張文婷 羅青平 邵華斌

摘要：A型流感病毒是一種流行廣泛且死亡率很高的病毒，對(duì)人類及動(dòng)物都造成了極大的影響。M1蛋白作為維持A型流感病毒基本形態(tài)的蛋白，在其生命周期中起著重要作用，但其具體結(jié)構(gòu)和功能仍有待探討。對(duì)A型流感病毒的基本分子生物學(xué)特性進(jìn)行了綜述，并對(duì)其基質(zhì)蛋白M1的生物學(xué)特性、功能和結(jié)構(gòu)做了闡述。

關(guān)鍵詞：A型流感病毒;M1蛋白;蛋白結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S852.65? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2018）12-0019-03

流感病毒感染是每年都受到關(guān)注的主要的公共健康問(wèn)題。A型流感病毒是一種能夠引發(fā)較高死亡率的廣泛流行的病毒。為了更好地預(yù)防并治療流感病毒感染，對(duì)流感病毒的基本分子生物學(xué)特性有一個(gè)綜合性的了解是非常關(guān)鍵的。許多囊膜病毒中都含有基質(zhì)蛋白M1，作為一種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其不僅能夠維持病毒的基本結(jié)構(gòu)，在調(diào)節(jié)基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制活動(dòng)中也起著重要作用。

1? A型流感病毒的概述

正黏病毒是一類基因組為分節(jié)段、單股、負(fù)鏈RNA的病毒。目前正黏液病毒科可以分為五個(gè)屬，其中三個(gè)屬為流行性感冒病毒，分別是A型、B型及C型流行性感冒病毒，另外兩個(gè)屬是 Isavirus 病毒屬和 Thogotoviruses 病毒屬。在2009年，研究者基于序列分析提出了由Quaranfil、Johnston Atoll、和 Lake Chad 病毒組成的第六個(gè)有可能為正黏病毒的病毒屬[1]。正黏病毒的宿主非常廣泛。A型流感病毒可以感染包括人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物及禽類，可以引起流感流行和大流行并引發(fā)大規(guī)模死亡;B型流感病毒能夠感染人及海豹;而C型流感病毒能感染人及豬。索戈托病毒（屬于Thogotoviruses病毒屬）也可以感染人類，它通常是由壁虱來(lái)傳播的[2];傳染性鮭魚貧血癥病毒（屬于Isavirus病毒屬）可以感染大西洋鮭魚及其他的鮭魚種類。

A型流感病毒是流感流行和大流行的致病病毒，它是有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。A型流感病毒有8條線性的單股RNA，編碼12種病毒蛋白，包括PB1、PB2、PB1-F2、N40、PA、NP、HA、NA、NS1、NEP、M1和M2[3]。其中，第二條RNA編碼3個(gè)蛋白，即聚合酶組成成分PB1、一個(gè)小的蛋白PB1-F2及一個(gè)PB1的N端截短片段N40。第七條RNA編碼M1和M2，第八條RNA編碼NS1和NEP，這都是通過(guò)mRNA的選擇性剪接來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

