎng)的過程中會出現(xiàn)一定比例的受精卵死亡，一部分原因是注射過程中機械損傷，另外部分原因是2-細胞阻滯（2-cell block）[8]，體外培養(yǎng)的受精卵會由于無法順利的度過2細胞期而停止發(fā)育，從而無法成功獲得囊胚期細胞。

受精卵發(fā)育過程中，其胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)會增多，與此同時，sgRNA和Cas9復合體在核內(nèi)對基因組進行切割，可以提取囊胚基因組DNA進行檢測，分析sgRNA是否具有內(nèi)源引導活性。

2.2? 靶位點所在區(qū)域的片段擴增與鑒定

在成功進行顯微注射和體外培養(yǎng)后，獲得了28枚囊胚，通過裂解后，取1 μL DNA為模板，利用特異性的檢測引物對目的片段進行PCR擴增，1.5%凝膠電泳鑒定（圖2）。野生型片段為556 bp，若小于或大于該片段就可能發(fā)生了基因的缺失或插入。5號囊胚基因組發(fā)生編輯，缺失135 bp;7號囊胚呈現(xiàn)2條目的條帶，一條為野生型片段，另外一個等位基因共缺失171 bp;9號囊胚基因組缺失51 bp;16號囊胚基因組缺失54 bp;20號囊胚基因組缺失3 bp。19號囊胚與7號囊胚呈現(xiàn)相似的2條目的條帶，但是由于測序失敗，未能收集到基因組變換情況。

將PCR擴增得到的片段，進行測序分析，測序峰圖及基因編輯情況見圖3。

經(jīng)過測序分析，鑒定的28枚囊胚中出現(xiàn)了5枚囊胚的突變，分別缺失了11 bp至171 bp不等，總切割比例為18%，突變區(qū)域與設計位點吻合。

囊胚鑒定可替代常見的引物體外活性檢測，因為囊胚期受精卵基因組近乎等同于F0代小鼠基因組，而體外活性檢測利用體外的酶切反應無法最真實地模擬胞內(nèi)環(huán)境。直接選取囊胚進行鑒定，也節(jié)約了大量等待小鼠孕期及F0代小鼠生長的時間，加快了整個試驗進度，提高了試驗的準確性。

囊胚鑒定中，檢測引物的擴增效率需要通過預試驗進行提前驗證，避免擴增檢測片段時因為引物自身的擴增效率過低而導致囊胚基因組DNA的浪費和流失。

3? 小結(jié)與討論

傳統(tǒng)的基因敲除小鼠模型是利用同源重組技術，在ES細胞中針對特定的DNA序列進行編輯，由于重組效率低、耗時長，得到的小鼠需要多代回交等原因，大大限制了基因敲除小鼠構建的速度。

2013年Rudolf通過共同注射Cas9 mRNA和 sgRNA到小鼠受精卵中，實現(xiàn)了CRISPR/Cas9技術首次被用于多細胞生物的多基因敲除[9]。利用CRISPR/Cas9技術進行基因敲除小鼠構建時，只需設計20 bp的gRNA與靶序列DNA互補[9]，Cas9蛋白通過識別靶序列末端的PAM區(qū)[10]，即可進行DNA雙鏈的切割。然而在靶基因上往往存在多個可設計和識別的gRNA位點，但是每個gRNA介導的Cas9對DNA切割效率并不一致。由于受體材料為離體胚胎，體外操作具有很高的死亡率，所以提前對gRNA進行活性驗證對于利用CRISPR/Cas9技術構建基因編輯小鼠是非常必要的。

本研究利用一種新的sgRNA驗證手段，選取顯微注射后，囊胚期的細胞進行特定靶點驗證，并得出綜合編輯效率。該方法可以對靶位點活性進行驗證，還可以對上游制備的mRNA質(zhì)量進行驗證，不僅適用于小鼠全基因組編輯時sgRNA活性篩選，也適用于基于CRISPR/Cas9技術的條件下敲除和敲入基因的提前驗證。

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