舒雄，杰永生，鄭蕊，陳磊，靳少鋒，綦惠，孫磊

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離心重力誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞分化

舒雄，杰永生，鄭蕊，陳磊，靳少鋒，綦惠，孫磊

100035 北京積水潭醫(yī)院/北京市創(chuàng)傷骨科研究所

探討離心重力對(duì)人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（hADSCs）向軟骨樣細(xì)胞分化以及對(duì) Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的影響。

通過(guò)加載不同離心力（0、500、1000、2000、2500、3000 ×）和持續(xù)時(shí)間（0、15、30、45、60 min）刺激脂肪干細(xì)胞分化為軟骨樣細(xì)胞，并利用熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測(cè) Sox 9 基因的上調(diào)表達(dá)來(lái)篩選條件，將培養(yǎng)的 P3代 hADSCs 分 3 組，對(duì)照組（不干預(yù)處理）、離心重力組和 TGF-β3 組（加入 TGF-β3 成軟骨誘導(dǎo)劑），持續(xù)培養(yǎng) 21 d 后，通過(guò)阿利辛藍(lán)和蘇木精-伊紅染色進(jìn)行軟骨分化鑒定，DMMB 法測(cè)定胞外基質(zhì)中 GAG 含量，熒光定量 PCR 測(cè)定 II 型膠原基因表達(dá)，Western blot 進(jìn)一步檢測(cè)對(duì)照組和離心重力組中 Sox 9、β-catenin、GSK3β 和 p-GSK3β 蛋白的表達(dá)。

加載最適的離心重力（2500 ×，30 min）刺激 hADSCs 后，培養(yǎng) 24 h，Sox 9 的 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。阿利辛藍(lán)和蘇木精-伊紅染色顯示，離心重力組和 TGF-β3 組中軟骨表達(dá)呈陽(yáng)性。GAG 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β3 組促 GAG 分泌的能力優(yōu)于離心重力組（< 0.05），熒光定量 PCR 結(jié)果表明 TGF-β3 組其 II 型膠原 mRNA 表達(dá)的能力高于離心重力組（< 0.05），Western blot 結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，離心重力組中 β-catenin 和 p-GSK3β 的蛋白表達(dá)水平降低，而 GSK3β 和 Sox 9 蛋白表達(dá)升高。

離心重力和 TGF-β3 誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化中的表達(dá)具有相似的能力，離心重力對(duì) hADSCs 誘導(dǎo)成軟骨作用與抑制 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。

人脂肪干細(xì)胞； 超重力； Sox 9 轉(zhuǎn)錄因子類； 軟骨分化

關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上的常見(jiàn)病。由于軟骨無(wú)血管和神經(jīng)供應(yīng)，僅靠關(guān)節(jié)液的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，一旦受損很難自行修復(fù)。目前對(duì)軟骨缺損的修復(fù)治療方法包括關(guān)節(jié)鏡下清理術(shù)、微骨折術(shù)、軟骨移植、軟骨細(xì)胞移植、組織工程技術(shù)修復(fù)等[1-2]。新興的組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為軟骨再生提供了新的思路。脂肪干細(xì)胞容易獲取，損傷小，不易凋亡，無(wú)年齡限制，分化能力強(qiáng)，目前被認(rèn)為在軟骨組織工程中是比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更為理想的種子細(xì)胞[3-4]。軟骨組織工程中種子細(xì)胞誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞一直是研究的熱點(diǎn)。眾所周知，機(jī)械應(yīng)力能誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化[5]，離心重力是一種主要由離心產(chǎn)生，易于使用和可控的機(jī)械應(yīng)力。通過(guò)離心誘導(dǎo)細(xì)胞基因表達(dá)，在肺上皮癌細(xì)胞中，離心法可上調(diào)白細(xì)胞介素-1β 的表達(dá)[6]。因此，作為一種機(jī)械應(yīng)力，離心重力可以誘導(dǎo)干細(xì)胞軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)。另外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（TGF-β）家族因具有良好的促干細(xì)胞成軟骨分化能力，常作為軟骨組織工程中的誘導(dǎo)因子，且 TGF-β3 相較于傳統(tǒng)的 TGF-β1，促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化能力更強(qiáng)[7]。本實(shí)驗(yàn)以人脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，在培養(yǎng)體系中加入 TGF-β3 細(xì)胞因子，比較離心重力和 TGF-β3 培養(yǎng)方式成軟骨效果的差異，探索離心重力誘導(dǎo)效果是否是更好的培養(yǎng)體系，為下一步臨床利用脂肪干細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 人脂肪組織來(lái)源于北京知音創(chuàng)美醫(yī)療美容門診部吸脂者，女性，抽吸部位為腹部，術(shù)后無(wú)菌保存。I 型膠原酶、胰酶、Trizol 試劑、高糖 DMEM、低糖 DMEM 和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；阿利辛藍(lán)染料、蘇木精-伊紅染料購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；地塞米松、ITS+ 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；TGF-β3 購(gòu)自Pepro tech 公司；cDNA Synthesis SuperMix 和UltraSYBR Mixture 購(gòu)自日本 Takara 公司；Sox 9、β-catenin 和 p-GSK3β 抗體購(gòu)自美國(guó) CST 公司；HRP-羊抗鼠 IgG 和 HRP-驢抗兔二抗購(gòu)自 Jackson 公司。