A型流感病毒有3個(gè)包膜蛋白，紅細(xì)胞凝聚素HA、神經(jīng)氨酸苷酶NA和基質(zhì)蛋白2（M2）。它們都嵌入在病毒包膜的脂質(zhì)雙分子層中。這個(gè)脂質(zhì)雙分子層源于宿主的質(zhì)膜，包括富含膽固醇的脂筏以及非脂筏。HA和NA蛋白更偏向與脂筏結(jié)合，而M2蛋白則沒(méi)有這種偏好性。表面糖蛋白HA和NA主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒入侵細(xì)胞及從細(xì)胞中釋放：HA通過(guò)結(jié)合宿主細(xì)胞的唾液酸受體來(lái)幫助病毒包膜與細(xì)胞質(zhì)膜識(shí)別并促進(jìn)膜融合。HA結(jié)合的效率與唾液酸的類型以及連接唾液酸殘基與受體上的寡糖的分子鍵相關(guān)。感染人的流感病毒更傾向于結(jié)合含有α2，6鍵-N-乙酰神經(jīng)氨酸的寡糖受體，而感染禽的流感病毒則更加傾向于結(jié)合那些含有α2，3鍵-N-乙酰神經(jīng)氨酸的寡糖受體。這也解釋了為什么禽流感不能引起基于人感染人的流感大流行。在病毒完成復(fù)制后，NA糖蛋白將唾液酸受體從宿主細(xì)胞膜上切割下來(lái)，從而釋放子代病毒。M2蛋白是一個(gè)受到PH控制的質(zhì)子通道。當(dāng)內(nèi)體酸化時(shí)M2被激活，將質(zhì)子注入病毒內(nèi)部，導(dǎo)致M1與核糖核蛋白（RNP）解離[4]?；|(zhì)蛋白1（M1）在病毒包膜下形成一層蛋白層，并連接病毒的基因組。在M1蛋白層里面是八個(gè)被核蛋白NP包裹著形成雙螺旋桿狀結(jié)構(gòu)的單股負(fù)鏈基因組RNA分子，也叫核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物[5]。每一個(gè)RNP都與PB1、PB2、PA組成的異三聚體的RNA聚合酶相連。這三個(gè)聚合酶蛋白負(fù)責(zé)病毒RNAs的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[6]。某些A型流感病毒可以表達(dá)一種促凋亡蛋白PB1-F2，這種蛋白是由PB1基因上的一種可替代的開(kāi)放閱讀框編碼的。NS基因可以通過(guò)選擇性剪接編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2）。NS1蛋白能夠抑制細(xì)胞mRNA的翻譯并刺激病毒mRNA的翻譯。而NS2（也被稱為NEP，核輸出蛋白）具有核輸出信號(hào)，這個(gè)信號(hào)對(duì)于幫助新合成的核糖核蛋白從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)中是很重要的。

在感染過(guò)程中，A型流感病毒是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入到宿主細(xì)胞的。通過(guò)HA蛋白介導(dǎo)的受體識(shí)別，病毒進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)體。內(nèi)體的酸性環(huán)境使HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化從而使得病毒和內(nèi)體的膜融合。同時(shí)低pH的環(huán)境也會(huì)打開(kāi)M2離子通道，導(dǎo)致質(zhì)子大量涌入病毒粒子的內(nèi)部。這使得核糖核蛋白R(shí)NPs與M1蛋白解離[4]，為其進(jìn)入核內(nèi)提供條件。流感病毒是少數(shù)在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的病毒之一。病毒RNPs通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入到宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中[7]。在細(xì)胞核內(nèi)，原始感染病毒的RNPs是病毒mRNA合成的模板同時(shí)也是反基因鏈、互補(bǔ)RNA（cRNA）的模板。cRNA是指導(dǎo)合成新生病毒RNAs（vRNAs）的復(fù)制中間體。而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也就是病毒的mRNA則是在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯合成蛋白質(zhì)。新合成的NP、PB1、PB2和PA蛋白被輸入到核內(nèi)為組裝形成新的RNPs做準(zhǔn)備[7]，M1和NEP蛋白也進(jìn)入到核內(nèi)幫助RNPs的輸出[8]。為了幫助RNPs輸出，M1連接RNPs與NEP，而NEP擁有一個(gè)核輸出信號(hào)（NES），便于RNPs運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中[8]。在細(xì)胞質(zhì)中，流感病毒的核糖核蛋白R(shí)NPs被運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)膜上，在這里，它們被選擇性地包裝到出芽的病毒粒子中[9]。

2? A型流感病毒M1蛋白

許多囊膜病毒中都含有基質(zhì)蛋白，包括副黏病毒、正黏病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒。作為一種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，基質(zhì)蛋白通常能夠直接在病毒脂質(zhì)膜的下方形成一層單層蛋白質(zhì)基質(zhì)?；|(zhì)蛋白也被稱為病毒裝配的“適配器”，因?yàn)樗鼈兡軌蚪閷?dǎo)病毒包膜或糖蛋白的尾巴與病毒的核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物之間的相互作用，從而促進(jìn)病毒的基因組進(jìn)入到新裝配的病毒中。病毒的基質(zhì)蛋白還能夠通過(guò)加強(qiáng)結(jié)構(gòu)的剛性為病毒的囊膜提供結(jié)構(gòu)支持，并且有時(shí)候基質(zhì)蛋白能夠幫助調(diào)節(jié)或維持病毒的形狀。除了它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)方面的作用，許多病毒的基質(zhì)蛋白已經(jīng)被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制活動(dòng)[10]。

