龔波 金秀娥 李菁菁 吳曉翠 王峻

摘要：建立了快速測(cè)定蜂蜜中金剛烷胺和金剛乙胺藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品用1%甲酸乙腈提取，濃縮后利用超高效液相色譜分離，以乙腈和0.1%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，MRM反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。結(jié)果表明，在0.1～100 μg/L的系列濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999。金剛烷胺檢測(cè)限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，金剛乙胺檢測(cè)限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。在1～20 μg/kg濃度范圍內(nèi)平均回收率為80%～110%，精密度小于20%。該方法方便快捷、定性準(zhǔn)確，適用于蜂蜜中金剛烷胺、金剛乙胺藥物殘留檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：蜂蜜;金剛烷胺;金剛乙胺;殘留;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）

中圖分類號(hào)：S859.84? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）24-0136-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.037? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： A UPLC-MS/MS method was developed and established to raplidly determine amantadine and rimantadine in honey. The sample were extracted with acetonitrile with 1% formic acid. After enrichment，the sample was separated by UPLC，eluted with acetonitrile and 0.1% formic acid as the mobile phase and the MRM reaction was monitored. The results showed that there was a good linearity in the range of 0.1～100 μg/L， and the correlation coefficient were more than 0.999. The detection limit of the amantadine was 0.2 μg/kg， and the limit of quantification was 0.5 μg/kg;the detection limit of the rimantadine was 0.5 μg/kg， and the limit of quantification was 1.0 μg/kg. The average recoveries were 75%～110% in the range from 1～20 μg/kg，and the precision was less than 20%. The method was convenient， rapid， accurate and it was suitable for the detection of amantadine and rimantadine in honey.

Key words： honey; amantadine; rimantadine; residues; UPLC-MS/MS

蜂蜜是一種被廣泛認(rèn)知的天然營養(yǎng)食品，富含果糖、葡萄糖、酶、蛋白質(zhì)、維生素及多種礦物質(zhì)，具有滋養(yǎng)、潤(rùn)燥、解毒等功效，是中醫(yī)常用的中藥材之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，蜂蜜對(duì)肝臟、心臟、高血壓以及胃腸道方面的疾病都有治療和預(yù)防的作用[1]。因此，蜂蜜作為藥食同源的營養(yǎng)品，被人們廣泛應(yīng)用。但在蜂養(yǎng)殖業(yè)中，蜂農(nóng)為了防止蜂病發(fā)生而造成損失，往往會(huì)給蜜蜂飼喂抗生素等藥物，導(dǎo)致蜂蜜中藥物殘留的情況愈發(fā)嚴(yán)重。2017年，在對(duì)湖北部分地區(qū)的蜂農(nóng)走訪調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，有蜂農(nóng)給蜂群飼喂含金剛烷胺、金剛乙胺等成分的藥物時(shí)有發(fā)生。

金剛烷胺（Amantadine，ATD）是飽和三環(huán)癸胺的氨基衍生物，是首個(gè)被FDA批準(zhǔn)的抗流感病毒藥物。金剛乙胺是將金剛烷胺的氨基用乙胺基代替得到的藥物，該藥物作為抗病毒藥于1993年被美國批準(zhǔn)用于A型流感病毒的預(yù)防和治療作用[2]。但該類藥物作用于動(dòng)物疾病并沒有相關(guān)數(shù)據(jù)支持和科學(xué)根據(jù)。2005年12月，中國農(nóng)業(yè)部發(fā)布《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，規(guī)定列入《獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》（農(nóng)業(yè)部公告第560號(hào)）的金剛烷胺、金剛乙胺等及其鹽、酯的單、復(fù)方制劑停止生產(chǎn)、經(jīng)營、使用[3]。目前，金剛烷胺、金剛乙胺等抗病毒藥物殘留檢測(cè)方法的報(bào)道主要集中在血漿和尿液等生物體液、畜禽產(chǎn)品、飼料以及獸藥中的非法添加領(lǐng)域[4-6]，王彩娟等[7]研究了蜂蜜中嗎啉胍藥物殘留檢測(cè)，而蜂蜜中金剛烷胺、金剛乙胺等抗病毒藥物殘留檢測(cè)方法研究目前仍是空缺。本研究以蜂蜜為基質(zhì)，研究了金剛烷胺、金剛乙胺兩種抗病毒藥物殘留檢測(cè)方法，前處理快速簡(jiǎn)單，靈敏度高，為該藥物的殘留情況進(jìn)行檢測(cè)和排查提供了科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 儀器與試劑

島津8050液相質(zhì)譜串聯(lián)儀;冷凍高速離心機(jī);AE260電子天平，Mettler Toledo公司;渦旋混合器;振蕩器;氮吹儀。金剛烷胺（Amantadine，ATD）、金剛乙胺（rimantadine，RTD）與金剛烷胺內(nèi)標(biāo)D6均來自于ChromaDex公司;甲醇、乙腈（色譜純，Tedi）;甲酸（色譜純，J.T.Baker，88%）;去離子水（Milli-Q，電阻率18.2 MΩ·cm）;高純氮、高純氬（純度均為99.999%）。

1.2? 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密稱取金剛烷胺、金剛乙胺對(duì)照品約10 mg置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：精密稱取金剛烷胺內(nèi)標(biāo)D6對(duì)照品約10 mg置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