1.1.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Shellab 公司；往復(fù)式真空泵購(gòu)自上海益化真空設(shè)備有限公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus 公司；冷凍大容量離心機(jī)購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器有限公司；熒光定量 PCR 儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；Nanodrop ND-2000 分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs 的分離及培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取脂肪組織，將脂肪組織在 PBS 中清洗 3次，徹底去除紅細(xì)胞與組織碎片。按照本室之前報(bào)道分離脂肪干細(xì)胞步驟進(jìn)行[8]，調(diào)整細(xì)胞密度接種于含 10% FBS（10 ng/ml）和 1% 的青鏈霉素的低糖 DMEM 培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞達(dá)到 80% ~ 90% 融合，取 P3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞備用。

1.2.2 離心重力加載 將P3代 hADSCs 轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的 15 ml 離心管，設(shè)置不同的離心引力（0、500、1000、1500、2000、2500 和 3000 ×）和離心持續(xù)時(shí)間（0、15、30、45 和 60 min）。離心重力加載后，細(xì)胞混合不完全軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基接種至培養(yǎng)皿中，按照所需時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)。

1.2.3 誘導(dǎo)hADSCs 成軟骨細(xì)胞分化 將 P3代 hADSCs 以 5 × 105cells，300 ×離心 5 min，棄掉上清，加入 2 ml 不完全軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。其成分為：高糖 DMEM 加入 100 U/ml 青、鏈霉素、10% FBS、10 nmol/L 地塞米松、ITS+（含 6.25 μg/ml胰島素、6.25 μg/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25 μg/ml 亞硒酸、5.33 μg/ml 亞油酸、1.25 mg/ml BSA）。24 h 后細(xì)胞聚集成球，TGF-β3 組換用添加 10 ng/ml TGF-β3 的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組繼續(xù)不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔 2 天全量換液，按照所需時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)后，收獲細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)基因表達(dá) 利用Trizol法提取各組誘導(dǎo)細(xì)胞中總 RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，57 ℃、1 min，40 個(gè)循環(huán)，57 ℃延伸 1 min。檢測(cè)相關(guān)目的基因，以 GAPDH為內(nèi)參基因，各引物序列見(jiàn)表 1，采用 ΔΔCt 法計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 組織學(xué)染色 取各組的誘導(dǎo)細(xì)胞，PBS 洗 1 次，4% 多聚甲醛 4 ℃固定過(guò)夜，脫水后石蠟包埋，切片后染色，分別進(jìn)行阿利辛藍(lán)染色和蘇木精-伊紅染色，鏡下觀察。

