史立言，劉 巖，陳 為，孟繁平，李 妍*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院,吉林 吉林132013;2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林 延吉133002)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷所引起慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病，雖然糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但越來越多的證據(jù)表明，免疫損傷因素參與胰腺的損傷[1]。胰島主要是由4類內(nèi)分泌細(xì)胞組成，分泌胰島素的 β細(xì)胞組成胰島核心,而α、δ及 PP細(xì)胞組成胰島外殼。胰腺是血管密集、血供豐富的器官，當(dāng)巨噬細(xì)胞(macrophage,Mφ)被趨化而浸潤入胰島微環(huán)境，可分泌細(xì)胞因子及釋放NO等，參與β細(xì)胞損傷。感染、代謝和損傷因素刺激下，Mφ的極化將導(dǎo)致其分泌細(xì)胞因子和功能的改變[2]。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)結(jié)合Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR-4)而活化Mφ，姜黃素(curcumin)具有抗炎效應(yīng)[3]。本研究將探討其是否可通過調(diào)節(jié)Mφ極化而減輕活化巨噬細(xì)胞對胰島β細(xì)胞的損傷。

1 材料與方法

1.1材料小鼠細(xì)胞巨噬細(xì)胞RAW264.7和小鼠胰島β細(xì)胞Min-6保存于液氮中。1640培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購自Gibco公司。PE熒光素標(biāo)記抗小鼠CD40、CD86和CD206的抗體購自天津三箭生物技術(shù)有限公司；LPS和活性氧(ROS)熒光探針雙氯熒光黃乙酸乙酯(Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)溶液購自上海碧云天生物科技有限公司；雙染凋亡檢測試劑盒和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)檢測小鼠TNF-α試劑盒購eBioscience公司。姜黃素購自Sigma Aldrich公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和處理復(fù)蘇液氮凍存RAW 264.7細(xì)胞，在含10% 小牛血清1640培養(yǎng)液、5% CO2、飽和濕度37 ℃培養(yǎng)；用含0.25% 胰蛋白酶和0.2% 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA) 的消化液消化細(xì)胞，每周傳代2-3 次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。按1×106/孔接種細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板，按如下分組加入LPS和姜黃素:對照組(control)，脂多糖(LPS)組(2 μg /mL)，姜黃素(curcumin)組(7.5 μmol/L ) 和聯(lián)合處理組(2 μg /mL LPS+ 7.5 μmol/L curcumin) 。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，收集培養(yǎng)物上清液于-20℃凍存，消化并收集細(xì)胞，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。復(fù)蘇并培養(yǎng)Min-6細(xì)胞，按1×106/孔接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞恢復(fù)貼壁生長后，按25%比例加入不同實(shí)驗(yàn)分組處理后的RAW 264.7細(xì)胞上清液，不添加RAW 264.7細(xì)胞上清液組為對照組；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，消化收集Min-6細(xì)胞，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)取不同處理因素作用后的RAW264.7細(xì)胞，每組 5×105個細(xì)胞，懸于100 μl PBS，加入1 μg FITC 標(biāo)記抗CD 40抗體或陰性對照抗體，4 ℃下避光反應(yīng)30 min。PBS洗2次后用400 μl的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測陽性表達(dá)細(xì)胞百分率。相同的方法檢測CD86和CD206表達(dá)。

1.4ROS檢測取不同處理因素作用后的RAW264.7細(xì)胞，每組 5×105個細(xì)胞，懸100 μl PBS ，加入DCFH-DA 儲存液，至其終濃度為 5 μmol/L，混勻后在 37 ℃避光反應(yīng) 30 min，PBS洗2次，400 μl PBS 重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)熒光，以熒光強(qiáng)度均值代表細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.5ELISA取不同處理因素作用的RAW 264.7 細(xì)胞上清液，按照 ELISA 試劑盒操作說明測定 檢測TNF-α含量，每個處理因素設(shè)3個復(fù)孔。

1.6細(xì)胞凋亡檢測取不同處理因素作用后Min-6細(xì)胞，每組 5×105個細(xì)胞，用195 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入 5 μl Annexin-V-FITC 工作液，室溫下避光反應(yīng) 30 min；結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞2次，400 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入PI 溶液5μl,立即上機(jī)用流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果

2.1LPS和姜黃素對RAW264.7細(xì)胞膜分子表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS和姜黃素對RAW264.7細(xì)胞膜分子CD40、CD86和CD206的表達(dá)均有影響(表1)。與對照組比較，脂多糖組CD40和CD86表達(dá)增加，而CD206表達(dá)減少；姜黃素組CD206表達(dá)明顯增加，CD40和CD86略下降。與脂多糖組比較，聯(lián)合處理組CD206表達(dá)略增加，CD40和CD86下降。