正黏病毒家族所有的成員包括流感病毒A、B、C、索戈托病毒屬及Isavirus都編碼基質(zhì)蛋白，并稱為M1。在A型流感病毒中，M1蛋白是由基因片段7線性轉(zhuǎn)錄形成的。A型流感病毒的M1蛋白在該病毒的生命周期中起著十分重要的作用。首先，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，內(nèi)涵體中的病毒內(nèi)部發(fā)生酸化，減弱了病毒RNPs與M1蛋白之間的相互作用，RNPs被釋放，并通過(guò)NP蛋白上的核定位信號(hào)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)為病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄做準(zhǔn)備[11]。隨著感染的進(jìn)一步進(jìn)行，當(dāng)新合成的M1蛋白中的一部分進(jìn)入到核內(nèi)后，能夠在細(xì)胞核內(nèi)與新合成的RNPs結(jié)合，并介導(dǎo)它們的出核。根據(jù)“daisy-chain”模型，M1的C端區(qū)域與vRNP結(jié)合[12]，而M1的N端區(qū)域則是與NEP（也叫作NS2）的C端結(jié)合，NEP再通過(guò)它富含亮氨酸的核輸出信號(hào)與細(xì)胞的輸出蛋白Crm1以Ran·GTP依賴的方式相結(jié)合。這樣就形成了一個(gè)大的復(fù)合體（Crm1-Ran·GTP）-NEP-M1-vRNP，這個(gè)復(fù)合體帶著vRNP跨越核膜，最終來(lái)到裝配的地方[13]。有研究表明，M1與vRNP在細(xì)胞核中的結(jié)合能夠阻止mRNA的轉(zhuǎn)錄[12]。也有研究者認(rèn)為M1與病毒包膜以及新組裝的vRNP之間的相互作用能夠提高病毒出芽的效率[14]。在細(xì)胞質(zhì)中，M1能夠與HA和NA的胞質(zhì)尾區(qū)相互作用，從而促進(jìn)M1與脂筏膜結(jié)合并隨后引發(fā)M1聚合，幫助出芽病毒顆粒的延伸[15]。與膜結(jié)合的M1蛋白能夠作為一個(gè)招募病毒RNPs的?？奎c(diǎn)，同時(shí)也能夠介導(dǎo)招募M2到病毒出芽的部位[16]。M1的序列變化與病毒形成絲狀或者球狀的病毒顆粒是相關(guān)的[17]。有報(bào)道稱，單獨(dú)表達(dá)M1能夠介導(dǎo)病毒樣顆粒（VLPs）的單個(gè)蛋白出芽，這說(shuō)明M1是A型流感病毒裝配和出芽的主要驅(qū)動(dòng)力。而與此相矛盾的是，也有研究認(rèn)為是HA和NA蛋白而不是M1蛋白對(duì)于病毒樣顆粒的包裝和出芽起著關(guān)鍵性的作用[18]。此外，在病毒粒子中，M1同時(shí)與質(zhì)膜和形成RNP的NP相互作用[19]。

3? A型流感病毒M1蛋白結(jié)構(gòu)

