李愛歆，李 林，金梅花，張 麗*

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，黑龍江 佳木斯154002；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

急性心肌梗死(AMI)是嚴重的心血管疾病。近年來，由于對AMI的早期識別及有效干預，包括經(jīng)皮冠狀動脈介入手術(PCI)、冠狀動脈旁路搭橋術的應用，AMI致死率較前明顯下降，但AMI作為臨床上的急危重癥，早期診斷及及早干預病情對改善預后尤為重要，目前診斷AMI金標準仍是肌鈣蛋白、肌紅蛋白及肌酸激酶同工酶，本研究以急性心肌梗死血漿中miR-30d為研究目標，探討血漿miR-30d可作為急性心肌梗死超急性期的診斷指標。

1 資料與方法

1.1病例資料

患者外周血樣本來自2014年6月至2016年6月期間，佳木斯大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科住院的急性心肌梗死患者60例，男性患者38例，女性患者22例，平均年齡為54.78±15.77歲。納入標準:STEMI、NSTEMI患者診斷參照2010年中華醫(yī)學會心血管病學分會急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南，心臟生物標志物質(zhì)(最好是肌鈣蛋白)增高或增高后降低，至少有1次數(shù)值超過參考值上限的99百分位(即參考值上限)，并有以下至少1項也肌缺血的證據(jù)：①心肌缺血臨床癥狀；②心電圖出現(xiàn)新的心肌缺血變化，ST段抬高≥0.1 mV；⑤心電圖出現(xiàn)病理性Q波；④影像學證據(jù)顯示新的心肌活力喪失或區(qū)域性室壁運動異常。排除標準:既往腫瘤病史及患有腫瘤、急慢性感染、嚴重肝腎功能異常、急性腦梗死、腦出血、創(chuàng)傷、自身免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病及既往行PCI患者。健康對照組來自我院體檢中心共60例，男性34例，女性26例，平均年齡為55.64±18.12歲。入選對象兩組一般資料無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，具有可比性，見表1。

1.2標本采集

AMI組入院后即刻抽血，24 h后再次抽血，均抽取外周靜脈血4 ml置于EDTA 抗凝劑管中，健康對照組于體檢時與體檢24 h后抽取外周靜脈血3 ml置于EDTA 抗凝劑管中，室溫下1 600 g離心15 min，吸取上清液至 Eppendorf 管中，之后4℃下12 000 g 離心10 min，再次吸取上清液至新Eppendorf 管中內(nèi)，-80℃保存以備miRNA抽提。另外AMI組入院后即刻抽取外周靜脈血3 ml置于肝素抗凝劑的管中，室溫3 000 rpm離心15 min做心肌損傷標志物檢測，包括肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(cTnI)。

1.3miRNA的檢測

應用熒光定量PCR法對樣本中的miR-30d表達水平進行檢測，按試劑盒說明書進行具體操作。Ct值用 SDS2.1軟件計算，以cel-miR-39作為內(nèi)參照，采用相對定量法，以2-△△Ct表示患者組血漿中目的基因的表達相對于健康對照組的變化倍數(shù)，其中△△Ct=(CtmiR-30d-Ctcel-miR-39) AMI組-(CtmiR-30d-Ctcel-miR-39) 健康對照組。

1.4統(tǒng)計及圖像處理

2 結(jié)果

2.1AMI組和健康對照組在性別、年齡、心率等一般資料上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2兩組不同時間段血漿miR-30d表達水平，入院后1 h內(nèi)AMI患者miR-30d的表達水平明顯高于對照組，隨著AMI發(fā)病時間的延長患者血miR-30d的表達下降，但仍高于對照組，兩時段內(nèi)與對照組相比，均有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，見表2。

2.3血漿miR-30d的表達趨勢與傳統(tǒng)心肌損傷標志物CK-MB、cTnI表達趨勢相同，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且隨著AMI發(fā)病時間的延長患者血漿miR-30d的表達陽性率下降，見表3。

3 討論

近些年來，研究人員發(fā)現(xiàn)miRNA 參與多種疾病的發(fā)病過程。在許多疾病中，miRNA能夠成為重要的生物學標志[1,2]。現(xiàn)有研究證實血清/血漿中存在大量穩(wěn)定的 miRNAs 分子，這給miRNAs的血清/血漿學研究帶來了希望[3]。

表1 入選對象基本資料

表2 兩組不同時間段血漿miR-30d表達水平

注：與對照組相比*P<0.01。

表3 AMI組入院1 h、24 h心肌損傷標志物CK-MB 、cTnI及血漿miR-30d的表達陽性率

注：miR-30d與心肌損傷標志物CK-MB比較，*P>0.05。

miR-30家族包括5個成員，miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e，具有較高的同源性，目前對于miR-30的研究集中于腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，miR-30在前列腺癌細胞中高表達，通過抑制EMT表型從而抑制癌細胞遷移和侵襲[4]。miR-30d亦被認為是乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和肺癌轉(zhuǎn)移的標志。近年來，研究學者發(fā)現(xiàn)在心肌肥大過程中miR-30通過下調(diào)靶基因在心肌纖維化及血管損傷中起著重要作用[5,6]。

最近研究證實miR-30家族被凋亡基因p53激活，參與乳腺癌細胞的DNA損傷修復。但目前關于miR-30在缺血性疾病中的研究較少。文獻報道AMI發(fā)生后，細胞凋亡相關的因子Bcl-2，caspase-3，F(xiàn)as，Bax，p53等異常表達，急性心肌梗死是由于心肌供血區(qū)域血流急劇減少，造成組織供氧絕對不足致能量耗竭從而啟動心肌組織細胞凋亡，而當組織細胞受到缺血、缺氧等傷害時，P53基因可被激活，P53基因?qū)τ诩毎芷谧铚?、凋亡、修復、分化、衰老的調(diào)節(jié)以及抑制血管生成有著重要的作用[7,8]。

本研究證實miR-30d在心肌梗死早期高表達，與健康對照組相比有顯著的統(tǒng)計學差異，且隨著AMI病程的進展，miR-30d表達量下降，提示miR-30d在急性心肌梗死超早期起到重要調(diào)控作用，過表達的miR-30d可能作用于P53基因，啟動下游促凋亡因子的表達，加速心肌細胞的凋亡，加重了心肌細胞缺血缺氧損傷。

肌鈣蛋白、肌紅蛋白及肌酸激酶同工酶作為急性心肌梗死的金診斷標志物已經(jīng)多年，本研究發(fā)現(xiàn)miR-30d在AMI血漿中高表達與AMI病情進展具有相關性，提示miR-30d在急性心肌梗死超急性期中的診斷價值，與心肌損傷標志物CK-MB 變化趨勢相同，但這一結(jié)果需要更多的研究來證明，例如關于miR-30d的靶基因P53其凋亡途徑有待進一步研究及miR-30d血漿表達水平與急性心肌梗死患者預后的關系。

總體而言，本研究發(fā)現(xiàn)miR-30d血漿表達水平在AMI組與健康對照組相比，前者顯著高表達，且miR-30d表達水平隨著AMI病程進展呈下降趨勢，提示血漿中miR-30d有望成為診斷AMI超急性期的分子標志，且可能與靶基因P53的表達有關，有可能加重了心肌損傷。

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