表1 LPS和姜黃素對RAW264.7細(xì)胞膜分子表達(dá)的影響

*與對照組(control)比較，P<0.05**與脂多糖組(LPS)比較，P<0.05

2.2LPS和姜黃素對RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

通過檢測發(fā)現(xiàn)，LPS可促進(jìn)RAW264.7釋放TNF-α入細(xì)胞培養(yǎng)上清液，而姜黃素處理后，細(xì)胞分泌TNF-α較脂多糖組明顯減少(表2)。

表2 LPS和姜黃素對RAW264.7分泌TNF-α的影響

*與對照組(control)比較，P<0.05**與脂多糖組(LPS)比較，P<0.05

2.3LPS和姜黃素對RAW264.7細(xì)胞活性氧的影響

ROS主要由細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞在活化、吞噬和殺傷病原體的過程中伴隨ROS增加[4]。通過熒光探針法檢測細(xì)胞活性氧，對照組(control)，脂多糖(LPS)組(2 μg /mL)，姜黃素(curcumin)組(7.5 μmol/L ) 和聯(lián)合處理組代表ROS含量的熒光強(qiáng)度值分別為12.4±1.3，25.7±2.8，9.7±0.9和11.6±1.0(圖1)。分析表明，LPS導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加，而低濃度的姜黃素對細(xì)胞內(nèi)ROS僅有弱的減少效應(yīng)(與對照組比較P<0.05)；但姜黃素能能顯著減少LPS激發(fā)的活性氧(與脂多糖組比較P<0.05)。

圖1 LPS和姜黃素對RAW264.7細(xì)胞活性氧的影響

2.4姜黃素拮抗LPS活化巨噬細(xì)胞對Min-6細(xì)胞的損傷

采用雙染法檢測Min-6細(xì)胞凋亡情況，用新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)組作為空白組(blank),而添加不同條件培養(yǎng)液組對應(yīng)命名，即對照組(control)，脂多糖(LPS)組(2 μg/mL)，姜黃素(curcumin)組(7.5 μmol/L ) 和聯(lián)合處理組(LPS +curcumin)。

3 討論

糖尿病發(fā)生發(fā)展的核心是胰島β細(xì)胞的功能障礙[5]。多項(xiàng)研究顯示，多種炎癥因子可對胰島β細(xì)胞造成損傷，包括TNF-α、IFN-γ和IL-1β等[6]，損傷的胰島β細(xì)胞刺激巨噬細(xì)胞活化，致使其分泌更多的炎性因子，進(jìn)一步加重胰島細(xì)胞的損傷[7]。因此，抑制巨噬細(xì)胞活化，使其向調(diào)節(jié)性分化，可能成為糖尿病的治療手段之一。姜黃素是一種從姜科、天南星科植物的根莖中提取出的一種成分，是傳統(tǒng)中藥姜黃的主要成分，其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及降血脂等作用[8]。研究表明，它不僅能夠抑制巨噬細(xì)胞活化，而且具有使已活化的巨噬細(xì)胞向調(diào)節(jié)型轉(zhuǎn)變的功能[9]。LPS是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，可刺激巨噬細(xì)胞活化，產(chǎn)生炎癥[10]。本研究中，利用LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7，使其發(fā)生M1型極化，并以其產(chǎn)生的含有炎癥因子的培養(yǎng)液上清作用于小鼠胰島Min-6細(xì)胞，模擬體外炎癥損傷模型。結(jié)果顯示，LPS使Raw264.7細(xì)胞膜分子CD40和CD86表達(dá)均有增加，而CD206表達(dá)減少，且TNF-α分泌增加，細(xì)胞內(nèi)ROS增加，表明成功建立炎癥模型；而加入姜黃素后，以上指標(biāo)的變化明顯減弱甚至被逆轉(zhuǎn)。將M1極化后的Raw264.7培養(yǎng)上清加入Min-6細(xì)胞后，以姜黃素干預(yù)后的炎癥模型與之對比，雙染凋亡結(jié)果顯示，Min-6細(xì)胞受到M1極化的巨噬細(xì)胞炎癥因子刺激，凋亡比例明顯增加，而姜黃素可顯著抑制其損傷作用，提示姜黃素可能拮抗巨噬細(xì)胞的活化，保護(hù)炎性因子對胰島細(xì)胞的損傷。

圖2 姜黃素拮抗LPS活化巨噬細(xì)胞對Min-6細(xì)胞的損傷

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