1.2.6 糖胺多糖含量測(cè)定 各組留存的組織消化液 50 μl 加入 96 孔板，加入 200 μl 預(yù)先配置好的 DMMB 染色液。利用二甲基亞甲基藍(lán)（DMMB）比色法測(cè)定糖胺多糖的含量，實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù) GENEMD 糖胺多糖總含量二甲基亞甲基藍(lán)比色法定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組的細(xì)胞通過(guò) RIPA 裂解后，BCA 定量，經(jīng)SDS-PAGE 分離后，采用半干式電轉(zhuǎn)移法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到 PVDF 上。將膜放在 5% 的脫脂奶（溶于 PBS，pH 7.4）中，4 ℃封閉過(guò)夜，與 Sox 9、β-catenin、GSK3β 和 p-GSK3β 的一抗 37 ℃下孵育 1 h，PBS 清洗后與 HRP 標(biāo)記的驢抗兔 IgG 和 HRP-羊抗鼠 IgG（1:1000），常溫下孵育 1 h。TBST 洗膜 5 次后用 ECL 發(fā)光試劑盒顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 離心重力增加 hADSCs 中 Sox 9 基因的表達(dá)

Sox 9 基因是軟骨細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)，篩選的離心重力刺激 ADSCs 誘導(dǎo) Sox 9 基因表達(dá)上調(diào)。通過(guò)加載不同離心重力（0、1000、1500、2000、2500、3000 ×）15 min 刺激已成功分離純化和鑒定的 hADSCs，離心力刺激后的細(xì)胞，重新接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜置培養(yǎng) 24 h，熒光定量 PCR 結(jié)果顯示在 2500 ×的離心重力作用 15 min 后hADSC 中 Sox 9 的 mRNA 表達(dá)顯著性增加，相比沒(méi)有加載離心重力的 hADSCs 的對(duì)照組，在2500 ×離心重力下的 Sox 9 的 mRNA 表達(dá)量增加 3.6 倍（圖 1A）。此外，為了優(yōu)化離心重力的加載時(shí)間，加載 2500 ×的離心力條件下比較不同時(shí)間點(diǎn)（0、15、30、45、60 min）hADSCs 中的 Sox 9 的 mRNA 表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)加載 2500 ×離心重力在 5、15、60 min，hADSCs 中 Sox 9 的 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯增加，而在 30 min 時(shí)其有顯著上調(diào)（圖 1B）。熒光定量 PCR 和 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示離心重力在 2500 ×，離心時(shí)間維持 30 min 時(shí)，刺激 hADSCs 誘導(dǎo) Sox 9 基因和蛋白上調(diào)表達(dá)最佳（圖 1C 和 1D）。

表 1 PCR 引物序列

圖 1 離心重力增加人脂肪干細(xì)胞中 Sox 9 的表達(dá)[A：離心重力的優(yōu)化；B：離心時(shí)間的優(yōu)化；C：對(duì)照組和離心重力組（2500 × g，30 min）中 Sox 9 的 mRNA 表達(dá)；D：對(duì)照組和離心重力組（2500 × g，30 min）中 Sox 9 的蛋白表達(dá)]

Figure 1 Centrifugal gravity increased Sox 9 expression in hADSCs (A: Optimization of CG; B: Optimization of centrifugal time; C: Expression of Sox 9 mRNA in hADSCs stimulated with or without 2500 ×for 30 min; D: Expression of Sox 9 protein in hADSCs stimulated with or without 2500 ×for 30 min)

2.2 離心重力和 TGF-β3 刺激后 hADSCs 的組織學(xué)評(píng)價(jià)

離心重力組和 TGF-β3 組誘導(dǎo) hADSCs 成軟骨誘導(dǎo) 21 d 后，細(xì)胞軟骨特異性染色阿利辛藍(lán)呈陽(yáng)性，證實(shí)兩組細(xì)胞外基質(zhì)有蛋白聚糖表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)離心重力刺激 hADSCs 與 TGF-β3 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化的表達(dá)程度水平相似，但 TGF-β3 組的陽(yáng)性表達(dá)更強(qiáng)（圖 2）。

2.3 DMMB 檢測(cè)離心重力和 TGF-β3 刺激 hADSCs 的 GAG 含量

按照 DMMB 比色法說(shuō)明書測(cè)定 GAG 的含量，對(duì)照組、離心重力組和 TGF-β3 組刺激 hADSCs 后，檢測(cè) 3 組中第 7 天、第 14 天和第 21 天 GAG 含量的表達(dá)。研究比較顯示，第 7 天時(shí)，TGF-β3 組 GAG 含量略微高于離心重力組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05），第 14 天時(shí)，TGF-β3 組 GAG 含量高于重力組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05），第 21 天時(shí)，離心重力組 GAG 含量顯著高于 TGF-β3 組（< 0.05）（圖 3A）。

