古麗玲 王 連 羅昌祿 付 鈺 陶 陶

(貴州省人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

在腦血管疾病中，缺血性腦血管病占60%～80%〔1〕。研究顯示，有相當(dāng)部分患者腦缺血后血管能自然再通或溶栓治療再通，但是腦缺血再灌注損傷(CIRI)可導(dǎo)致缺血組織發(fā)生較血供恢復(fù)前更為嚴(yán)重的損傷，嚴(yán)重影響患者預(yù)后〔2〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡途徑，在腦缺血再灌注損傷中具有重要作用，是誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡的重要途徑之一〔3〕。本研究通過(guò)建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及ERS相關(guān)信號(hào)分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78、C/EBP同源蛋白(CHOP)和Tribbles相關(guān)蛋白(TRB)3的表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)SD大鼠100只，體重180～220 g，購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組25只。

1.2主要試劑 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)；全蛋白提取試劑盒、Western一抗及二抗稀釋液，碧云天生物技術(shù)研究所；GRP78多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；TRB3一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；CHOPⅠ抗和β-actin一抗(Santa Cruz公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；其他試劑均為分析純國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3主要儀器 超凈工作臺(tái)(AIRTECH，蘇州凈化設(shè)備有限公司)，精密電子天平(Adventurer 公司，美國(guó))，紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)，酶標(biāo)儀(上海安亭科學(xué)儀器廠)，RT-PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，雙垂直蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.4動(dòng)物模型的構(gòu)建 參考文獻(xiàn)〔4〕，采用改良Longa線栓法制作大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型。手術(shù)前12 h禁食不禁水，麻醉(10%水合氯醛)，大鼠取仰臥位，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈及其分支頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在分支頸外動(dòng)脈剪一小口經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉部將魚線插入頸內(nèi)動(dòng)脈至顱內(nèi)，插入深度為17～18 mm，扎緊備線，完全阻斷血供。30 min后輕輕提拉所留線頭，使血流再通，將栓線尾部埋在皮下。術(shù)后縫合皮膚，再灌注3 d后用同樣方法進(jìn)行缺血及再灌注。假手術(shù)組除不插魚線外，其余步驟同模型組。對(duì)照組不做任何處理。模型成功的標(biāo)志為大鼠麻醉藥醒后出現(xiàn)右眼Horner征和左側(cè)以前肢為重的偏癱。

1.5運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 實(shí)驗(yàn)組大鼠造模成功后24 h開始進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，12 m/min，每天10 min，對(duì)照組、假手術(shù)組和手術(shù)組大鼠不做任何訓(xùn)練。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1TUNEL檢測(cè) 造模后1、3、7、14、28 d，分別取每組5只大鼠，麻醉后處死，斷頭取腦，腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜，石蠟包埋，冰凍切片采用TUNEL進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，嚴(yán)格按TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。顯微鏡下紅色熒光為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選取6個(gè)不重復(fù)高倍視野(×200)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6.2RT-PCR檢測(cè)腦組織GRP78、CHOP和TRB3 mRNA表達(dá)水平 造模后1、3、7、14、28 d，分別取每組5只大鼠，麻醉后處死，斷頭取腦，Trizol法分別提取各組大鼠總RNA。總RNA采用純化柱純化。逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，引物設(shè)計(jì)：β-actin(239 bp)上游引物：5′-GGAAGCTTGTCATCAATGG-3′，下游引物：5′-CTGTGGTCATGAGTCCTTC-3′；GRP78(499 bp)上游引物：5′-TGGAATCTTCACCTCAGAGTG-3′，下游引物：5′-ATATCCAAGGTGAACACACAC-3′；CHOP上游引物：5′-CCTCGCTCTCCAGATTCCA-3′，下游引物：5′-CTCATTCTCCTGCTCCTTCTCC-3′；TRB3上游引物：5′-TCAAGTTGCGTCGATTTGTCTTC-3′，下游引物：5′-CAGTCATCACACAGGCATCCTC-3′。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)GRP78、CHOP和TRB3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以β-actin作為內(nèi)參照,同一標(biāo)本的β-actin產(chǎn)物表達(dá)水平校正各自目的基因的表達(dá)水平，相對(duì)表達(dá)水平=目的基因表達(dá)水平/β-actin表達(dá)水平。

