饒犇 周榮華 閔勇 廖先清 劉芳 陳偉 龍同 張光陽(yáng)

摘要：為了得到里氏木霉（Trichoder mareesei）發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基，應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法對(duì)影響里氏菌絲體產(chǎn)量的關(guān)鍵因子進(jìn)行了篩選，并進(jìn)一步采用響應(yīng)面分析法對(duì)影響菌絲產(chǎn)量的關(guān)鍵因素最佳水平進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，影響里氏木霉菌絲體產(chǎn)量的關(guān)鍵因素為魚(yú)蛋白胨和甘油的濃度。通過(guò)響應(yīng)面分析法的擬合和推算，得到在魚(yú)蛋白胨和甘油濃度分別為1.414 3和2.439 3 g/100 mL時(shí)模型預(yù)測(cè)發(fā)酵最佳產(chǎn)量為85 g/100 mL，驗(yàn)證值為81 g/100 mL，預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證值吻合較好，約是原始培養(yǎng)基產(chǎn)量（60 g/100 mL）的1.35倍。

關(guān)鍵詞：里氏木霉（Trichoder mareesei）;Plackett-Burman設(shè)計(jì)法;響應(yīng)面分析法

中圖分類(lèi)號(hào)：Q813.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）24-0081-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.24.022? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： In order to obtain the optimal medium composition for Trichoder mareesei production， the Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of variables， and the optimum levels of key factors affecting mycelium yield were conducted by response surface analysis methodology. The results showed that， the optimal values of the two parameters determined by response surface analysis methodology were fish peptone 1.414 3 g/100 mL and glycerol 2.439 3 g/100 mL. At this point，the model predicted optimal fermentation yield was 85 g/100 mL， and the verified value was 81 g/100 mL，and they were in agreement and it was about 1.35 times the yield of the original medium （60 g/100 mL）.

Key words： Trichoder mareesei; Plackett-Burman design; response surface analysis methodology

絲狀真菌里氏木霉（Trichoder mareesei）是多細(xì)胞的真核微生物，紅褐肉座菌（Hypocrea jecorina）的無(wú)性型，隸屬于叢梗孢目（Moniliales）木霉屬（Penicillium）。其作為工業(yè)菌株用于生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類(lèi)，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年歷史。研究高產(chǎn)里氏木霉的液體發(fā)酵條件尤為重要。

本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法對(duì)里氏木霉發(fā)酵的關(guān)鍵因素進(jìn)行了優(yōu)化。從Plackett-Burman試驗(yàn)可以得知，魚(yú)蛋白胨和葡萄糖對(duì)里氏木霉的菌絲產(chǎn)量影響顯著，所以利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)以這兩個(gè)因素為自變量，以里氏木霉菌絲量為響應(yīng)值，通過(guò)Minitab 15軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，建立多元二次回歸方程，利用方差分析模型和各因子的顯著性獲得里氏木霉液體發(fā)酵工藝的最佳參數(shù)，以期為里氏木霉制劑的開(kāi)發(fā)提供參考[1-6]。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1）菌株。里氏木霉是湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心生物技術(shù)研究室分離保存，能夠拮抗多種植物病害，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

2）培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，2%瓊脂;種子培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖0.5 g/100 mL、豆粕0.2 g/100 mL、魚(yú)蛋白胨1.0 g/100 mL、甘油0.5 g/100 mL、玉米漿1.0 g/100 mL;后期采用優(yōu)化后的配方。

1.2? 方法

1）發(fā)酵培養(yǎng)條件。接種體積分?jǐn)?shù)5%，發(fā)酵溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵96 h。

2）Plackett-Burman試驗(yàn)。采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，篩選影響棘孢木霉生物量的重要因素，確定最佳配方。設(shè)計(jì)水平和排列方式見(jiàn)表1。

3）最陡爬坡試驗(yàn)。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定因素取值中心點(diǎn)。擬合方程中各變量系數(shù)確定爬坡方向和變化步長(zhǎng)，另外步長(zhǎng)確定亦與試驗(yàn)條件相關(guān)。

4）中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析。對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得到中心點(diǎn)，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理安排響應(yīng)面試驗(yàn)獲得重要因素的最佳配方水平。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果來(lái)擬合數(shù)據(jù)，得到描述響應(yīng)值和自變量之間關(guān)系的二階模型，即：