2.4 熒光定量 PCR 檢測(cè)離心重力和 TGF-β3 刺激 hADSCs 的 II 型膠原基因表達(dá)

離心重力組、TGF-β3 組和對(duì)照組經(jīng)不同的培養(yǎng)條件刺激后連續(xù)培養(yǎng) 21 d，熒光定量 PCR 檢測(cè)三組hADSCs 細(xì)胞團(tuán)塊中 II 型膠原 mRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn) TGF-β3 組的 II 型膠原 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著高于離心重力組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05)（圖 3B)。

圖 2 離心重力和 TGF-β3 刺激 hADSCs 后組織學(xué)評(píng)價(jià)（× 40）（A：離心重力組阿利辛藍(lán)染色；B：TGF-β3 組阿利辛藍(lán)染色；C：離心重力組 HE 染色；D：TGF-β3 組 HE 染色）

Figure 2 Histological evaluation of hADSCs after CG and TGF-β3 stimulation (× 40) (A: Alcian blue staining of the CG group; B: Alcian blue staining of the TGF-β3 group; C: HE staining of the CG group; D: HE staining of the TGF-β3 group)

圖 3 離心重力和 TGF-β3 刺激 hADSCs 軟骨特征的表現(xiàn)（A：DMMB 比色法測(cè)定各組 GAG 含量；B：熒光定量PCR 測(cè)定各組 II 型膠原 mRNA 的含量）

Figure 3 CG and TGF-β3 stimulated hADSCs showed chondrogenic characteristics (A: Level of GAG in various groups by DMMB quantitative assay; B: Level of type II collagen mRNA in various groups by real-time PCR)

2.5 Western blot 檢測(cè)離心重力后 hADSCs 中 Sox 9、β-catenin、GSK3β 和p-GSK3β 蛋白表達(dá)

為了進(jìn)一步探討離心重力刺激 hADSCs 對(duì)其 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的影響，對(duì)培養(yǎng) P3代的 hADSCs 細(xì)胞，分對(duì)照組和離心重力組，重力離心刺激后，培養(yǎng) 24 h 后，Western blot 檢測(cè)兩組細(xì)胞中 Sox 9、GSK3β、p-GSK3β 蛋白以及活化 β-catenin 的蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，離心重力組的 GSK-3β 蛋白的磷酸化水平減低，同時(shí)活化 β-catenin 蛋白水平減少，而 GSK3β 和 Sox 9 蛋白水平增加（圖 4）。說(shuō)明離心重力可通過(guò)對(duì) Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的抑制，激活 Sox 9蛋白表達(dá)上調(diào)。