A型流感病毒M1蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被多個(gè)研究小組廣泛地研究，但是到目前為止，只有其N末端片段的結(jié)構(gòu)被解析出來(lái)[20-23]。根據(jù)Sha等[23]的報(bào)道，這個(gè)由約160個(gè)氨基酸殘基組成的片段，包含了9個(gè)α螺旋。而在所有已有的4篇報(bào)道中，M1的N端結(jié)構(gòu)域在本質(zhì)上采用的是相同的折疊方式。溶液的pH在分子間的相互作用上起著一定的作用。在酸性環(huán)境中，M1呈現(xiàn)二聚體的狀態(tài)，而在中性環(huán)境下則呈現(xiàn)的是單體的狀態(tài)。雖然目前A型流感病毒的C末端結(jié)構(gòu)域的原子結(jié)構(gòu)尚未確定，但有研究預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)是富含α-螺旋的一個(gè)靈活的結(jié)構(gòu)[24]。電子顯微鏡圖像顯示，在完整的A型流感病毒顆粒中，基質(zhì)蛋白層是由桿狀的M1蛋白單體作為基本的構(gòu)建塊。用電子斷層掃描分析感染的流感病毒顆粒，結(jié)果顯示，在酸性環(huán)境下，基質(zhì)蛋白M1會(huì)發(fā)生構(gòu)象的變化并從病毒的包膜上解離下來(lái)[25]。2017年有研究者解析了正黏病毒科傳染性鮭魚貧血癥病毒（ISAV）的M1蛋白全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，從整體上更好地了解了正黏病毒M1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[26]。盡管在序列上并不相似，ISAV-M1的N端結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上和FLUA-M1的確是很類似的，A型流感病毒M1蛋白N-domain的9個(gè)α-螺旋中有8個(gè)都可以與ISAV-M1 N-domain的α-螺旋相對(duì)應(yīng)匹配。雖然目前A型流感病毒M1蛋白的C端結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)還沒(méi)有解析出來(lái)，但有些研究者預(yù)測(cè)它可能是由4個(gè)α-螺旋組成的結(jié)構(gòu)[27]。FLUA-M1的C端結(jié)構(gòu)域的這種充滿α-螺旋的特征，也通過(guò)其他很多研究得到證實(shí)[20]。考慮到FLUA-M1與ISAV-M1在N-domain的結(jié)構(gòu)上的相似性，以及預(yù)測(cè)FLUA-M1的C-domain結(jié)構(gòu)中大部分是α-螺旋，可以推測(cè)這個(gè)蛋白的C-domain在結(jié)構(gòu)上也是相似的。

4? 小結(jié)

近年來(lái)，關(guān)于A型流感病毒M1蛋白的功能及其在流感病毒生命周期中所起到的作用的相關(guān)研究逐漸增多，但仍存在爭(zhēng)議。結(jié)構(gòu)生物學(xué)是近代生物學(xué)發(fā)展過(guò)程中定量闡明生命現(xiàn)象的一門科學(xué)，能夠通過(guò)物理學(xué)技術(shù)來(lái)研究生物大分子的功能和結(jié)構(gòu)，從而闡明這些大分子相互作用中的機(jī)制及其關(guān)鍵作用位點(diǎn)。對(duì)A型流感病毒M1蛋白全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)的解析就是研究其功能的一個(gè)很好的切入點(diǎn)，能夠?yàn)檫M(jìn)一步闡述A型流感病毒M1蛋白功能提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也有助于為開(kāi)發(fā)A型流感病毒新治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。研究者可以基于M1蛋白的結(jié)構(gòu)采取相應(yīng)的治療手段，干擾病毒感染細(xì)胞的過(guò)程;也能夠針對(duì)性地研發(fā)能阻礙M1蛋白自我聚合的化學(xué)分子，這種化學(xué)分子只要能夠與M1蛋白的任意結(jié)構(gòu)域相互作用，阻礙蛋白外殼的形成，就會(huì)是有效的手段。這將是未來(lái)研究的一個(gè)重要方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] PRESTI R M，ZHAO G，BEATTY W L，et al. Quaranfil，Johnston Atoll， and Lake Chad viruses are novel members of the family Orthomyxoviridae[J].Journal of Virology，2009，83（22）：11599-11606.

[2] JONES L D，NUTTALL P A.Non-viraemic transmission of Thogoto virus：influence of time and distance[J].Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene，1989，83（5）：712-714.

[3] MEDINA R A，GARCIA-SASTRE A. Influenza a viruses：new research developments[J].Nature Reviews Microbiology，2011，9（8）：590-603.

[4] PINTO L H， LAMB R A. The M2 proton channels of influenza A and B viruses[J].The Journal of Biological Chemistry，2006，281（14）：8997-9000.

[5] PORTELA A，DIGARD P. The influenza virus nucleoprotein： a multifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication [J].The Journal of General Virology，2002，83（Pt 4）：723-734.

[6] RESA-INFANTE P，JORBA N，COLOMA R，et al. The influenza virus RNA synthesis machine：advances in its structure and function [J].RNA Biology，2011，8（2）：207-215.