內(nèi)標(biāo)中間液：量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液100 μL置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)中間液。

1.3? 樣品處理

稱取蜂蜜2±0.02 g，置于50 mL塑料離心管內(nèi)，加適量金剛烷胺內(nèi)標(biāo)溶液，加1%甲酸乙腈6 mL，渦旋1 min后加入2 g無水硫酸鈉，渦旋振勻，振蕩提取10 min。10 000 r/min離心5 min，取上層清液50 ℃氮?dú)獯蹈?。加入乙?0.1%甲酸溶液（1∶9）1.0 mL充分渦旋溶解，過0.2 μm濾膜后上機(jī)待測(cè)。

2? UPLC-MS/MS條件

2.1? 超高效液相色譜條件

色譜柱：Xbridge C18（5 μm，2.1 mm×150 mm）;流動(dòng)相：A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈，梯度洗脫：0～2.0 min，10%B，2.0～5.0 min，10%B～90%B，6.0～6.1 min，90%B～10%B，6.1～8.0 min，10%B流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫35 ℃。

2.2? 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源ESI（+）;接口溫度（Interface temperature）350 ℃;DL溫度（DL temperature）250 ℃;加熱塊溫度（heatblock temperature）400 ℃;霧化氣流速：3.0 L/min;干燥氣流速：10.0 L/min;加熱氣流速：10.0 L/min;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM采集模式）。各種藥物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3? 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限

精密量取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)溶液，用乙腈-0.1%甲酸溶液（1∶9）分別配成濃0.1、0.5、2、10、20、100 μg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配。每個(gè)濃度重復(fù)3次測(cè)定。以分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比（Y）和分析物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度之比（X）作線性回歸分析，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（表2）。結(jié)果表明，金剛烷胺、金剛乙胺質(zhì)量濃度在0.1～100 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。采用基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物的方法，經(jīng)試驗(yàn)得到特征離子色譜峰信噪比，信噪比≥3的最低濃度即方法的檢出限（LOD），信噪比≥10的最低濃度為即方法的定量限（LOQ），其結(jié)果見表2?？瞻谆|(zhì)中添加各藥物后得到的特征離子質(zhì)量色譜如圖1、圖2所示。

2.4? 回收率和精密度

選取空白的蜂蜜樣品作為添加回收試驗(yàn)基質(zhì)，分別進(jìn)行1、5、20 μg/kg 3個(gè)不同濃度的加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)濃度做6組平行，重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果見表3。在不同加標(biāo)濃度下，金剛烷胺、金剛乙胺的回收率為80.1%～109.7%，批內(nèi)RSD≤10%，批間RSD≤10%，能滿足目標(biāo)藥物殘留的檢測(cè)要求。

3? 小結(jié)與討論

3.1? 前處理?xiàng)l件的選擇

為了取得更好的萃取效果，比較了乙腈和甲醇2種提取液，發(fā)現(xiàn)用乙腈提取的目標(biāo)物回收率要高于用甲醇提取的回收率。金剛烷胺和金剛乙胺結(jié)構(gòu)中都含有氨基，并且極性較強(qiáng)，采用含酸的有機(jī)溶劑更有利于提取[8]，因此采用1%甲酸乙腈作為提取液。

比較了MCX固相萃取法、分散固相萃取法以及直接提取法，發(fā)現(xiàn)使用MCX固相萃取法、分散固相萃取法時(shí)，2種目標(biāo)物均有較好的提取凈化效果;1%甲酸乙腈直接提取法雖然在氮吹濃縮的同時(shí)增加了基質(zhì)效應(yīng)，但加入內(nèi)標(biāo)校正后，基質(zhì)效應(yīng)消除，定性、定量分析均能滿足試驗(yàn)要求。相比其他2種萃取法，直接提取法更經(jīng)濟(jì)并且簡(jiǎn)單快捷，故本研究采用直接提取法，并加入內(nèi)標(biāo)校正。

3.2? 質(zhì)譜及色譜條件優(yōu)化

金剛烷胺和金剛乙胺結(jié)構(gòu)中均含有-NH2，易形成〔M+H〕+的準(zhǔn)分子離子，適合在ESI+模式下掃描，優(yōu)化后確定目標(biāo)物的離子對(duì)、碰撞能力以及霧化氣壓力、干燥器溫度等質(zhì)譜分析參數(shù)。

采用了乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-2 mmol/L乙酸銨溶液等幾種不同的流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相中含有乙酸銨時(shí)對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)有抑制作用，乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物峰型較差。當(dāng)乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，兩種化合物的峰型和響應(yīng)都能滿足要求。

3.3? 基質(zhì)效應(yīng)

通過以甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和用陰性基質(zhì)液配制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種藥物均存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。為了減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)化合物定量的影響，可以加入內(nèi)標(biāo)同位素來定量計(jì)算。當(dāng)基質(zhì)曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比在85%～115%之間不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，而經(jīng)過內(nèi)標(biāo)校正后的基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲邊斜率之商符合要求，因此采用內(nèi)標(biāo)校正，用甲醇直接配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.4? 小結(jié)

通過對(duì)樣品前處理?xiàng)l件和質(zhì)譜、色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了蜂蜜中金剛烷胺、金剛乙胺殘留檢測(cè)的UPLC-MS/MS分析方法。該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本較低，準(zhǔn)確度和靈敏度均能滿足獸藥殘留分析要，可用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

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