圖 4 離心重力刺激人脂肪干細(xì)胞對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的影響

Figure 4 The effect of CG on Wnt/β-catenin signaling pathway in hADSCs

3 討論

創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)軟化癥引起的軟骨損傷在臨床上很常見(jiàn)。傳統(tǒng)的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)方法如微骨折、自體軟骨細(xì)胞移植等，這些方法都有各自局限性。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，組織工程技術(shù)為軟骨損傷提供了新的途徑。多項(xiàng)研究已表明，與其他來(lái)源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，脂肪干細(xì)胞可從全身多處部位提取，來(lái)源豐富，還具有增殖快、數(shù)量眾多、免疫原性低、不易造成損傷等優(yōu)點(diǎn)[9-11]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)械應(yīng)力通過(guò)上調(diào)相關(guān)軟骨基因誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨化，剪切力有助于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)成軟骨化[12]?？紤]到離心機(jī)是一種常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，離心是細(xì)胞收獲和分離中一種常用的手段。因此，我們推測(cè)離心重力作為機(jī)械應(yīng)力的一種常見(jiàn)形式，可能有助于脂肪干細(xì)胞成軟骨分化。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先分離培養(yǎng) hADSCs 至 P3代后，以 Sox 9 基因表達(dá)作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)熒光定量 PCR 和 Western blot 篩選最佳離心力 2500 ×和最佳離心時(shí)間 30 min，離心重力刺激 24 h 后，Sox 9 mRNA 的表達(dá)量是對(duì)照組三倍以上。離心重力刺激 hADSCs 成軟骨分化過(guò)程中 Sox 9 基因表達(dá)顯著增加。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道 TGF-β3 是細(xì)胞因子中 TGF 家族的主要成員之一，可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成，在創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，尤其在軟骨的生長(zhǎng)和重建中起關(guān)鍵作用。我們進(jìn)一步通過(guò)離心重力和 TGF-β3 兩種培養(yǎng)體系將 P3代脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨后 21 d，通過(guò)阿利辛藍(lán)和 HE 染色，離心重力組和 TGF-β3 組的染色顯陽(yáng)性，前者比后者陽(yáng)性表達(dá)偏低。進(jìn)一步采用 DMMB 法測(cè)定 GAG 含量和熒光定量 PCR 測(cè)定 II 型膠原，發(fā)現(xiàn)離心重力組 GAG 含量和 II 型膠原相對(duì)偏低。我們分析發(fā)現(xiàn)，可能是離心重力一次刺激 hADSCs，而對(duì)于 TGF-β3 因子能多次持續(xù)刺激 hADSCs，因而 TGF-β3 組相應(yīng)的蛋白聚糖和 II 型膠原表達(dá)顯著偏高。對(duì)于潛在的臨床應(yīng)用，應(yīng)采用多次離心重力持續(xù)刺激 hADSCs，來(lái)維持其分化成軟骨樣細(xì)胞的表達(dá)狀態(tài)。研究表明，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與關(guān)節(jié)軟骨去分行和抑制軟骨凋亡有密切關(guān)系，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活可以組織 ADSCs 向軟骨細(xì)胞分行，Luo 等[13]{Luo, 2013 #179}在 ADSCs 向軟骨細(xì)胞分行過(guò)程中，加入 Wnt1 后激活 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，從而降低糖胺聚糖、Sox 9 和II型膠原的基因和蛋白表達(dá)，我們研究發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組來(lái)說(shuō)，離心重力組 GSK-3 的磷酸化水平和活化 β-catenin 的蛋白水平降低，導(dǎo)致 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路下游基因的表達(dá)減少，而其 Sox 9 蛋白表達(dá)增強(qiáng)。該研究結(jié)果證明離心重力可以抑制 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，增強(qiáng) Sox 9 基因的表達(dá)，維持脂肪干細(xì)胞分化而保持軟骨化的表型。

我們證實(shí)離心重力通過(guò)增加 Sox 9 和減少 β-catenin 蛋白表達(dá)誘導(dǎo) ADSCs 成軟骨樣分化。研究結(jié)果提示離心重力刺激 hADSCs 可以有效地改善干細(xì)胞成軟骨再生的便利，同時(shí)也降低了經(jīng)濟(jì)成本。雖然在這項(xiàng)研究中探討了 hADSCs 分離制備后誘導(dǎo)成軟骨的臨床前相關(guān)體外試驗(yàn)，但是，如何通過(guò)體外多次離心持續(xù)誘導(dǎo) hADSCs 的分化需要進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)，離心重力 hADSCs 在動(dòng)物體外的修復(fù)效果及其在修復(fù)中如何調(diào)節(jié)相關(guān)的信號(hào)通路也有待闡明。

[1] Camp CL, Stuart MJ, Krych AJ. Current concepts of articular cartilage restoration techniques in the knee. Sports Health, 2014, 6(3):265-273.

[2] Kon E, Filardo G, Di Matteo B, et al. Matrix assisted autologous chondrocyte transplantation for cartilage treatment: a systematic review. Bone Joint Res, 2013, 2(2):18-25.

[3] Shi J, Liang J, Guo B, et al. Adipose-derived stem cells cocultured with chondrocytes promote the proliferation of chondrocytes. Stem Cells Int, 2017, 2017:1709582.

[4] Kabiri A, Esfandiari E, Hashemibeni B, et al. Effects of FGF-2 on human adipose tissue derived adult stem cells morphology and chondrogenesis enhancement in Transwell culture. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 424(2):234-238.

[5] O'Conor CJ, Case N, Guilak F. Mechanical regulation of chondrogenesis. Stem Cell Res Ther, 2013, 4(4):61.

[6] Yang J, Hooper WC, Phillips DJ, et al. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol, 2002, 9(5):1142-1143.