其中，Y是產(chǎn)物能力測(cè)量值，b0是截距，bi是關(guān)鍵因素線(xiàn)性效果的系數(shù)，bii是關(guān)鍵因素的二次效應(yīng)的系數(shù)，bij是關(guān)鍵因素間交互作用的系數(shù)。

根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型以及方差分析的結(jié)果評(píng)價(jià)每個(gè)因子及其交互作用對(duì)過(guò)程的影響程度，利用響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖直觀(guān)地描繪其結(jié)果，同時(shí)利用擬合的數(shù)學(xué)方程求解最優(yōu)結(jié)果。

5）培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)。用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的菌絲重量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)前期研究結(jié)果，確定以葡萄糖和甘油為碳源，以魚(yú)蛋白胨、玉米漿和豆粕為氮源，共5種因素（X1：葡萄糖;X2：豆粕;X3：魚(yú)蛋白胨;X4：甘油;X5：玉米漿）一起進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由T檢驗(yàn)結(jié)果可知，魚(yú)蛋白胨和甘油對(duì)里氏木霉的菌絲生長(zhǎng)具有顯著影響，可信度在95%以上。且兩者對(duì)里氏木霉的菌絲生長(zhǎng)影響是負(fù)效應(yīng)。

由上述Plackett-Burman試驗(yàn)得到的回歸方程如下：

Y=49+0.042X1+2.11X2+5.6X3+5.8X4+0.46X5，方程擬合的相關(guān)性為R2=0.953 4，表明此多項(xiàng)式方程很好地模擬和解釋了Plackett-Burman的試驗(yàn)結(jié)果。

2.2? 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

找到對(duì)產(chǎn)物發(fā)酵影響最大的因素后，需要進(jìn)一步對(duì)這些因素進(jìn)行分析。最速上升法以前述Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的一次方程為基礎(chǔ)，以相應(yīng)因素的系數(shù)比為基準(zhǔn)進(jìn)行步移，直到步移至最高點(diǎn)，然后以最高點(diǎn)附近的范圍作為響應(yīng)面優(yōu)化的相應(yīng)范圍。從Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到方程中魚(yú)蛋白胨和甘油的系數(shù)（X1∶5.6;X2∶5.8），可以得到這兩個(gè)因素步移的步長(zhǎng)比為1∶1，即當(dāng)魚(yú)蛋白胨步移1個(gè)單位（0.2 g/L）時(shí)，甘油也步移1個(gè)單位（0.2 g/L）。以Plackett-Burman設(shè)計(jì)中的中心點(diǎn)作為步移的起點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，里氏木霉菌絲體的產(chǎn)量在步移進(jìn)行至第三步時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，之后里氏木霉菌絲體產(chǎn)量開(kāi)始下降。步移最高點(diǎn)時(shí)魚(yú)蛋白胨和甘油的濃度分別為1.00和1.26 g/L，這一點(diǎn)被用作下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

2.3? 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上兩水平Plackett-Burman試驗(yàn)可知，影響里氏木霉生物量的兩個(gè)重要因素分別是魚(yú)蛋白胨和甘油。根據(jù)中心優(yōu)化組合方法，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，共13組試驗(yàn)。

以魚(yú)蛋白胨和甘油為自變量，以里氏木霉的菌絲體濕重為響應(yīng)值，根據(jù)分析結(jié)果得到的二次多項(xiàng)式回歸方程為Y=84.98+0.583 4X1+3.555 5X2-5.971 2X12-9.071 3X22+1.975X1X2，Y為響應(yīng)值，X1為魚(yú)蛋白胨，X2為甘油。利用Minitab軟件響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行計(jì)算可得，最大值處X1=1.414 3 g/100 mL，X2=2.439 3 g/100 mL，在此條件下理論預(yù)測(cè)得到的值為85 g/100 mL。

2.4? 最佳培養(yǎng)基的驗(yàn)證

為了確定試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，共進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，里氏木霉的菌絲體產(chǎn)量為81 g/100 mL，與預(yù)測(cè)值十分接近。

3? 小結(jié)

對(duì)里氏木霉生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究，得到最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖2 g/100 mL、豆粕1 g/100 mL、魚(yú)蛋白胨1.414 3、甘油2.439 3、玉米漿1 g/100 mL。在此條件下，里氏木霉的菌絲體理論最高產(chǎn)量為85 g/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)中最高值為81 g/100 mL，與理論預(yù)測(cè)值相符，約是優(yōu)化前實(shí)際產(chǎn)量（60 g/100 mL）的1.35倍。

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