1.6.3Western印跡檢測(cè)腦組織GRP78、CHOP和TRB3蛋白表達(dá)水平 造模后1、3、7、14、28 d，分別取每組5只大鼠，麻醉后處死，斷頭取腦，切碎，用預(yù)冷的組織裂解液提取大鼠腦組織總蛋白，Bradford法測(cè)定樣品的蛋白含量，12%的凝膠分離蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))在100 V 1.5 h的條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后與稀釋的GRP78、CHOP和TRB3單克隆抗體(1∶1 000)過(guò)夜結(jié)合，洗模后加入稀釋的二抗，室溫孵育60 min，BeyoECL Plus顯色，凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)收集顯色條帶，運(yùn)用 Quantity One 軟件進(jìn)行蛋白條帶數(shù)據(jù)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行χ2、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 缺血再灌注后1、3、7、14、28 d，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于模型組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05圖1 造模后1～28 d內(nèi)各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

2.2GRP78、CHOP和TRB3 mRNA表達(dá)水平 缺血再灌注后1、3、7、14、28 d，實(shí)驗(yàn)組和模型組GRP78、CHOP和TRB3 mRNA表達(dá)水平均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。缺血再灌注后3、7、14、28 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織GRP78、CHOP和TRB3 mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 造模后1～28 d內(nèi)各組大鼠腦組織GRP78、CHOP和TRB3 mRNA表達(dá)水平

續(xù)表1 造模后1～28 d內(nèi)各組大鼠腦組織GRP78、CHOP和TRB3 mRNA表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與正常對(duì)照組比較：2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05；下表同

2.3GRP78、CHOP和TRB3 蛋白表達(dá)水平 缺血再灌注后1、3、7、14、28 d，實(shí)驗(yàn)組和模型組腦組織GRP78、CHOP和TRB3 蛋白表達(dá)水平均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。缺血再灌注后3、7、14、28 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織GRP78、CHOP和TRB3 蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 造模后1～28 d內(nèi)各組大鼠腦組織GRP78、CHOP和TRB3 蛋白表達(dá)水平

3 討 論

腦血管疾病多發(fā)于中老年人群，具有病情重、發(fā)病急、病程進(jìn)展迅速及致殘率、死亡率高等特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有500多萬(wàn)人死于腦血管疾病，已經(jīng)成為導(dǎo)致人類死亡的三大原因之一〔5〕。隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加快、生活條件及飲食具有顯著改善，導(dǎo)致腦血管疾病的發(fā)病率逐年上升，給我國(guó)醫(yī)療資源帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。腦血管疾病患者可表現(xiàn)為失語(yǔ)、偏癱、共濟(jì)失調(diào)，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)深度昏迷，如果得不到及時(shí)救治，會(huì)導(dǎo)致各種并發(fā)癥發(fā)生，甚至導(dǎo)致患者死亡〔6〕，尤其是缺血性腦血管病缺血后血流恢復(fù)導(dǎo)致的腦缺血再灌注損傷對(duì)患者危害更為嚴(yán)重。