[7] Diekman BO, Rowland CR, Lennon DP, et al. Chondrogenesis of adult stem cells from adipose tissue and bone marrow: induction by growth factors and cartilage-derived matrix. Tissue Eng Part A, 2010, 16(2):523-533.

[8] Shu X, Zheng R, Jie YS, et al. Effect of adipose-derived stem cells combine with acellular dermal matrix in repair of rabbit articular cartilage defects. Chin Med Biotechnol, 2017, 12(2):143-148. (in Chinese)

舒雄, 鄭蕊, 杰永生, 等. 脂肪干細(xì)胞復(fù)合真皮脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(2):143-148.

[9] Jiao Q, Wei XC, Yang ZQ, et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Orthop J Chin, 2004, 12(21-22):1682-1685. (in Chinese)

焦強(qiáng), 衛(wèi)小春, 楊自權(quán), 等. 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞定向分化的研究. 中國(guó)矯形外科雜志, 2004, 12(21-22):1682-1685.

[10] Somoza RA, Welter JF, Correa D, et al. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells: challenges and unfulfilled expectations. Tissue Eng Part B Rev, 2014, 20(6):596-608.

[11] Zhou Q, Li B, Zhao J, et al. IGF-I induces adipose derived mesenchymal cell chondrogenic differentiation in vitro and enhances chondrogenesis in vivo. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2016, 52(3): 356-364.

[12] Juhász T, Matta C, Somogyi C, et al. Mechanical loading stimulates chondrogenesis via the PKA/CREB-Sox9 and PP2A pathways in chicken micromass cultures. Cell Signal, 2014, 26(3):468-482.

[13] Luo S, Shi Q, Zha Z, et al. Inactivation of Wnt/β-catenin signaling in human adipose-derived stem cells is necessary for chondrogenic differentiation and maintenance. Biomed Pharmacother, 2013, 67(8): 819-824.

Differentiation of adipose-derived stem cells into cartilage-like cells induced by centrifugal gravity

SHU Xiong, JIE Yong-sheng, ZHENG Rui, CHEN Lei, JIN Shao-feng, QI Hui, SUN Lei

Author Affiliation: Beijing Jishuitan Hospital, Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, 100035 Beijing, China

To investigate the effect of centrifugal gravity (CG) on chondrogenic differentiation and Wnt/β-catenin signaling pathway in human adipose-derived stem cells (hADSCs).

hADSCs were stimulated by loading different degrees of CG (0, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 and 3000 ×) and different time points (0, 15, 30, 45, 60 min) to induce chondrogenic differentiation. After the hADSCs were cultured to the 3rd generation and the cells were divided into 3 groups, the control group without intervention, the CG group and the TGF-β3 group added TGF-β3 into cartilage induction agent. At the 21st day, the three groups were observed by Alcian blue and HE staining. The expression level of glycosaminoglycan (GAG) in extracellular matrix was determined by dimethylmethylene blue (DMMB) method. The expression of type II collagen gene was assessed by real-time polymerase chain reaction (PCR). Sox 9, β-catenin, GSK3β and p-GSK3β proteins from the control group and the CG group were detected by Western blot.

The mRNA and protein expression of Sox 9 from hADSCs was up-regulated by CG (2500 ×for 30 min) after 24 h of culture. Alcian blue and HE staining showed positive expression of cartilage in the CG group and TGF-β3 group, the results of GAG showed that the ability to secrete GAG in the TGF-β3 group was better than that of the CG group (< 0.05), and the expression of type II collagen (mRNA) in the control group was higher than that in the CG group (< 0.05). Compared with the control group, the results from Western blot showed that the expression level of β-catenin and p-GSK3β with CG group decreased, while the expression of GSK3β and Sox 9 increased.

CG induces Sox 9 expression as TGF-β3 with a similar ability and could induce chondrogenic differentiation of hADSCs via inhibiting Wnt/β-catenin signaling pathway.

Humanadipose-derived stem cells; Hypergravity; Sox 9 transcription factor; Chondrogenic differentiation

: SUN Lei, Email: dr_sunlei@263.net; QI Hui, Email: Kellyqhqh2002@163.com

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)（首發(fā)2011-1006-01）；北京市科技新星計(jì)劃（H013610310113）

孫磊，Email：dr_sunlei@263.net；綦惠，Email：Kellyqhqh 2002@163.com

2017-11-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.