[7] BOULO S，AKARSU H，RUIGROK R W，et al. Nuclear traffic of influenza virus proteins and ribonucleoprotein complexes[J].Virus Research，2007，124（1/2）：12-21.

[8] CROS J F，PALESE P. Trafficking of viral genomic RNA into and out of the nucleus：influenza，Thogoto and Borna disease viruses[J].Virus Research，2003，95（1-2）：3-12.

[9] HUTCHINSON E C，VON KIRCHBACH J C，GOG J R，et al. Genome packaging in influenza A virus [J].The Journal of General Virology，2010，91（Pt 2）：313-328.

[10] HOENEN T，JUNG S，HERWIG A，et al. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription[J].Virology，2010，403（1）：56-66.

[11] NEUMANN G，HUGHES M T，KAWAOKA Y. Influenza A virus NS2 protein mediates vRNP nuclear export through NES-independent interaction with hCRM1[J].The EMBO Journal，2000，19（24）：6751-6758.

[12] BAUDIN F，PETIT I，WEISSENHORN W，RUIGROK R W，In vitro dissection of the membrane and RNP binding activities of influenza virus M1 protein[J].Virology，2001，281，102-108.

[13] AKARSU H，BURMEISTER W P，PETOSA C，et al. Crystal structure of the M1 protein-binding domain of the influenza A virus nuclear export protein （NEP/NS2）[J].The EMBO Journal，2003，22（18）：4646-4655.

[14] YE Z P，PAL R，F(xiàn)OX J W，et al. Functional and antigenic domains of the matrix （M1） protein of influenza A virus[J].Journal of Virology，1987，61（2）：239-246.

[15] RUIGROK R W，BAUDIN F，PETIT I，et al. Role of influenza virus M1 protein in the viral budding process[J].Int Congr Ser，2001，1219：397-404.

[16] ROSSMAN J S，LAMB R A. Influenza virus assembly and budding[J].Virology，2011，411（2）：229-236.

[17] CALDER L J，WASILEWSKI S，BERRIMAN J A，et al. Structural organization of a filamentous influenza a virus[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（23）：10685-10690.

[18] CHEN B J，LESER G P，MORITA E，et al. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase， but not the matrix protein，are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles[J].Journal of Virology，2007，81（13）：7111-7123.

[19] NOTON S L，MEDCALF E，F(xiàn)ISHER D，et al. Identification of the domains of the influenza A virus M1 matrix protein required for NP binding，oligomerization and incorporation into virions[J].The Journal of General Virology，2007，88（Pt 8）：2280-2290.

[20] ARZT S，BAUDIN F，BARGE A，et al. Combined results from solution studies on intact influenza virus M1 protein and from a new crystal form of its N-terminal domain show that M1 is an elongated monomer[J].Virology，2001，279（2）：439-446.

[21] HARRIS A，F(xiàn)OROUHAR F，QIU S，et al. The crystal structure of the influenza matrix protein M1 at neutral pH：M1-M1 protein interfaces can rotate in the oligomeric structures of M1[J].Virology，2001，289（1）：34-44.

[22] SAFO M K， MUSAYEV F N，MOSIER P D，et al. Crystal structures of influenza A virus matrix protein M1：variations on a theme [J].PLoS One，2014，9（10）：e109510.

[23] SHA， B.，LUO，M. Structure of a bifunctional membrane-RNA binding protein，influenza virus matrix protein M1[J].Nat Struct Biol，1997，4（3）：239-244.

[24] SHISHKOV A，BOGACHEVA E，F(xiàn)EDOROVA N，et al. Spatial structure peculiarities of influenza a virus matrix M1 protein in an acidic solution that simulates the internal lysosomal medium [J].FEBS J，2011，278（24）：4905-4916.

[25] FONTANA J，STEVEN A C.At low pH， influenza virus matrix protein M1 undergoes a conformational change prior to dissociating from the membrane[J].Journal of Virology，2013，87（10）：5621-5628.

[26] ZHANG W，ZHENG W，TOH Y，et al. The crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association[J].PNAS，2017，114（32）：8550-8555.

[27] SHISHKOV A V，GOLDANSKII V I，BARATOVA L A，et al. The in situ spatial arrangement of the influenza A virus matrix protein M1 assessed by tritium bombardment [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，96（14）：7827-7830.