本研究顯示，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。研究表明，適量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練有助于恢復(fù)腦損傷的運(yùn)動(dòng)功能，幫助重建非損傷區(qū)功能環(huán)路，加速建立腦側(cè)支循環(huán)，這主要是由于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可改善腦血流量，促進(jìn)多種神經(jīng)再生相關(guān)神經(jīng)生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，同時(shí)提高突觸素活性，促進(jìn)樹突和軸突形成新的突觸連接，提高神經(jīng)再生能力〔7〕。廖楊平等〔8〕報(bào)道稱，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練參與了中樞神經(jīng)再生調(diào)節(jié)過(guò)程，有助于建立腦側(cè)支循環(huán)，提高神經(jīng)再生能力，最終促進(jìn)中樞神經(jīng)功能恢復(fù)，與本研究結(jié)果一致。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是重要的細(xì)胞器之一，是蛋白質(zhì)的合成、加工和運(yùn)輸?shù)闹饕獔?chǎng)所，同時(shí)在類固醇激素合成和脂質(zhì)代謝過(guò)程中具有重要作用。在多種因素刺激下，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂，發(fā)生ERS〔9〕。長(zhǎng)期的ERS則啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。研究表明，細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注過(guò)程中扮有重要角色，而這一細(xì)胞凋亡過(guò)也被證實(shí)與ERS有關(guān)。GRP78是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，是ERS的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)上調(diào)可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白負(fù)荷，對(duì)腦細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用〔10〕。CHOP也是ERS經(jīng)典標(biāo)志物之一，其表達(dá)上調(diào)則激活細(xì)胞死亡途徑，可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡加重腦損傷〔11〕。TRB3蛋白是一種激酶類似蛋白，可與絲/蘇氨酸蛋白激酶AKT結(jié)合，從而參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，CHOP表達(dá)上調(diào)促進(jìn)TRB3基因的表達(dá)〔12〕。本研究表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能有助于下調(diào)腦組織GRP78、CHOP和TRB3表達(dá)水平，從而促進(jìn)腦缺血再灌注后神經(jīng)功能恢復(fù)。

1李錦程,武曉寧,趙海蘋,等.大腦中動(dòng)脈內(nèi)促紅細(xì)胞生成素或聯(lián)合tPA注射對(duì)大鼠腦缺血再灌注的作用及機(jī)制〔J〕.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015;36(5):699-704.

2Wu C,Liu R,Gao M,etal.Pinocembrin protects brain against ischemia/reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stress induced apoptosis〔J〕.Neurosc Lett,2013;546:57-62.

3閔鶴鳴,魯璐清,王文娟,等.GRP78、CHOP、caspase-3和caspase-9蛋白在缺血預(yù)處理大鼠腦組織中的表達(dá)及意義〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病,2012;29(8):703-6.

4趙 杰，陳懷龍，馬福國(guó)，等.淺低溫時(shí)腦缺血再灌注小鼠海馬蛋白激酶R樣內(nèi)皮網(wǎng)激酶活性的影響〔J〕.中華麻醉學(xué),2016;36(2):250-2.

5王 偉,孔 維,陳 萌,等.丁苯酞預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響〔J〕.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2013;26(2):122-4.

6毛森林,馬翊竑,張海東,等.芍藥苷預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細(xì)胞凋亡及 CHOP 蛋白表達(dá)的影響〔J〕.山東醫(yī)藥,2014;54(32):14-6.

7孫竹梅,趙雅寧,陳長(zhǎng)香,等.力竭運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)全腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū) GAP-43 與 Nogo-A 的影響〔J〕.中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志,2016;25(8):682-6.

8廖楊平,程道賓,蘇 麗,等.運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)修復(fù)及 GAP-43 和 Neurocan 表達(dá)的影響〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2011;28(4):303-6.

9黃 澈.原花青素對(duì)腦缺血再灌注后大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78,CHOP和Caspase-12表達(dá)的影響〔D〕.錦州：遼寧醫(yī)學(xué)院,2012.

10Gu LL,Yang Q,Tao T,etal.Role of GRP78,CHOP and TRB3 in cerebral ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2017;10(1):789-94.

11Ye Z,Wang N,Xia P,etal.Parecoxib suppresses CHOP and Foxo1 nuclear translocation,but increases GRP78 levels in a rat model of focal ischemia〔J〕.Neurochem Res,2013;38(4):686-93.

12Yu H,Zhang H,Zhao W,etal.Gypenoside protects against myocardial ischemia-reperfusion injury by inhibiting cardiomyocytes apoptosis via inhibition of CHOP pathway and activation of PI3K/Akt pathway in vivo and in vitro〔J〕.Cell Physiol Biochem,2016;39(1):123-36.